Nghiên cứu loại cafein từ lá chè (camellia sinensis l ) bằng carbon dioxyd siêu tới hạn

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ BẢO NGỌC NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ LÁ CHÈ (Camellia sinensis L.) BẰNG CARBON DIOXYD SIÊU TỚI HẠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ BẢO NGỌC Mã sinh viên: 1301290 NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ LÁ CHÈ (Camellia sinensis L.) BẰNG CARBON DIOXYD SIÊU TỚI HẠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Trần Trọng Biên Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng sâu sắc tới DS Trần Trọng Biên, tổ Chiết Xuất – môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Hân, TS Bùi Thị Thúy Luyện tập thể cán bộ, giảng viên môn Công Nghiệp Dược – Trường đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Và em cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị em người bên em, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu suốt thời gian qua Dù có nhiều cố gắng, song đề tài có thiếu sót Kính mong nhận chia sẻ nhận ý kiến đóng góp quý báu thầy cô giáo Em xin trân trọng cảm ơn Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Lê Thị Bảo Ngọc MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Cây chè 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần 1.1.2.1 Catechin 1.1.2.2 Cafein 1.1.3 Tác dụng sinh học chè 1.2 Phương pháp chiết xuất dung môi CO2 siêu tới hạn 1.2.1 Nguyên tắc 1.2.2 Ưu, nhược điểm phương pháp chiết xuất sCO2 1.2.3 Ứng dụng sCO2 chiết xuất cafein 1.3 Một số phương pháp loại cafein chè 1.3.1 Loại cafein dung môi hữu 1.3.2 Loại cafein nước nóng 10 1.3.3 Loại cafein vi sinh vật 10 1.3.4 Loại cafein dung môi siêu tới hạn 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Chất chuẩn hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp định lượng cafein EGCG chè xanh 15 2.3.2 Phương pháp chiết cafein từ chè xanh CO2 siêu tới hạn 16 2.3.3 Phương pháp chiết cafein từ chè xanh nước ethanol 17 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Xây dựng quy trình định lượng cafein EGCG chè xanh 18 3.1.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng cafein EGCG 18 3.1.1.1 Tính đặc hiệu 18 3.1.1.2 Độ thích hợp hệ thống 19 3.1.1.3 Khoảng tuyến tính 20 3.1.2 Khảo sát quy trình chiết định lượng cafein EGCG chè xanh 21 3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết 21 3.1.2.2 Khảo sát số lần chiết 23 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thông số kỹ thuật đến trình loại cafein CO2 siêu tới hạn 24 3.2.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất 24 3.2.2 Lượng đồng dung môi 26 3.2.3 Kích thước nguyên liệu 27 3.2.4 Áp suất chiết 28 3.2.5 Nhiệt độ chiết 29 3.2.6 Thời gian chiết 30 3.3 So sánh với phương pháp loại cafein khác 32 3.4 Xây dựng quy trình loại cafein từ chè xanh quy mô 200g/mẻ 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ CO2 Carbon dioxyd DĐVN IV Dược Điển Việt Nam IV EC Epicatechin ECG Epicatechin gallat EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin gallat EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) PPO Polyphenol oxidase POD Peroxidase sCO2 Carbon dioxyd siêu tới hạn STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo tt/tt Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu loại cafein từ chè xanh dung môi sCO2 12 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng 14 Bảng 3.1 Kết thời gian lưu diện tích píc dung dịch chuẩn hỗn hợp 19 Bảng 3.2 Mối tương quan diện tích píc nồng độ cafein EGCG 20 Bảng 3.3 Kết khảo sát dung môi chiết xác định hàm lượng cafein EGCG chè xanh 22 Bảng 3.4 Kết khảo sát số lần chiết xác định hàm lượng cafein EGCG chè xanh 23 Bảng 3.5 Ảnh hưởng đồng dung môi đến hiệu suất chiết cafein EGCG 24 Bảng 3.6 Ảnh hưởng lượng đồng dung môi ethanol 96% đến hiệu suất chiết cafein EGCG 26 Bảng 3.7 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết cafein EGCG 27 Bảng 3.8 Ảnh hưởng áp suất đến hiệu suất chiết cafein EGCG 28 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết cafein EGCG 29 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất chiết cafein EGCG 30 Bảng 3.11 Bảng so sánh hiệu suất chiết cafein EGCG sử dụng sCO2, nước ethanol 96% 33 Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết cafein EGCG quy mô 200 g/mẻ 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số loại catechin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo cafein Hình 1.3 Giản đồ pha carbon dioxyd Hình 1.4 Sơ đồ thiết bị chiết xuất dung môi CO2 siêu tới hạn Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu 19 Hình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan diện tích píc nồng độ cafein 21 Hình 3.3 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan diện tích píc nồng độ EGCG 21 Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC nguyên liệu mẫu chè loại cafein sCO2 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Chè Camellia sinensis(L.) Kuntze loài trồng phổ biến giới mang nhiều tác dụng sinh học đáng ý Thành phần chè có lợi cho sức khỏe polyphenol – nhóm hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa bật Trong đó, epigallocatechin gallat (EGCG) thành phần có hàm lượng lớn có tác dụng chống oxy hóa mạnh [19] Ngày nay, polyphenol chè chứng minh có tác dụng phòng chống bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh có tác dụng làm chậm q trình lão hố [16], [46] Tuy nhiên, chè chứa lượng lớn cafein (3 – 5%) sử dụng cafein mức gây nhiều tác dụng không mong muốn hồi hộp, ngủ, rối loạn tiêu hóa, sẩy thai, tăng huyết áp [18], [34] Theo thống kê từ nghiên cứu đưa ra, người bình thường, lượng cafein tiêu thụ khoảng 300 mg ngày coi mức an tồn Do đó, việc nghiên cứu chiết chọn lọc cafein giữ lại tối đa nhóm hoạt chất catechin quan trọng để tạo loại chè cafein tốt cho sức khỏe Gần đây, sử dụng CO2 siêu tới hạn (sCO2) biết đến kỹ thuật đại chiết xuất hợp chất tự nhiên khả chiết chọn lọc, an tồn, kinh tế, khơng tồn dư dung môi áp dụng để loại cafein hạt cà phê, cacao Nhằm ứng dụng phương pháp chiết xuất dung môi siêu tới hạn vào việc tạo sản phẩm chè cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ chè (Camellia sinensis L.) carbon dioxyd siêu tới hạn” thực với mục tiêu: Đánh giá ảnh hưởng số thơng số đến q trình chiết loại cafein chè xanh dung môi CO2 siêu tới hạn Xây dựng quy trình loại cafein từ chè xanh mẻ 200 g CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Cây chè 1.1.1 Đặc điểm thực vật Chè (Trà) Camellia sinensis (L.) Kuntze thuộc họ Chè Theaceae Chè thân gỗ, cao khoảng 10 m Lá chè mọc so le, khơng rụng, hình trái xoan, phiến dày, bóng, mép có nhiều cưa Hoa – cánh, có màu biến đổi từ trắng đến hồng đỏ, mọc đơn độc nách lá, có mùi thơm, nhiều nhị Quả nang thường có ngăn, chứa hạt Hạt khơng có phơi nhũ, mầm lớn, có chứa dầu Bộ phận dùng búp chè non (Folium Theae) [5] Cây chè trồng phổ biến nhiều nước giới, tiêu biểu Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản số nước châu Á Ở nước ta, chè trồng chủ yếu Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Đắk Lắk [5] 1.1.2 Thành phần Thành phần hóa học chè biến đổi phức tạp, phụ thuộc vào giống, điều kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác Trong búp chè có polyphenol (30 – 36%), cafein (3 – 5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khống,… Trong đó, polyphenol (chủ yếu catechin) cafein thành phần quan trọng định hương vị sản phẩm [1] 1.1.2.1 Catechin Catechin tên gọi chung flavonoid mang khung flavan-3-ol thường gặp chè gọi catechin chè xanh, polyphenol chè xanh Trong cấu trúc catechin có C bất đối (C2 C3), dẫn chất có đồng phân nên có 24 catechin khác nhau, nhiên có 12 catechin được phân lập xác định cấu trúc từ chè xanh [1] Về cấu tạo, catechin chia thành nhóm: epicatechin (đồng phân 2R 3R) nonepicatechin (catechin), phân thành catechin tự Ngồi ra, kích thước nhỏ, diện tích bề mặt tiếp xúc dung môi với nguyên liệu tương đối lớn, khiến tăng tốc độ hòa tan dung mơi Như vậy, việc giảm kích thước hạt chè xanh dẫn đến việc tăng hiệu suất chiết xuất cafein catechin, kích thước hạt lớn mang lại tốc độ chiết chậm Lựa chọn kích thước ≤ mm để tiến hành khảo sát thông số Với điều kiện làm ẩm lựa chọn: bột chè kích thước hạt ≤ mm, sử dụng 10 mL đồng dung môi ethanol 96% Tiến hành khảo sát thông số: áp suất, nhiệt độ, thời gian trình chiết xuất sCO2 3.2.4 Áp suất chiết Khả hòa tan tính chọn lọc dung mơi siêu tới hạn thay đổi theo áp suất nhiệt độ Do vậy, tiến hành khảo sát chiết xuất áp suất chiết khác với mục đích tìm áp suất chiết tối ưu mà tính chọn lọc sCO2 với cafein cao Tiến hành chiết xuất sCO2 áp suất: 100 ± 10 bar, 200 ± 10 bar, 300 ± 10 bar, 400 ± 10 bar Phân tích hàm lượng cafein EGCG sản phẩm thu theo mục 2.3.1 Kết thu sau: Bảng 3.8 Ảnh hưởng áp suất đến hiệu suất chiết cafein EGCG Điều kiện chiết xuất Hiệu suất chiết (%) Áp suất Nhiệt độ Thời gian (bar) (°C) (giờ) 100 50 200 Hệ số chiết Cafein EGCG chọn lọc 15,93 10,87 1,47 50 16,00 10,32 1,55 300 50 49,23 26,29 1,87 400 50 49,04 27,64 1,77 Nhận xét Tăng áp suất chiết từ 100 đến 300 bar, hiệu suất chiết cafein tăng mạnh từ 15,93 lên 49,23% hiệu suất chiết EGCG tăng từ 10,87 lên 26,29% Xu hướng ghi nhận nghiên cứu Park [36] Kim [24], nghiên 28 cứu đưa lời giải thích sau: tăng áp suất làm tăng mật độ sCO2, khả hòa tan dung môi tăng hiệu suất chiết tăng Kết cho thấy hệ số chiết chọn lọc (cafein/EGCG) tăng nhẹ từ 1,50 lên 1,87 áp suất tăng từ 100 lên 300 bar Tuy nhiên, áp suất 400 bar, hiệu suất chiết cafein thay đổi không đáng kể hiệu suất chiết EGCG tăng nhẹ Thực thí nghiệm áp suất 300 bar có hiệu suất chiết cafein hệ số chọn lọc lớn Vì vậy, áp suất 300 bar lựa chọn để khảo sát thông số 3.2.5 Nhiệt độ chiết Nhằm tối ưu hóa quy trình loại cafein từ chè xanh dung môi CO2 siêu tới hạn, với áp suất lựa chọn, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất Các mức nhiệt độ khảo sát: 50°C, 60°C, 70°C Kết thu sau: Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết cafein EGCG Điều kiện chiết xuất Hiệu suất chiết (%) Áp suất Nhiệt độ Thời gian (bar) (°C) (giờ) 300 50 300 300 Hệ số chiết Cafein EGCG chọn lọc 49,23 26,29 1,87 60 52,83 22,89 2,31 70 53,00 23,29 2,27 Nhận xét Trong khoảng nhiệt độ khảo sát từ 50 – 70oC, hiệu suất chiết cafein tăng nhẹ đồng thời nhiệt độ ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất chiết EGCG Trong nghiên cứu khả hòa tan hoạt chất sCO2 [22] cho thấy điểm áp suất thấp (200 bar) khơng có ảnh hưởng nhiều nhiệt độ lên độ hòa tan sCO2, tăng nhiệt độ, tỷ trọng sCO2 giảm đáng kể áp suất khuếch tán dung môi tăng Tuy nhiên, áp suất chiết xuất cao hơn, độ hòa tan tăng lên với nhiệt độ tăng, lúc này, ảnh hưởng áp suất chiếm ưu Mặt khác, cafein thăng hoa 178oC 29 EGCG khơng thăng hoa, suy luận áp suất cafein tăng yếu tố thay đổi EGCG tăng nhiệt độ Điều dẫn đến tăng độ tan cafein hỗn hợp sCO2/đồng dung môi độ tan EGCG thay đổi Trong đó, hệ số chiết chọn lọc tăng theo thứ tự chiết nhiệt độ 50°C < chiết nhiệt độ 70°C < chiết nhiệt độ 60°C (1,87 < 2,27