Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI QUÁCH NGỌC LUYẾN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA OFLOXACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI QUÁCH NGỌC LUYẾN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA OFLOXACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 73 15 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh TS Ph Thị Thanh Hà HÀ NỘI - 2011 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc nhất, e xin đƣợc gửi lời c ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Ph m Thị Thanh Hà, ln tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, ch thực đề tài, để e động viên em suốt trình c thể h àn thành đƣợc Em xin trân thành c n luận văn ơn thầy cô, cán ộ thuật vi n t i phịng thí nghiệm trung tâm - Trƣờng đ i học Dƣợc Hà Nội hỗ trợ em nhiều tr ng uá trình thực nghiệ C ng xin gửi lời c v a ua ơn tới DS V Thị Minh Quỳnh toàn thể đồng nghiệp Công ty TNHH MTV Dƣợc Khoa-Trƣờng đ i học Dƣợc Hà Nội, t điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập cơng tác; động viên chia sẻ kinh nghiệm quý giá cho suốt thời gian qua Cuối xin đƣợc gửi lời c thân y u ln ơn đến gia đình, n , ngƣời n c nh giúp đỡ, động vi n chia sẻ h tơi h àn thành đƣợc b n luận văn Xin trân thành c ơn! Hà Nội, tháng 12/2011 DS Quách Ngọc Luyến hăn để CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ∆C Nồng độ thêm BDS Base deactivated silica CE Điện di mao qu n-Capillary electrophoresis DAD Diode array detector DEX Dextrofloxacin ĐK Đăng ý HPLC Sắc ký lỏng hiệu ca -High performance liquid chromatography IR Phổ hấp thụ hồng ngo i-Infrared LC/MS Sắc ký lỏng khối phổ-Liquid chromatography/Mass spectrometry LEV Levofloxacin LOD Giới h n phát hiện-Limit of detection LOQ Giới h n định lƣợng -Limit of quantitation MeOH Methanol OFL Ofloxacin RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối-Relative standard deviation Sd Độ lệch chuẩn-Standard deviation TB Trung bình UV – VIS Tử ngo i – kh kiến (Ultra violet – Visible) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1.VÀI NÉT VỀ OFLOXACIN VÀ LEVOFLOXACIN ……………………… 1.1.1 Công thức cấu t o tính chất ofloxacin … ………………………… 1.1.2 Cơng thức cấu t o tính chất levofloxacin ………………………… 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý ofloxacin…………………………………… 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý levofloxacin …………………………………… 1.1.5 Một số phƣơng pháp iểm nghiệm ofloxacin…………………………… 10 1.1.6 Một số nghiên cứu tách định lƣợng lev fl xacin …………………… 10 1.2 VÀI NÉT VỀ ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC …………………………… 13 1.3 PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ………………… 14 1.3.1 Khái niệ ………………………………………………………… ……… 14 1.3.2 Nguyên tắc trình sắc ký … … ………………………………… 15 1.3.3 Cấu t o máy HPLC…… …………… ……………… ………………… 16 1.3.4 Các thông số đặc trƣng trình sắc ký…………… ………………… 16 Ứng dụng HPLC……… ……………………… …………………… 18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 21 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ …………………………………… 21 2.1.1 Máy móc, thiết bị ………………………………………………………… 21 2.1.2 Hóa chất …………… 21 ………………………………………………… 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………… ………………… 22 2.2.1 Kh o sát lựa chọn điều kiện phân tích …………… …………… 22 2.2.2 Thẩ định phƣơng pháp phân tích …………………………………… 23 2.2.3 Ứng dụng………………………………………………………………… 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………… 26 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, …………………… …………… 31 3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ …………………… 31 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ………………… ……… 39 Độ phù hợp hệ thống sắc ký ………………………………………… 39 3.2.2 Tính chọn lọc ……………………………………… 40 3.2.3 Kho ng nồng độ tuyến tính……………………………………………… 42 Độ xác phƣơng pháp………………………………………… 43 Độ phƣơng pháp……………………………………………… 45 3.3 ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP…………………………………… 43 CHƢƠNG BÀN LUẬN…………………………………………………… 46 KẾT LUẬN…………………………………………………………… 53 ĐỀ XUẤT………………………………………………………… 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG LEVOFLOXACIN PHỤ LỤC 2: CÁC SẮC KÝ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 3.1 Một số nghiên cứu để tách định lƣợng levofloxacin ofloxacin Ảnh hƣởng lo i acid a in đến kh tách đồng phân ofloxacin 3.2 Kết qu đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc ký 37 3.3 Kết qu đáp ứng diện tích pic theo nồng độ levofloxacin 39 3.4 Kết qu kh sát độ xác (trong ngày) 40 3.5 Kết qu kh sát độ xác (khác ngày) 41 3.6 Kết qu đánh giá thống tích 3.7 Kết qu kh 3.8 Kết qu định tính, định lƣợng levofloxacin số thuốc thị trƣờng 1.1 độ lặp l i phƣơng pháp phân sát độ phƣơng pháp 11 31 42 43 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Cơ chế t phức fl xacin với tác nhân 12 1.2 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng uan diện tích pic nồng độ 20 3.1 Sắc ý đồ ofloxacin với ion kim lo i Zn2+ 28 3.2 Sắc ý đồ ofloxacin với ion kim lo i Al3+ 29 3.3 Sắc ý đồ ofloxacin với ion kim lo i Cu2+ 29 3.4 Sắc ý đồ ofloxacin với chất t o phức L-leucin 30 3.5 Sắc ý đồ ofloxacin với chất t o phức L-lysin 30 3.6 Sắc ý đồ ofloxacin tách ct Hypersil C18 BDS (4,6ì250mm,5àm) 32 3.7 Sc ý ca ofloxacin tỏch bng ct Zorbax C18 (3ì150mm; 3,5àm) 32 3.8 Sắc ý đồ ofloxacin tách cột Phenomenex C18 (250ì4,6mm;5àm) 33 3.9 Sc ý ỏnh giỏ tớnh chọn lọc phƣơng pháp 38 3.10 Đồ thị biểu diễn tƣơng uan diện tích pic nồng độ levofloxacin 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc sử dụng đơn đồng phân d ng chế phẩm thuốc thay cho d ng hỗn hợp race ic c xu hƣớng phát triển m nh nhằ tăng hiệu qu điều trị đồng thời gi m tác dụng không mong muốn Tuy nhiên, đồng phân có b n chất hoá học giống nhau, việc phân biệt chúng gặp nhiều h hăn d thuật tách đồng phân h n chế Ofloxacin kháng sinh quinolon hệ 2, có carbon bất đối vị trí C3 nên có cặp đồng phân đối quang (S)-ofloxacin (levofloxacin) (R)-ofloxacin (dextrofloxacin) Ofloxacin lƣu hành tr n thị trƣờng c dƣới d ng đơn thành phần levofloxacin d ng hỗn hợp racemic Ngày nhiều chế phẩm chứa d ng đơn đồng phân levofloxacin đƣợc đƣa sử dụng hiệu lực kháng khuẩn n đƣợc chứng minh m nh gấp 8-128 lần so với d ng R-ofloxacin (dextrofloxacin) [12] Trên giới, việc xác định d ng đơn đồng phân đƣợc ý có nhiều nghiên cứu lĩnh vực Đối với fl xacin, c ột số nghiên cứu nƣớc ng ài để tách định tính định lƣợng đồng phân quang học [10],[17],[24],[25] Nhƣng Việt Nam, ch có số nghiên cứu tách xác định đơn đồng phân quang học đƣợc triển khai Nă 2010, có nghiên cứu tách đồng phân ofloxacin triển khai phƣơng pháp CE (Capillary electrophoresis) đƣợc công bố [8] Hiện nay, định tính định lƣợng levofloxacin chủ yếu theo tiêu chuẩn sở, nhƣng chƣa thuận tiện hơng định tính định lƣợng đƣợc đồng thời, ph i chiết tách lấy lƣợng ho t chất lớn thuốc nhỏ mắt để xác định mặt định tính, cịn định lƣợng tiến hành phép phân tích riêng Nhằm góp phần xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng đồng thời đồng phân levofloxacin cách nhanh chóng, xác hiệu qu , tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích đồng phân đối quang ofloxacin sắc ký lỏng hiệu cao” với hai mục tiêu sau: + Xây dựng phƣơng pháp tách đồng phân đối quang ofloxacin nhằ định tính, định lƣợng d ng đồng phân S-ofloxacin (levofloxacin) + Đánh giá chất lƣợng số thuốc lƣu hành tr n thị trƣờng có chứa đơn đồng phân levofloxacin 10 Bảng 3.8 Kết định tính, định lượng levofloxacin số thuốc thị trường Mẫu thử tR pic (phút) tR chuẩn Hà lƣợng LEV LEV (phút) so với lƣợng ghi nhãn (%) Tavanic mg/ml 16,6 Levocef 500 mg 16,7 Choncylox 500mg 17,3 Levoquin 5mg/ml 16,2 Lecinflox 5mg/ml 16,6 Levotab 500mg 16,7 Sonlexim 500mg 17,4 17,0 93,9 Cravit 5mg/ml 15,6 16,0 101,4 17,1 - Ofloxacin 0,3% 16,4 17,1 97,3 99,6 99,4 98,3 16,0 101,5 99,9 tR pic tR pic LEV DEX (phút) (phút) 17,0 19,0 “-’’ Không tiến hành Kết qu b ng 3.8 cho thấy, thời gian lƣu LEV dung dịch thử tƣơng ứng với thời gian lƣu LEV dung dịch chuẩn thuốc đe định lƣợng đ t yêu cầu hà lƣợng (90% - 110%) Kết qu định tính levofloxacin thuốc nhỏ mắt ofloxacin góp phần việc phát chế phẩm thuốc levofloxacin gi thị trƣờng mà thành phần chứa hỗn hợp racemic ofloxacin 56 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN Về phương pháp sử dụng HPLC Tr ng phân tích, CE HPLC phƣơng pháp thƣờng sử dụng để tách đồng phân quang học Trên giới c ột số nghiên cứu tách đồng phân ofloxacin nhƣ: tách đồng phân ofloxacin điện di mao qu n dùng chất chọn lọc carboxymethyl-β-cyclodextrin [13], HPLC detector huỳnh quang dùng chất chọn lọc L-isoleucin kết hợp ion Cu2+ [10], HPLC detector UV dùng chất chọn lọc L-isoleucin kết hợp ion Cu2+[24], HPLC detector UV dùng chất chọn lọc L-phenylalanyl kết hợp ion Cu2+ [25], HPLC detector UV dùng chất chọn lọc L-leucinamide t o dẫn xuất với diphenylphosphinyl chloride [17] … Ở Việt Nam, tác gi Nguyễn Thị Tuyết Minh c ột nghiên cứu tách đồng phân OFL CE [8], nhiên thiết bị CE chƣa thông dụng t i sở kiểm nghiệm Việt Nam Vì chúng tơi lựa chọn phƣơng pháp c tính h thi cao, ứng dụng rộng rãi thực tế kiểm nghiệm phƣơng pháp sử dụng HPLC với detetor UV Tr ng phƣơng pháp sử dụng HPLC, sử dụng cột pha tĩnh c gắn chất chọn lọc đối uang để tách hỗn hợp racemic, nhiên cột pha tĩnh tƣơng đối đắt, lo i cột thƣờng gắn lo i chất chọn lọc đồng phân nên ch thích hợp tách đƣợc số chất định Phƣơng pháp dùng cột pha tĩnh thông thƣờng với pha động chứa chất chọn lọc đối quang mà nghiên cứu v a đơn gi n l i hiệu qu , thuận tiện tr ng phân tích nhiều chế phẩm chứa levofloxacin Trong nghiên cứu trƣớc, Bing Shao, Minglei Tian cộng sự, có kh o sát việc sử dụng số acid amin kết hợp với Cu2+ thành phần pha động làm chất chọn lọc đối quang [10],[24],[25], nhiên dựa thực tế hóa chất thiết bị phịng thí nghiệm nên tiến hành kh o sát thêm số acid a in để c sở dễ dàng việc chọn lựa lo i 57 chất chọn lọc đối quang tiến hành phân tích Chúng tơi lựa chọn pha động chứa L-leucin Cu2+ để tiến hành nghiên cứu tồn diện t xây dựng quy trình phân tích, thẩ định phƣơng pháp ứng dụng thực tế với đối tƣợng mẫu khác Kết qu cho thấy phƣơng pháp c tính h thi cao, kinh tế Về việc lựa chọn điều kiện phân tích Dựa vào tài liệu tham kh o, thực tế hóa chất-máy móc thiết bị t i sở, nguyên tắc để lựa chọn ion kim lo i, selector nồng độ chất phân tích để nồng độ ion kim lo i, selector không th a dẫn đến lãng phí ổn định pha động Hầu hết nghiên cứu trƣớc, tr ng tách đồng phân đối quang cách sử dụng chất chọn lọc đối quang, tr ng pha động sử dụng nồng độ chất t o phức tƣơng đối lớn kho ng kh o sát dài (nồng độ acid amin t 0,0 – 3,0 mmol/l [25], nồng độ ion kim lo i t 0,3 – 6,0 mmol/l [24]), nồng độ chất phân tích OFL nhỏ (kho ng 1µg/ml[10]; 0,0008 - 0,5mg/ml [24],[25]) Dựa thực tế đ , để gi m việc sử dụng thuốc thử, tăng h t o phức tách đồng phân đối uang, đ m b o chất phân tích kết hợp hồn tồn với chất chọn lọc đối quang, không gây th a chất phân tích chất chọn lọc đối quang làm gi độ xác phƣơng pháp, lựa chọn kh o sát nồng độ chất phối tử L-leucin t 1,0 – 3,0 mmol/l; nồng độ Cu2+ t 0,4 – 0,8 mmol/l nồng độ OFL t 0,01 – 0,1 g/ l để tiến hành phân tích Về thẩm định phương pháp phân tích Chúng tơi tiến hành thẩ định ch tiêu tính chọn lọc, độ đúng, độ xác, kho ng tuyến tính, kết qu đ t the uy định; so với nghiên cứu trƣớc, ch tiêu kho ng tuyến tính có hệ số tƣơng uan tƣơng đồng (đều 0,9995) [20],[21]; độ xác ngày khác ngày có RSD 58 0,49% 1,41% thấp s với nghiên cứu trƣớc (4,25% 5,14%[24] ; 2,9% 3,4%[25]) Kết qu c ng ch thấy phƣơng pháp ch thời gian phân tích gi Trong thẩ đáng ể (thời gian lƣu gi m t 2-4 phút)[24],[25] định phƣơng pháp phân tích, khơng tiến hành thẩ định ch ti u LOD LOQ phƣơng pháp dùng để định tính định lƣợng chế phẩm có lƣợng ho t chất lớn (viên nén chứa levofloxacin 250mg, 500mg, thuốc nhỏ mắt chứa levofloxacin 5mg/ml) Trong thẩ định tính chọn lọc, mẫu trắng mẫu tƣơng tự nhƣ ẫu thử nhƣng hông chứa thành phần ho t chất nghiên cứu mẫu trắng thƣờng đƣợc tự t o để tr ng đ c chứa thành phần tá dƣợc mẫu đe thử Tuy nhiên ph m vi nghiên cứu đề tài, thành phần mẫu Cravit để thẩ định tính chọn lọc, chứa tá dƣợc khơng hấp thụ UV ƣớc sóng nghiên cứu 293 nm (benzalkonium cloride, acid hydrocloride, natri hydroxyd, crospovidone, methylhydroxypropyl, stearyl fumarat ), sử dụng mẫu trắng dung môi pha mẫu (pha động) để tiến hành thẩm định tính chọn lọc mà cho kết qu có tính khách quan So với phƣơng pháp CE [8], phƣơng pháp HPLC mà sử dụng có ƣu điể hơng thơng dụng thiết bị phịng thí nghiệm, mà so sánh kết qu thẩ định phƣơng pháp phân tích nhận thấy: độ phân gi i, hệ số tƣơng uan độ lặp l i tốt hơn, t lệ tìm l i ca (tr ng phƣơng pháp sử dụng CE, hệ số phân gi i 2,69; hệ số tƣơng uan 0,9957; độ tìm l i t 98,5 đến 101,7% ; với phƣơng pháp đƣợc xây dựng đƣợc: hệ số phân gi i 2,9; hệ số tƣơng uan 0,9995; t lệ tìm l i t 99,8 đến 101,0%) 4.Về ứng dụng phương pháp Số lƣợng thành phẩm chứa đơn đồng phân levofloxacin thị trƣờng chiếm tỷ lệ ngày cao, bao gồm c chế phẩ 59 đƣợc s n xuất tr ng nƣớc chế phẩm nhập t nƣớc ngoài, với nhiều d ng bào chế khác Tuy nhiên, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm mà nhà s n xuất đƣa đăng ý, đƣợc chấp nhận nhƣng chƣa thực thuận tiện thực tế s n xuất với quy mô công nghiệp, ph i chiết tách lấy lƣợng ho t chất lớn để định tính phƣơng pháp ri ng lẻ nhƣ đ g c uay cực riêng, quang phổ tử ngo i hồng ngo i … định lƣợng l i tiến hành phép thử khác Phƣơng pháp chúng tơi đƣa giúp định tính định lƣợng đồng thời đơn đồng phân levofloxacin cách đơn gi n, nhanh chóng, hiệu qu chi phí khơng cao Phƣơng pháp c thể áp dụng để định tính định lƣợng đồng thời levofloxacin nhiều lo i chế phẩm thị trƣờng bao gồm thuốc viên, thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm truyền Cụ thể định tính định lƣợng đƣợc levofloxacin số chế phẩ nhƣ thuốc nhỏ mắt Cravid, Levoquin, Lecinflox, số thuốc vi n nén nhƣ Ch ncyl x, S nlexi , Lev cef, Levotab, dung dịch tiêm truyền nhƣ Tavanic Dựa vào kh tách đồng phân đối quang fl xacin, phƣơng pháp đƣợc sử dụng việc phát thuốc levofloxacin gi với thành phần thực tế hỗn hợp racemic ofloxacin 60 KẾT LUẬN Qua trình thực đề tài, đƣa ột số kết luận: Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp tách đồng phân đối quang ofloxacin nhằm định tính định lƣợng levofloxacin, cụ thể là: - Đã xây dựng điều kiện sắc ký nhƣ sau: + Cột Phenomenex C18 (250ì4,6mm, 5àm) + Pha ng gm: 14% MeOH 86% pha nƣớc (pha động chứa 0,6mmol/l CuSO4 2mmol/l L-leucin) + Thể tích tiêm mẫu: 5µl + Tốc độ dịng: 0,9ml/phút + Bƣớc sóng phân tích: 293nm + Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml Với điều kiện sắc ký tƣơng đối đơn gi n, dễ dàng triển hai tr ng đơn vị kiểm nghiệm thuốc, levofloxacin tách hỏi thành phần khác với thời gian lƣu h ng 17 phút - Đã tiến hành thẩ định phƣơng pháp phân tích cho kết qu đáp ứng qui định với: + Độ thích hợp hệ thống đ t yêu cầu thẩ định phƣơng pháp phân tích đồng phân đối quang với hệ số phân gi i đồng phân cao (trung bình Rs = 2,9) + Tính chọn lọc cao, có kh tách rời levofloxacin khỏi đối quang dextrofloxacin, phân biệt levofloxacin so với ofloxacin + Có mối tƣơng uan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ levofloxacin kho ng nồng độ kh o sát (0,04 – 0,06mg/ml) với hệ số tƣơng uan r=0,9995 + Độ xác (độ lặp l i ngày khác ngày) đ t yêu cầu với RSD lần lƣợt 0,45% 1,41% (n = 5) đ t yêu cầu uy định (