Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế steviosid và rebaudiosid a từ cây cỏ ngọt stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm

Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN KIM ĐÔNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM NĂM 2016 i Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu đề tài trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả đề tài Ký tên Nguyễn Kim Đông ii Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu để sản xuất steviosid rebaudiosid A có độ tinh khiết cao, chiết xuất từ làm chất tạo cho thực phẩm dược phẩm Lá Cỏ Ngọt sấy khô nghiền nhỏ thành bột, bột Cỏ Ngọt chiết xuất nước, dịch chiết kiềm hóa canxi hydroxit sau sắt (III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu làm bay dịch lọc đến khô thu hỗn hợp glycosid thô Hỗn hợp glycosid thô tiến hành phân lập tinh steviosid rebaudiosid A cách sử dụng metanol, etanol để kết tủa, thu steviosid rebaudiosid A có độ tinh khiết cao Tỷ lệ thích hợp bột Cỏ Ngọt nước trình chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v Nhiệt độ thời gian chiết xuất tốt 75oC 240 phút 100oC 30 phút Sự phân lập tinh steviosid từ hỗn hợp glycosid thô tiến hành cách sử dụng metanol để kết tủa Tỷ lệ hỗn hợp glycosid thô metanol 1:2 đến 1:7 w/v, tốt 1:5, hàm lượng steviosid thu khoảng 91,1-91,5% Sự phân lập tinh rebaudiosid A tiến hành cách sử dụng etanol để kết tủa Tỷ lệ xirô etanol 1:2 đến 1:7 w/v, tốt 1:5 Rebaudiosid A với 90,7-90,9% độ tinh khiết thu Steviosid rebaudiosid A hai chất tạo không sinh lượng, không đắng, áp dụng thực phẩm dược phẩm Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập iii Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô ABSTRACT The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in food and drugs Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron chloride, desalting, decolorizing, and evaporating the filtrate to drynessobtained glycoside The mixture of glycosides, conducting isolation and purification of stevioside and rebaudioside A were developed using methanol, alcoholic precipitation.The highly purified stevioside and rebaudioside A were obtained.The preferable ratio of leaves to water is within the limits of about 1:20 to 1:25, wt/vol.The extraction temperature and time preferably were at 75oC for 240 and and 100oC for 30min The isolation and purification of Stevioside was developed using methanol precipitation The proportion of glycosides and methanol was between 1:21:7 w/v, preferably 1:5, the powder contents were around 91.1-91.5% of stevioside The isolation and purification of rebaudioside A was developed using ethanol precipitation The proportion of syrup and ethanol was between 1:2-1:7 w/v, preferably 1:5 Rebaudioside A with 90.7- 90.9% purity was obtained Steviosid and rebaudiosid A are two sweeteners non-calorie, noncariogenic, non-bitter, applied in foods and drugs Keywords: Stevia rebaudiana, extracts, stevioside, rebaudioside A, purification, isolation iv Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT .iii MỤC LỤC v DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH BẢNG .viii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử Cỏ Ngọt 2.2 Đặc điểm, tính vị công dụng Cỏ Ngọt 2.3 Thành phần hóa học cỏ 2.4 Hoạt tính sinh học 2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 11 CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm 15 3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn 15 v Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 15 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16 3.2.2 Thiết kế thí nghiệm 16 3.2.3 Thời gian thực đề tài 16 3.2.4 Bố trí thí nghiệm 16 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết khảo sát tỷ lệ chiết nước nguyên liệu trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 24 4.2 Kết khảo sát thời gian nhiệt độ trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 26 4.3 Kết phân lập tinh hai loại chất tạo steviosid rebaudiosid A 27 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ 39 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ 40 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 50 PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ REBAUDIOSIDA 54 vi Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô DANH SÁCH HÌNH Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt Error! Bookmark not defined Hình 2.3 Công thức hóa học steviosid, thành phần tìm thấy Cỏ Ngọtvà số thành phần khác có liên quan Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nước thích hợp trình chiết 17 Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thời gian thích hợp trình chiết 19 Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh steviosid rebaudiosid A 22 Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết nước nguyên liệu 25 Hình 4.2 Khảo sát thời gian nhiệt độ trình ly trích 26 Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid 28 Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid 29 Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A 33 Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A 31 Hình Lá Cỏ Ngọt 50 Hình Cột Amberlite 50 Hình Dịch sau qua Amberlite 51 Hình Bếp cách thủy 51 Hình Hỗn hợp glucosid 52 Hình Steviosid…………………………………………………………… 52 vii Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ…………………………………………… 53 Hình Dung dịch Cỏ Ngọt………………………………………………… 53 Hình Quy trình phân lập, tinh steviosid rebaudiosidA 54 DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.3 Cấu trúc dẫn xuất steviosid hợp chất liên quan Cỏ Ngọtvà độ so với đường sucrose Bảng 4.3.1 Kết phân lập tinh steviosid 32 Bảng 4.3.2 Kết phân lập tinh rebaudiosid A 32 viii Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT HPLC sắc ký lỏng hiệu cao µm micromet mg/L milligram lít mL millilit nm nanomet % (v/v) phần trăm thể tích thể tích RT thời gian lưu UV – Vis đầu dò tử ngoại khả kiến RPF lưu lượng huyết tương qua thận GFR tăng tốc độ lọc cầu thận LC-MS sắc ký lỏng khối phổ ix Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày giới, người tiêu thụ lượng đường đáng kể Tuy nhiên mặt lợi đường có mặt trái cung cấp nhiều lượng nên gây béo phì, cho dù liều lượng sử dụng không đáng kể Vì để tránh béo phì, tiểu đường người ta buộc phải dùng đường lại hay dùng chất tạo khác để thay Hiện nay, thị trường có nhiều sản phẩm hoá học tạo vị dùng để thay đường saccharin, sodium cyclamate, sucrolose, acefulfame potassium phổ biến chất aspartame Mặc dù loại đường rẻ tiền tiện dụng người ta e ngại sử dụng chúng gây ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ người lâu dài Qua số nghiên cứu cho thấy saccharin gây ung thư bàng quang chuột Vì saccharin bị cấm sử dụng số quốc gia Trước nguy hại đường hoá học, tâm lý chung người tiêu dùng muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam Mỹ, Cỏ Ngọt có chứa chất tự nhiên steviosid (4-13% trọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1– 2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E dulcosid A (0,4–0,7%) (Kinghorn et al., 1991).Trong độ rebaudiosid A gấp 250 – 450 lần so với đường mía steviosid khoảng 300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986) Chất tạo chứa Cỏ Ngọt loại chất tạo không sinh lượng Ngoài ra, chất tạo Cỏ Ngọt điều trị bệnh tiểu đường, hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp (Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm (Ghosh et al., 2008) Đặc biệt Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo steviosid rebaudiosid A với độ cao chiếm hàm lượng lớn nhất.Từ Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ Kết thống kê khảo sát tỷ lệ bột Cỏ Ngọt nước Descriptives Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound 1:6 063767 0004163 0002404 062732 064801 0633 0641 1:9 096633 0020551 0011865 091528 101738 0953 0990 1:15 151200 0039000 0022517 141512 160888 1473 1551 1:20 183567 0033975 0019616 175127 192007 1798 1864 1:25 183600 0034699 0020033 174980 192220 1796 1858 Total 15 135753 0497607 0128482 108197 163310 0633 1864 Test of Homogeneity of Variances Hamluongduong Levene Statistic df1 df2 Sig 1.689 10 228 40 Upper Bound Minimum Maximum Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô ANOVA Hamluongduong Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 035 009 1.001E3 000 Within Groups 000 10 000 Total 035 14 Post Hoc Tests Subset for alpha = 0.05 Nghiem a Duncan thuc N 1:6 063767 1:9 1:15 1:20 183567 1:25 183600 Sig 096633 151200 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 41 1.000 989 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Kết thống kê khảo sát thời gian nhiệt độ trình ly trích Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean Std Upper N Mean Deviation Std Error Lower Bound Bound Minimum Maximum 45C,30p 156233 0009609 0005548 153846 158620 1552 1571 45C,60p 161567 0012503 0007219 158461 164673 1603 1628 45C,120p 164333 0013650 0007881 160942 167724 1631 1658 45C,240p 167900 0016523 0009539 163796 172004 1663 1696 75C,30p 171700 0051176 0029547 158987 184413 1675 1774 75C,60p 176500 0026889 0015524 169820 183180 1748 1796 75C,120p 173100 0023643 0013650 167227 178973 1706 1753 75C,240p 189333 0061330 0035409 174098 204568 1854 1964 10C,30p 161067 0005686 0003283 159654 162479 1606 1617 10C,60p 153167 0003512 0002028 152294 154039 1528 1535 10C,120p 158800 0007211 0004163 157009 160591 1582 1596 10C,240p 159267 0001528 0000882 158887 159646 1591 1594 100C,30p 184667 0040415 0023333 174627 194706 1810 1890 100C,60p 144567 0030892 0017836 136893 152241 1410 1464 100C,120p 064867 0017616 0010171 060491 069243 0629 0663 100C,240p 116433 0130470 0075327 084023 148844 1014 1248 Total 48 156469 0292170 0042171 147985 164952 0629 1964 42 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig 7.745 15 32 000 ANOVA Hamluongduong Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 040 15 003 148.610 000 Within Groups 001 32 000 Total 040 47 43 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Subset for alpha = 0.05 a Duncan Nghiemthuc N 100C,120p 064867 100C,240p 100C,60p 10C,60p 153167 45C,30p 156233 156233 10C,120p 158800 158800 158800 10C,240p 159267 159267 159267 10C,30p 161067 161067 161067 45C,60p 161567 161567 161567 45C,120p 164333 164333 45C,240p 75C,30p 171700 171700 75C,120p 173100 173100 75C,60p 100C,30p 184667 75C,240p 189333 Sig 10 116433 144567 167900 167900 176500 1.000 1.000 1.000 114 44 176 160 077 163 197 184 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hamluongduong 95% Confidence Interval for Mean Std Upper N Mean Deviation Std Error Lower Bound Bound Minimum Maximum 45C,30p 156233 0009609 0005548 153846 158620 1552 1571 45C,60p 161567 0012503 0007219 158461 164673 1603 1628 45C,120p 164333 0013650 0007881 160942 167724 1631 1658 45C,240p 167900 0016523 0009539 163796 172004 1663 1696 75C,30p 171700 0051176 0029547 158987 184413 1675 1774 75C,60p 176500 0026889 0015524 169820 183180 1748 1796 75C,120p 173100 0023643 0013650 167227 178973 1706 1753 75C,240p 189333 0061330 0035409 174098 204568 1854 1964 10C,30p 161067 0005686 0003283 159654 162479 1606 1617 10C,60p 153167 0003512 0002028 152294 154039 1528 1535 10C,120p 158800 0007211 0004163 157009 160591 1582 1596 10C,240p 159267 0001528 0000882 158887 159646 1591 1594 100C,30p 184667 0040415 0023333 174627 194706 1810 1890 100C,60p 144567 0030892 0017836 136893 152241 1410 1464 100C,120p 064867 0017616 0010171 060491 069243 0629 0663 100C,240p 116433 0130470 0075327 084023 148844 1014 1248 45 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Kết thống kê phân lập tinh rebaudiosid A Descriptives hamluong 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1:2 88.467 0577 0333 88.323 88.610 88.4 88.5 1:3 90.467 0577 0333 90.323 90.610 90.4 90.5 1:4 90.600 0000 0000 90.600 90.600 90.6 90.6 1:5 90.800 1000 0577 90.552 91.048 90.7 90.9 1:6 90.733 1155 0667 90.446 91.020 90.6 90.8 1:7 90.833 0577 0333 90.690 90.977 90.8 90.9 Total 18 90.317 8631 2034 89.887 90.746 88.4 90.9 Test of Homogeneity of Variances hamluong Levene Statistic df1 df2 Sig 2.650 12 077 ANOVA hamluong Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 12.598 2.520 453.540 000 Within Groups 067 12 006 Total 12.665 17 46 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Subset for alpha = 0.05 a Duncan nghiemthuc N 1:2 88.467 1:3 1:4 1:6 90.733 1:5 90.800 1:7 90.833 Sig 90.467 90.600 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 47 1.000 143 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Kết thống kê phân lập tinh steviosid Descriptives Stevioside 95% Confidence Interval for Mean Std Lower Upper N Mean Deviation Std Error Bound Bound Minimum Maximum 1:2 74.333 1528 0882 73.954 74.713 74.2 74.5 1:3 74.733 0577 0333 74.590 74.877 74.7 74.8 1:4 80.767 1528 0882 80.387 81.146 80.6 80.9 1:5 91.300 2000 1155 90.803 91.797 91.1 91.5 1:6 91.233 1528 0882 90.854 91.613 91.1 91.4 1:7 91.450 0707 0500 90.815 92.085 91.4 91.5 Total 17 83.529 7.8804 1.9113 79.478 87.581 74.2 91.5 Test of Homogeneity of Variances Stevioside Levene Statistic df1 df2 Sig .721 11 622 ANOVA Stevioside Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 993.384 198.677 9.434E3 000 Within Groups 232 11 021 Total 993.615 16 48 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Stevioside Subset for alpha = 0.05 nghiemt a Duncan hu N 1:2 74.333 1:3 1:4 1:6 91.233 1:5 91.300 1:7 91.450 Sig 74.733 80.767 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 49 1.000 122 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình Lá Cỏ Ngọt Hình Cột Amberlite 50 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình Dịch sau qua Amberlite Hình Bếp cách thủy 51 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình Hỗn hợp glucosid Hình Steviosid 52 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô Hình Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ Hình Dung dịch Cỏ Ngọt 53 Đề tài cấp trường 2014 – 2015 Trường Đại học Tây Đô PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ REBAUDIOSIDA Bột Cỏ Ngọt + Thêm nước 1:20 đến 1:25 w/v + Đun cách thủy 75oC 240 phút 100oC 30 phút + Lọc Bả Dịch lọc + Ca (OH) + FeCl3 +Lọc Tủa Dịch lọc + Cho qua cột Amberlite + Sấy Glucosid thô +Thêm methanol Tỷ lệ 1:5 Steviosid + Sấy Rắn Dịch lọc +Sấy Xirô +Hòa tan vào nước +Lọc polysulfon +Sấy Xirô +Cồn (96o) Tỷ lệ 1:5 +Lọc Rắn +Sấy Rebaudiosid A Hình Quy trình phân lập, tinh steviosid rebaudiosidA 54 ... cần thiết Xuất phát từ thực tế này, Nghiên cứu chiết xuất tinh steviosid rebaudiosid A từ Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) làm chất tạo thực phẩm dược phẩm thực nhằm góp phần nâng cao chất lượng... Mục đích nghiên cứu để sản xuất steviosid rebaudiosid A có độ tinh khiết cao, chiết xuất từ làm chất tạo cho thực phẩm dược phẩm Lá Cỏ Ngọt sấy khô nghiền nhỏ thành bột, bột Cỏ Ngọt chiết xuất nước,... sản phẩm chất tạo tự nhiên, đặc biệt hai loại chất tạo steviosid rebaudiosid A Do việc ly trích tinh để có hai loại chất tạo steviosid rebaudiosid A với độ cao, an toàn cho thực phẩm dược phẩm