Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom

Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom Nghiên cứu chiết xuất cải tiến công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposom

Trang 1

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Ay HOC Be von @Z ` >» Le ae N v5: N {a} ‘2 TY Bề yy 5 V2 NN

NGUYEN THI THU TRANG

NGHIEN CUU CHIET XUAT, CAI TIEN

CONG THUC CUA PHOSPHOLIPID TU LONG DO TRUNG PHU HOP LAM

NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT DƯỢC PHẨM

DẠNG LIPOSOM

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

Trang 2

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYEN THI THU TRANG

NGHIEN CUU CHIET XUAT, CAI TIEN CONG THUC CUA PHOSPHOLIPID TU

LONG DO TRUNG PHU HOP LAM

NGUYEN LIEU SAN XUẤT DƯỢC PHÁM DANG LIPOSOM

LUAN VAN THAC SỸ DƯỢC HỌC CHUYEN NGANH HOA SINH

MÃ SO: 60 73 25

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Lập

ThS.NCS Bui Ba Minh

Trang 3

LOFT CAM OO

Tôi xin trân trọng cảm on Ban giảm hiệu, phòng đảo tạo sau dai hoc, Trường Đại học Dược Hà Nội đã cho phép và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suối quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Lập và ThS Bùi Bá Minh — là những người thây đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hồn thành luận văn

Tơi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô, các cán bộ bộ môn Hóa Sinh — trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ phòng Hóa Thực Vật — Viện hóa học công nghiệp và các cán bộ phòng Dược Lý, Vi Sinh, Hóa Lý 2 - Viện kiểm nghiệm thuốc trung uong da tao moi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những tình cảm chân thành, sự giúp đỡ nhiệt

tình, tạo điêu kiện tốt nhất của những người thân trong gia đình, những đồng

nghiệp, bạn bè — những người đã luôn bên cạnh, giúp đố, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 25 thang 9 nam 2012 Tác giả

Trang 4

MUC LUC

ĐẶT VẤN TĐIỈỀ 5-6 2 9S 9 29 9 9 95 19159805 5989 5089.0655069 1

CHƯƠNG 1: TƠNG QUN 5 s<S<S999349369349939693365090509004602460 3

1.1 Tổng quan về phospholipid - -s- - + kE+Sk+k ke +k‡EEkeEeeEkek ke re, 3

1.1.1 Giới thiệu chung về PL - - 6 Set kÉESEkEEEEk ven cty cket 3

1.1.2 Phospholipid trứng -c C11111 11 9 9 11111 g1 ke 4

1.1.2.1 Thành phần của phospholipid trứng - - s sxexsxxexscxd 4

1.1.2.2 Ung dụng của phospholipid trứng trong ngành được 6 1.1.3 Các hướng dẫn của FDA về việc sử dụng PL lòng đỏ trứng làm nguyên

liệu chế tạo i90 7 a3 7

1.2 Phương pháp chiết xuất bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn 8

1.2.1 Trạng thái siêu tới hạn - - << s1 11119 9 2 1 11 1 g1 1 ke 8

1.2.2 Dung môi CO; ở trạng thái siêu tới hạn 55555 << ss+2 9

1.2.3 Dung môi phụ trỢ .- - - - ( < cĂ G1101 0111 110 10 10 11111110 21111111 11g 3v 10

1.3 Các phương pháp chiết xuất phospholipid - 5s se sex: 10

1.3.1 Chiết bằng dung mơi hữU CƠ «te kề tk kg geerkekerees 10

1.3.2 Phương pháp sử dụng CO; siêu tới hạn (SC-C?) «‹ 12

1.4 Các phương pháp cải tiễn công thức ÏPL: - 5 Sex ke 13

1.4.1 Phương pháp vật lý (Q9 HH tk ray 13

IE ŸÄx¡ ho ái svÀ2 0 4 14

1.4.3 Phương pháp hóa hỌọc c0 ng 1 1 ven 15

1.5 Một số nghiên cứu về phospholipid trứng - - c6 56k exckexexsrkd 15

1.5.1 Các nghiên cửu †rOo'E HƯỚC: - Gc S9 11111113 19351 4, 15

1.5.2 Một số nghiÊn cứu nưỚC ngOÀI 5c S St stkeieieiiresie 17

CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 HOA CHAT, THIET BI, DIA DIEM TIEN HANH NGHIEN CUU 20

Z.L.1 NQuyén 1iGU ccc ccccccccscsssseeeeeecesscsaaeeceeeesseseeeeeeeeesseseeeeeeeeeseseseaaeaeas 20

2.1.2 Hóa chất: c2 E2 111 1111111111111111.1111111101 1x 20

2.1.3 ThiẾt bị 000000001201 111 1111111111111 11001111111111151 1x55 21

2.1.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu - -cc- cà cee 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: -. c5c5cccccxvrxrxverrsrvrre 21

2.2.1 Quy trình chiết xuất, tinh chế và cải tiễn công thức phospholipid từ

lòng đỏ trứng đông khô - GG G190 90g 1 ren 21

2.2.1.1 Chiết tách phospholipid bằng phương pháp CO; siêu tới hạn 21

„A00 14 23

2.2.1.3 Hydrogen hóa PPÌ, - Ăn 1 1119900 ng 1á 23

Trang 5

2.2.2 Xác định thành phân và biện giải cầu trúc của PL lòng đỏ trứng 25

2.2.2.1 Xác định thành phần của PL lòng đỏ trứng: - - ¿6e sẻ 25

2.2.2.2 Biện giải cầu trúc của PL lòng đỏ trứng - - sscxecsxxesd 26

2.2.3 Các phương pháp đánh giá tiêu chuẩn cơ sở của PL lòng đỏ trứng làm

nguyên liệu chế tạo được phẩm thuốc tiêm dạng liposom - -: 28

2.2.3.1 Kim 8i0:ii18n 28

2.2.3.2 Chỉ SỐ aCid tt tt tt 1111.111 29

2.2.3.3 Chỉ số peroXyd (PV) - ch tt TT ng ng càng ng 30

2.2.3.4 Nội độc tô vi khuẩn: .- cv tt 31

2.2.3.5 Giới hạn nhiễm khuẩn - ¿c5 tvExvttExtxrirrtrtrterkrriis 38

2.2.3.6 Xác định hàm lượng TƯỚC .- S11 1+ x+2 41

2.2.3.7 Chỉ SỐ iOỞ c2 E111 43

2.2.3.8 Khoảng nóng Chảy - c9 ng n3 1 kh 44

_2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU < «<< s<9v245292249926 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 46

3.1 Quy trình chiết xuất, tinh chế và cải tiên công thức của PL 46

3.1.1 Nghiên cứu chiết xuất PL bằng SC-CO¿ - 5 St +texvekexke 46

3.1.2 Phân tích và biện giải câu trúc của PL lòng đỏ trứng 46

3.1.2.1 Kết quả phân tích thành phần acid béo: - sec 46

3.1.2.2 Kết quả phân tích câu trúc bằng LC-MS ¿- 6 scxcsẻ 46

3.1.3 Tinh sạch và cải tiến công thức của PL - - c6 Stsk+xexsxexke 49

1A h9, áo ác ắỶắnấnẵnỗỠTỠỸÃ 51

3.1.5 Xác định thành phần PL lòng đỏ trứng - s6 sec cxevecxecee 52

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu PL lòng đỏ trứng làm nguyên

liệu chế tạo được phẩm thuốc tiêm dạng ÌIDOSOm «c5 Ặ 2c c2 <x+2 57

3.2.1 Kết quả kiểm nghiệm - SE tk EESEk ST ccngckgrkg 58

3.2.1.1 Kim loại nặng: .- - SH HH khu 58

3.2.1.2 Chỉ SỐ acid tt tt t1 rrrrrrie 59

3.2.1.3 Chỉ số peroxyd (PV): -c- ket tk TT n1 HH ng ng ng 59

3.2.1.4 Nội độc tố vi khuẩn c:-ccvtttxtttkttEkittrttritrrrrrrrrrrrree 60

3.2.1.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn .- - e k eEk£EeEckcxereckee: 61

3.2.1.7 Xác định hàm lượng nưƯỚC - 11A1 51x54 64

3.2.1.8 Chỉ SỐ ÏOd ccc tt HH ng 1g re 65

3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của PL trứng - - sex +xexskexee 65

3.2.3 So sánh mẫu PL trứng thu được trong đề tài với nguyên liệu PL có sẵn

i3: 811105áï)(75- 0217777 =a 67

Trang 6

KIÊN NGHỊ esssanesescccsseannesccesccsnsnecccceccsnnsneccccecsassnecccsccssaneesseceessansnecees 70 TAI LIEU THAM KHAO

PHU LUC

PHU LỤC 1: Dự đoán cấu trúc dựa vào MS1 của ion có DpIc tại 18,168 phút PHỤ LỤC 2: Dự đoán cấu trúc dựa vào MS1 của ion có pic tại 18,222 phút PHU LUC 3: MS1 va MS2 cua ion c6 pic tai 18,327 phút

PHU LUC 4: Dy doan cau tric dua vao MS1 cta ion c6é pic tai 18,327 phut

PHU LUC 5: Phiéu kiém nghiệm hai chỉ tiêu nội độc tô và độ nhiễm khuẩn của mẫu phospholipid trứng

Trang 7

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

CD: chuẩn độ

ELSD: detector tán xạ ảnh sáng bay hơi ESI: Electrospray ionization GC: Sac ky khi HPLC: Sac ky long hiéu nang cao LC: Sac ky long MS (Mass spectrum): Khéi phé MSI: Phổ khối lần 1 MS2: Phố khối lần 2 P: Áp suất PC: Phosphatidylcholin

PE: Phosphatidyl ethanolamin

PI: Phosphatidyl Inositol

PL: Phospholipid PS : Phosphatidy] serin

PV (peroxide value): Chỉ số peroxyd

SC-CO2: phương pháp sử dụng CO; ở trạng thái siêu tới hạn SCO,: CO; ở trạng thái siêu tới hạn

Trang 8

DANH MUC CAC BANG Tén bang Trang Bang 1.1: Thanh phan % các loại PL tương ứng trong PL lòng đỏ | 5 trứng và PL hạt đậu nành

Bảng 1.2: Thành phân % acid béo tương ứngtrong PC, PE, PS, |6

sphingomyelin và lipid tổng của PL trứng

Bảng 1.3: Các hệ dung môi chiết xuất phospholipid H

Bang 1.4: Thành phân PL thu được từ nguyên liệu lòng đỏ trứng và | 16 hạt đậu nành bằng phương pháp SC-CO; và phương pháp dung môi Bang 1.5: Thành phân các acid béo trong phospholipid chiết xuất từ | 18

đậu nành và trứng

Bang 2.1: Chê độ gradient của pha động 26

Bảng 2.2 Kiểm tra yêu tô ảnh hưởng 35 Bảng 2.3 Pha các dung dịch cho phép thử giới hạn 37

Bảng 2.4: Đặc điêm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa | 40

chọn

Bảng 2.5: Đặc điêm hình thái của Escherichia coli trên môi trường | 41 thạch Mac — Conkey

Bảng 3.1: Kêt quả phân tích thành phân của sản phâm PL trứng 56

Bang 3.2 Tiéu chuan phospholipid trimg cua USP34-NF29 57

Bang 3.3: Kết quả tính giá trị acid 59

Trang 9

Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm nội độc tô 60

Bảng 3.5: Kết quả đêm số lượng vi sinh vật trong mẫu PL 62

Bảng 3.6: Kết quả nuôi cây với chứng âm tính 63

Bang 3.7: Kêt quả xác định đương lượng nước của thuộc thử Karl | 64

Fisher

Bang 3.8: Kết quả xác định hàm lượng nước của PL 64

Bang 3.9 : Kết quả xác định chỉ sô iod 65

Bang 3.10: Tiêu chuẩn cơ sở của phospholipid trứng 66

Bảng 3.11: So sánh PL trứng của đê tài và PC-98N 67

Trang 10

DANH MUC CAC HINH Tén hinh Trang

Hình 1.1: Câu trúc của phospholipid 4

Hình 1.2: Đô thị biêu diễn trạng thái các chât ở vùng siêu tới hạn 8

Hình 1.3: Hai giai đoạn chiết xuât PL từ lòng đỏ trứng 13

Hình 1.4: Vi tri tac d6ng cua cac enzym phospholipase Aj, Ax,C vaD | 15

Hinh 1.5: PE plasmalogen trong phospholipid 19

Hình 2.1: Thiết bị phản ứng cao áp Parr 24

Hình 2.2: Máy cô quay Heidolph 24

Hình 2.3: Bộ phân tích tử cực chập ba 28

Hình 2.4: Máy phân tích nhiệt vị sai 44

Hình 3.1: Phô khối của PL trứng 47

Hình 3.2: Hình ảnh phô khôi ở vị trí pic có cường độ mạnh nhất 48

Hình 3.3: Công thức câu tạo của palmatoyl oleoyl phosphatidylcholn | 49

Hình 3.4: Giản đô nhiệt của PL thu được của đề tài 52

Hình 3.5: Sắc ký đô của PC chuẩn 53

Hình 3.6: Sắc ký đô của PE chuân 54

Hình 3.7: Sắc ký đô của PL 55

Trang 11

DAT VAN DE

Việc tạo ra liposom bằng công nghệ nano đã góp phần quan trọng trong

việc tạo ra một số dạng bào chế hiện đại Liposom có bản chất là lớp phospholipid kép, tương tự cấu trúc của màng sinh học nên có tính tương thích sinh học và độ an toàn cao, có ứng dụng quan trọng trong việc đưa thuốc tới đích tác dụng trong điều trị các bệnh như ung thư, liệu pháp gen

Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về liposom nhằm tạo ra các dạng thuốc trong điều trị Một trong những lý do là giá thành liposom thành phẩm và

nguyên liệu phospholipid (PL) đạt tiêu chuẩn chế tạo liposom nhập ngoại rất cao Vì vậy, một yêu cầu đặt ra là cần phải nghiên cứu quy trình công nghệ nhằm

chiết tách phospholipid từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có trong nước với quy mô công nghiệp đạt tiêu chuẩn chế tạo liposom

Trên thế giới, phương pháp dung môi ở trạng thái siêu tới hạn (SFE) đã

được tiễn hành phố biến, do nó cho phép giảm thời gian chiết, đòi hỏi lượng mẫu

ít, tiết kiệm lượng lớn dung môi và làm tăng độ tinh khiết của sản phẩm [4] Mặt

khác, COs siêu tới hạn (SC-CO;) là đung môi được sử dụng phổ biến nhất trong SFE, vi nó không độc, rẻ tiền và dễ dàng để loại bỏ ra khỏi nguyên liệu chiết

xuất Ngoài ra, nhiệt độ tới hạn thấp cho phép tiễn hành chiết ở nhiệt độ dưới

mức biến tính, do đó ngăn ngừa sự biến tính của nhiều thành phân nhạy cảm với

nhiệt độ có trong nguyên vật liệu Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy dùng S%C-CO; là phương pháp chiết tách phospholipid hiệu quả hơn so với các phương

pháp dùng dung môi cô điền

Trang 12

nghiên cứu bước đầu nhằm áp dụng phương pháp SC-CO; để tách loại

phospholipid (PL) từ hai nguồn nguyên liệu phố biến nhất là lòng đỏ trứng và hạt

đậu nành cho thấy phospholipid tách chiết từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp

này có độ tinh khiết cao và hơn hắn so với từ đậu nành [6].[7]

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, cải tiễn công thức của phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất được phẩm dạng liposom'” với các mục tiêu:

1) Hoàn thiện quy trình chiết xuất, tỉnh chế và cải tiến công thức

phospholipid từ lòng đỏ trứng đông khô bằng phương pháp sử dụng CO¿ ở

trạng thái siêu tới hạn

2) Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phospholipid chiết tách được để làm

Trang 13

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Téng quan vé phospholipid 1.1.1 Giới thiệu chung về PL

PL là este của polyalcol với các acid béo mạch dài và thành phần có thêm

sốc phosphat, bao gồm hai phân nhóm tùy thuộc vào thành phần alcol trong câu tạo cua lipid: ølycerophospholipid có alcol là glycerol va sphingolipid c6 alcol 1a sphingosin [6] Thành phân hay gặp nhất là glycerophospholipid

Công thức câu tạo chung của glycerophospholipid là: 4 0 H2 - " i R „= rC É ——ỨH:Ẳ@+¬ PL có tên gọi PC +:C Q— ˆ— Ri 0 CH H H —p—L_ạ H:N C”——cH;9H ĐL có tên gọi PE H ft gu PL sé tên gọ1 PS eo 4 X Là < COOH OH PC: Phosphatidyl cholin

FE: Phosphatidy!] ethanelamin Tee a PI: Phosphat dyl inesitol ì : PS: Phosphatidy] serin

~ —— ĐT =6 tên gọi DĨ

HỖ OH

PL có 2 phân: phân đầu (hcad) và phân đuôi (tail) Phần đầu có tính thân nước

(hydophilic), gồm nhóm phosphate gắn với các dẫn xuất amin khác nhau Phần đuôi là hai chuỗi hydrocarbon có tính ky nước (hydrophobic) Sự kết hợp của 2

phần hydrophilic và hydrophobic tạo thành phân tử có một phần thân dầu và một

Trang 14

i Choline tu a 2 8 pee) Phosphate 3 2 “H8 E482-28816056.8-8.Á có k8 - a ead — 5 cM 7 CH, aac 1 2 ee ewee seen 5 add Bes ' i ea phan dan : thân nước , => phan dudi ky ước =

ae (b)C au trúc khong gian (¢) phan ty amphiphilic

Hình 1.1; Cau tric ciia phospholipid

PL cht yéu 1a phosphatidylcholin (PC) c6 nguén géc ty nhién nhw lecithin

trứng, lecithin đậu tương hoặc có nguồn gốc tổng hợp nhu dimyristoyl

phosphatidylcholin, dipalmitoyl phosphatidylcholin là nguyên liệu chính để tạo liposom Ngoài ra, các loại PL khác như PS, PI, sphingomyelin cũng được dùng để chế tạo liposom Do trong câu tạo hóa học của PC có chứa nhóm ưa nước và ky nước nên chúng thể hiện đặc tính là chất lưỡng tính, được sử dụng rất thích

hợp làm tác nhân phân tán, nhũ hóa và ổn định Hơn nữa, do có nguồn gốc tự

nhiên, PC có tính tương thích sinh học và phân huy sinh học cao PC phân tán

trong nước thành các tiêu phân có cấu trúc hình cầu bao quanh bởi lớp màng là

lớp phospholipid kép linh động, gọi là liposom 1.1.2 Phospholipid trứng

Trang 15

Lòng đỏ trứng bao gồm 32-35% lipid, trong dé 66% triglyceride, 28% PL, 5% cholesterol và 1% các lipid khác [29] PL trứng được đặc trưng bởi lượng lớn

hàm lượng lớn PC và sự có mặt của các acid mạch dài không bão hòa với 3 - 6 nôi đôi, trong đó chủ yêu là acid arachidonic và acid docosahexanenoic Thành phan các PL có trong PL lòng đỏ trứng va hạt đậu nành được thể hiện trong Bang 1.1 [28] Bảng 1.1: Thành phần % các loại PL tương ứng trong PL long dé tring và PL hạt đậu nành Thành phân PL lòng đỏ trứng (%) | PL hạt đậu nành (%) PC 66-76 33,0 PE 15-24 14,1 PS 1 0,4 PI - 16,8 Acid phosphatidic - 6,4 Lysophosphatidylcholine 3-6 0,9 Lysophosphatidylethanolamine | 3-6 0,2 Sphingomyelin 3-6 -

Trong thành phân lipid và PL lòng đỏ trứng, chủ yêu là các acid béo mach dai 16 C va 18C và các acid béo mạch dài hơn (20C, 22C) không bão hòa Các acid béo liên kết ester ở vị trí C1 trong khung ølycerol-phosphate thường là các acid

béo no 16C hoặc 18C, trong khi đó liên kết ở vị trí C2 thường là acid không no 18C Thành phần % acid béo tương ứng trong PC, PE, PS, SM và lipid tông

Trang 16

Bảng 1.2: Thành phần % acid béo tương tmgtrong PC, PE, PS, SM va

lipid tong của PL trứng Acid béo PC PE PS |SM |Lipidtông Myristic (C14:0) 0,2 0,1-2,0 5,2 |5,8 | 0,4 Palmitic (C16:0) 31,6-43,6 | 16,7-33,4 | 29,6 | 37,9 | 24,9-26,3 Palmitoleic (C16:1) 0,6-2,8 0,5-2,0 48 |5, | 5,4-3,7 Stearic (C18:0) 11,6-17,3 | 24,3-31,5 | 24,1 | 16,0 | 8,1-9,8 Oleic(C18:1) 27,5-31,4 | 15,0-27,6 | 14,0 | 21,5 | 35,9-39,6 Linoleic(C 18:2) 5,3-16,2 |5,4-11,2 |6,4 [8,2 | 17,0-18,6 Linolenic(C18:3) 0,1-1,0 - - - 0,8-0,9 Arachidonic(C20:4) 2,7-4,3 12,5-15,8 | 8,4 |- 2,2-2,5 Docosapentaenoic(C22:5) | 0,1-0,8 0,3 - - 0,6-0,7 Docosahexaenoic(C22:6) | 1,7-5,3 6,6-16,3 | - - 0,9-1,1

1.1.2.2 Ứng dụng của phospholipid trứng trong ngành dược

Khả năng nhũ hóa của PL trứng được sử dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm để chế tạo các nhũ dịch lipid dạng tiêm và các hệ mang thuốc như liposom

[34], [19]

Đặc tính lý hóa có vai trò quyết định tới khả năng nhũ hóa của phân tử Mức

độ bão hòa, độ dài của mạch acyl và đặc điệm của nhóm phân cực ảnh hưởng tới tính chất vật lý của PL, đặc biệt là nhiệt độ nóng chảy, tính chất điện hoạt và dạng ion của phân tử PL gồm 80% PC và lượng nhỏ PL acid có khả năng nhũ

hóa rất tốt Ngược lại, những PL tinh khiết hơn (95 — 100% PC hoặc PE) có sức

Trang 17

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của PL là làm nguyên liệu tạo chất mang thuốc dạng liposom Đây là dạng bào chế hiện đại có vai trò bảo vệ phân tử dược chất (dạng thân nước và thân dâu) và mang thuốc tới tận đích tác dụng Đặc biệt, việc hydrogen hóa PL trứng làm tăng khả năng bao gói dược chất và cải thiện đáng kê tính ôn định của liposom [28]

Trước đây, lecithin đậu nành được sử dụng rất nhiều Nhưng từ khi có những

báo cáo về tác dụng phụ của các chế phẩm tiêm dạng nhũ dịch được chế tạo từ

nguồn nguyên liệu này, PL trứng được quan tâm và ưu tiên dùng nhiều hơn nhờ tính an toàn và tương thích sinh học Ngoài vai trò nhũ hóa, trong các chế phẩm

dinh dưỡng tĩnh mạch dạng nhũ dịch, PL trứng đóng vai trò pha phân tán cung cấp năng lượng và các acid béo cần thiết cho cơ thể người bệnh [40]

PL trứng ( 60% PC) được ứng dụng rất thành công trong việc chế tạo một trong những hệ mang thuốc được quan tâm hiện nay Đó là hệ phân tử nano lipid

rắn với bản chất là những phân tử hình cầu (đường kính 50 — 500 nm), lõi là hệ

nén lipid ran có thể hòa tan các phân tử tan trong dầu [27 ]

1.1.3 Các hướng dẫn của FDA về việc sử dụng PL lòng đỏ trứng làm nguyên liệu chế tạo liposom

Chất lượng và độ tinh khiết của thành phần nguyên liệu lipid có ảnh

hưởng rất lớn tới chất lượng của liposom tạo thành Đối với các sản phẩm có nguôn gốc tự nhiên như PL lòng đỏ trứng, cần phải nêu rõ nguồn gốc nguyên liệu ban đầu, nhà cung cấp và các tiêu chuẩn Các tiêu chuẩn của PL phải đảm bảo việc lipid tạo thành sản phẩm liposom đạt tiêu chuẩn và đáp ứng tiêu chuẩn

về mức độ tinh khiết Trong một số trường hợp cần chỉ rõ thành phân lipid (phần

Trang 18

hòa của các acid béo ) vì nễu mức độ không bão hòa của các acid béo quá cao thì không thể tạo thành liposom ôn định được [28]

1.2 Phương pháp chiết xuất bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn 1.2.1 Trạng thái siêu tới hạn

Đối vối mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ

tôn tại ở một trạng thái nào đó trong ba trạng thái răn, lỏng và khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất

mà ở đó, nêu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái

khí, mà rơi vào một vùng trạng thải đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn Trạng thái của các chất ở vùng siêu tới hạn được thê hiện trên hình 1.2 Vật chất ở trạng

thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, chính vì vậy chúng

đều có những trạng thái ưu việt của cả hai pha khí và lỏng Chất ở trạng thái siêu

tới hạn có tỷ trọng tương đương như tỉ trọng của pha lỏng Nhưng sự linh động

Trang 19

Ở các dung môi siêu tới hạn, ưu điểm nổi bật nhất mà mọi dung môi thông

thường khác không có được đó là khả năng hoà tan rất tốt các chất tan ở cả ba

trạng thái ran, lỏng và khí Dung môi ở trạng thái siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả các cầu tử không bay hơi của mẫu Khi đó dung môi

ở trạng thái siêu tới hạn sẽ mang cả hai đặc tính: đặc tính phân tách của quá trình

trích li và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất [6], [7], [23] Do vậy, có

thể thấy rằng việc sử dụng dung môi siêu tới hạn để tách chiết các chất sẽ mở ra một phương pháp kỹ thuật mới mà tiềm năng của nó trong tương lai sẽ có sự tác

động lớn tới nền công nghiệp hoá chất, thực phẩm, được phẩm và công nghệ sinh học

1.2.2 Dung môi CO; ở trạng thái siêu tới hạn

Trong các dung môi được sử dụng ở trạng thái siêu tới hạn, CO; là dung môi được lựa chọn áp dụng nhiều nhất, đáp ứng được nhiều yêu cầu cần thiết về mặt

công nghệ, với các ưu điểm [6], [7] [23]

e CO; là một chât dê kiêm, rẻ tiên vì nó là sản phâm phụ của nhiều ngành cơng nghệ hố chất khác

e Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết e Không bắt lửa, không duy trì sự cháy

e Không gây ô nhiễm môi trường

e CO; không độc với cơ thé, không ăn mòn thiết bị

e Điểm tới hạn của CO, (P.= 73 atm; T,= 30,9 °C) không cao, tốn ít năng

Trang 20

e Có khả năng hoà tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể răn cũng như lỏng,

đồng thời cũng hoà tan lẫn cả các chất thơm dễ bay hơi, hòa tan chọn lọc,

khơng hồ tan các kim loại nặng và dễ điều chỉnh các thông số trạng thái

đê có thê tạo ra các tính chất lựa chọn khác nhau của dung mơi

e Khi CO; hố hơi không để lại cặn độc hại

1.2.3 Dung môi phụ trợ

Dung môi phụ trợ hay dung môi thứ cấp là một chất hữu cơ được đưa thêm

vào dung môi chính với một lượng rất nhỏ, thường là 1 - 5 mol%, nhằm biến đồi đặc tính của dung môi chính theo hướng có lợi cho mục tiêu chiết tách, chắng hạn như làm thay đổi tính phân cực, hay các tương tác riêng của dung môi đối

với các hoạt chất tan, mà không làm thay đổi đáng kê tỷ trọng và tính khả nén

của dung mơi chính [6]

Ngồi ra, dung môi phụ trợ có thé cai thiện tính chọn lọc của qúa trình tách

chiết bằng sự tương tác ưu tiên với một hay vài cấu tử Methanol là một ví dụ:

cho thêm 3,5% mol methanol lam tang d6 tan cua 2-aminobenzoic acid lên 620% trong CO; siêu tới hạn [27]

Dung môi có trộn thêm dung môi phụ trợ sẽ có các giá trị tới hạn (nhiệt độ, áp suất) khác với giá trị của đung môi chính Thông thường với nông độ dung môi phụ nhỏ hơn 5% mol, sự sai khác này không đáng kể và hỗn hợp dung môi thường vẫn ở trạng thái siêu tới hạn

1.3 Các phương pháp chiết xuất phospholipid

Trang 21

Nguyên liệu được chiết bằng các hệ dung môi hữu cơ khác nhau để thu được

dịch chiết lipid tổng [9], [16] Các hệ dung môi được sử dụng được thể hiện trong Bảng 1.3 Bảng 1.3 Các hệ dung môi chiết xuất phospholipid Hệ dung môi Phương pháp chloroform/methanol (2:1) | Folch chloroform/ methanol/ H,O | Bligh & Dyer CH;C1;: CHạOH (2:1) Chen (1981) CH;C];: CH;OH (9:1) Marmer, Maxcell (1981) Hexan: isopropanol (7:1) Rose va Oklader (1965)

Sau khi thu được dịch chiết lipid téng, ta cé nhiéu phuong pháp tách PL khỏi

phan lipid trung tinh

Tuy nhiên, các phương pháp chiết tách PL bằng dung môi hữu cơ có nhiều

nhược điểm là:

e_ Giai đoạn tinh chế phức tạp

e Nhiệt độ cao, tốn thời gian e Dư lượng dung môi

Trang 22

1.3.2 Phương pháp sử dung CO, siéu toi han (SC-CO,)

Gần đây việc sử dụng công nghệ SC-CO; với mục đích chiết xuất PL ngày càng được sử dụng rộng rãi Công nghệ này có nhiều ưu điểm so với các phương

pháp chiết xuất truyền thống như: cho phép giảm bớt thời gian chiết xuất, giảm lượng dung môi sử dụng và sản phẩm thu được tinh khiết hơn so với phương

pháp chiết xuất bằng dung môi [6], [7]

Phương pháp sử dụng CO; ở trạng thái siêu tới hạn trở thành phương pháp có nhiều triển vọng trong việc chiết xuất “sạch” PL từ nhiều nguồn nguyên liệu trong đó có lòng đỏ trứng

Do bản chất CO; không phân cực nên kém có hiệu quả khi hòa tan các

phân tử cực như phospholipid [26] Vì thế, khi dùng SFE, ethanol đóng vai trò như dung môi phụ trợ đã được bỗ sung thêm với CO; để cải thiện độ hòa tan

phospholipid trong lòng đỏ trứng và hạt có dầu [4], [26] Nhiều nghiên cứu cho thấy khi bổ sung dung môi phụ trợ, tính hòa tan các chất tăng đáng kẻ trong chất

lỏng siêu tới hạn khi so sánh ở cùng một nhiệt độ và điều kiện áp suất [8]

Theo nhiều nghiên cứu gần đây [8], [22], [24], PL có thể được chiết ra từ

lòng đỏ trứng với độ tinh khiết cao, trải qua 2 giai đoạn riêng biệt (Hình 1.3) Giai doan 1: Tách loại lipid trung tính và cholesterol Trong gia1 đoạn này,

lòng đỏ trứng được chiết bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn (SCO;)

Giai đoạn 2: Chiết PL Phần bã trứng giàu PL thu được sẽ được chiết tiếp bằng công nghệ siêu tới hạn với hỗn hợp dung môi CO; và ethanol hoặc

Trang 23

⁄ Lòng đồ trứng

{ hiết xuấ Hau hét lipid trung tinh

Gai - SFE với CO; và cholesterol đoạn Í J NỈ Bã trứng giàu PL px và J ok c Ấ Hau hét PL Giai — < | SFE với hỗn hợp CO; và E(OH | ——€hit xui đoạn 2 J Bã trứng đã kiệt lipid trung tính và PL

Hình 1.3: Hai giai đoạn chiết xuất PL trứng

Nguyên tắc của phương pháp chiết xuất PL từ lòng đỏ trứng là dựa trên

tính hòa tan của các loại lipid trong SCO; cũng như trong hỗn hợp dung môi SCO, - ethanol Các lipid trung tinh va cholesterol tan tốt trong SCOz Trong khi

PL ít tan trong SCOa, nhưng lại tan tốt khi ta thêm các dung môi hỗ trợ tăng độ

phân cực như ethanol, methanol [15]

1.4 Các phương pháp cải tiến công thức PL:

Có thê thay đổi tính chất của các PL cho phù hợp với từng mục đích sử dụng bằng cách thay đổi câu trúc của các phân tử phosphoacylglycerol thông qua các phương pháp vật lý, hóa học hoặc enzym

1.4.1 Phương pháp vật lý

>,

Trang 24

Sử dụng dung môi hòa tan tạp mà không hòa tan PL chắng hạn như ethyl

acetate, acetonitrile, acetonitrile-hydrocarbon và acetonitrile-fluorocarbon dé

tach, tinh ché từng loại PL dựa vào sự khác nhau về độ tan của từng loại PL trong các dung môi hữu cơ [2l]

>,

$% Phuong phap sac ky :

Việc tách các lipid sử dụng sắc ký cột là một phương pháp phố biến và đem lại hiệu quả tốt [28] Việc cho các sản phẩm PL chiết tách được vào cột silicagel, AlzO›, MgO hoặc cột trao đổi ion sẽ làm tăng nồng độ của tửng loại PL Hiện nay, có thê tinh chế được PC với tỉ lệ rất cao bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký cột rắn-lỏng, sắc ký nhanh và sắc ký lớp mong [21]

1.4.2 Phuong phap enzym

So với phương pháp vật lý và hóa học, phương pháp sinh học này có nhiều

ưu điểm là: không sử dụng đung môi độc hại, các bước tinh chế tiễn hành đơn

giản và hạn chế được ảnh hưởng của nhiệt và sự ôxy hóa đối với các PL Các enzym được sử dụng 1a phospholipase A;, A», C va D Phospholipase D c6é

vai trd bién đôi loại PL này thành loại PL khác và kết quả là tạo ra sản phẩm

Trang 25

phospholipase A, BO HC-O—<C-Ra phospholipase As HạC-O-+—P—O-X i C) bk a phospholipase C < * phospholipase D Hình 1.4: Vị trí tác động của các enzym phospholipase A,, A>, C va D 1.4.3 Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học phố biến nhất được áp dụng để cải tiễn công thức của PL lòng đỏ trứng là phương pháp hydrogen hóa Sau khi được hydrogen hóa, độ bên của PL đối với sự oxy hóa tăng lên đáng kể Chỉ số iod của PL lòng đỏ trứng thông thường khoảng 80 nhưng sau khi được bão hòa các nối đôi, chỉ số

iod giảm xuống bằng 2 — 5 [20], [28]

1.5 Một số nghiên cứu về phospholipid trứng 1.5.1 Các nghiên cứu trong nước:

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về chiết tách PL bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ nhưng mới chỉ có hai nghiên cứu chiết tách PL bằng phương pháp SC-CÓ¿

Trong nghiên cứu của Hán Minh Hưng [5], tác giả tiễn hành tách chiết PL

Trang 26

PL chế phẩm là 80,32% (Trong đó, PC chiếm 59,20%, PE chiếm 18,54%) Với

mục tiêu sử dụng PL tách chiết được làm nguyên liệu tạo liposom thì sản phẩm

thu được có tỷ lệ PC là rất thấp và còn lẫn nhiều tạp

Nguyễn Thị Lập nghiên cứu chiết xuất và tinh chế PL từ lòng đỏ trứng và

hạt đậu nành bằng phương pháp CO; siêu tới hạn [6] Thành phần của các sản phẩm thu được kết quả thể hiện trong Bảng 1.4

Bảng 1.4: Thành phần PL thu được từ nguyên liệu lòng đỏ trứng và hạt đậu nành bằng phương pháp SC-CO; và phương pháp dung môi Nguyên liệu | Lòng đỏ trứng Hạt đậu nành Phương pháp | SC-CO; Dung môi SC-CO; Dung môi chiét xuat 90,1% PC 79,0% PC 73,49% PC | 51,10% PC 7,0% PE 13,5% PE 15,35% PE | 3,40% PA

Thanh phan|2,9% Lipid|7,5% Lipid | 9,01% PS 4,69% Lipid

PL thu dugc | trung tinh trung tinh 0,74% PI trung tinh

1,41 % Lipid trung tinh

Kết quả nghiên cứu cho thấy: sản phẩm thu được bằng phương pháp SC- CO; có độ tinh khiết cao hơn hắn so với phương pháp dung môi Hiệu suất thu nhận PL từ nguyên liệu lòng đỏ trứng (11,61%) cao hơn hắn so với nguyên liệu hạt đậu nành (0,72%)

Kết quả của các nghiên cứu trên là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu đã tiễn hành trên thế giới và yêu cầu đặt ra là cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa

để thu được các sản phẩm có độ tinh khiết cao hơn và có thể tiễn hành ở quy mô

Trang 27

1.5.2 Một số nghiên cứu nước ngoài

> Nghiên cứu về chiết xuất phospholipid tiv long dé tring

Nghiên cứu của K Elst và cộng sự [22] cho thấy: Lượng PL thu được từ

phương pháp SC-CO; với dung môi phụ trợ ethanol cao hơn nhiều so với việc

không sử dụng ethanol Lượng PL thu được phụ thuộc rất lớn vào độ phân cực

hay thành phần của chất lỏng siêu tới hạn (tỉ lệ ethanol) và áp suất Khi ethanol

chiếm tỉ lệ nhỏ, nhiệt độ có ảnh hưởng rắt ít tới hiệu suất chiết PL

Tương tự, khảo sát ảnh hưởng của dung môi phụ trợ ethanol trong nghiên cứu của Leyla Teberikler và cộng sự [24] thu được kết qua: khi tang % ethanol tu 10% lên 12,5%, tong lượng PL và mức độ tách chọn lọc với PC cũng tăng lên

Áp suất ảnh hưởng lớn tới hiệu quả tách chiết PC Lượng PE, PI tách ra là giống

nhau ở cùng áp suất nhưng mức độ chọn lọc với PC tăng lên khi áp suất tăng

Thực nghiệm cho thấy, khi tăng áp suất từ 17,2 MPa tới 20,7 MPa, % PC thu được tăng lên từ 91% đến 95% Nhiệt độ có ảnh hưởng tới tông lượng PL chiết

xuất và độ chọn lọc PC Khi nhiệt độ tăng, lượng PL giảm mạnh đồng thời hàm

lượng PC trong dịch chiết giảm Cụ thể là, khi nhiệt độ tăng từ 60 °C đến 80C,

lượng PC giảm từ 95% xuống 73% > Nghiên cứu về tỉnh chế PL:

Tae Ho Yôn và cộng sự đã thành công trong việc tinh chế PL dat tinh khiết đến trên 99 % PC bằng cách sử dụng phương pháp HPLC với pha động là methanol, tốc độ dòng 2,0 ml/ phút, Cột KR-100-10SIL (250 x 4,6 mm) [35]

Hé théng SMB (simulate moving bed) với 8 cột silicagel: cột 100 mm x

Trang 28

v/v), toc d6 dong 1,0 ml/ phut, detector UV do ở bước sóng 205 nm đã tỉnh chế

duoc PC tu PL dau nanh dat trén 90% PC [39]

Kearns va cOng su da thanh céng trong viéc dua ra mét phuong phap tinh

chế PL sử dụng dung mi acetonitrile, acetonitrile-hydrocarbon hoặc acetonitrile-fluorocarbon đề tinh chế PL đặc biệt là tách PC, PE ra khỏi các PL

khác, thu được các sản phẩm có độ tinh khiết > 90% [21]

> Nghiên cứu về thành phân của phospholipid của lòng đỏ trứng

Luz E.Palaclos và cộng sự [25] tiễn hành phân tích thành phan cua PL Kết quả nghiên cứu về thành phần các acid béo trong PL trứng và đậu nành được

thể hiện trong Bảng 1.5 PL trứng có lượng acid béo bão hòa nhiều hơn so với PL từ hạt đậu nành Điều này giải thích cho kết quả nghiên cứu về mức độ peroxy hóa chất béo bằng phương pháp ferric theocyanate ở bước sóng 515 nm cho thay PL từ đậu nành bị peroxyd hóa nhanh hơn so với PL từ lòng đỏ trứng

Trang 29

Luz E Palacios va céng sy [29] đã phát hiện ra có khoảng 3,6% plasmalogen trong tổng lượng PL khi tiễn hành sắc ký lớp mỏng va sắc ký

khí đối với mẫu PL từ lòng đỏ trứng với điều kiện sắc ký là:

Hòa tan PL trong chloroform : methanol (2:1) Bản mỏng silica 20 x 20 cm, dày 50 um

Pha động: chloroform : methanol: acid acetic : nước (100:45:5:2) Thuốc thử hiện màu: 2°, 7°- dichlorofluorescin (0.1% trong methanol) Quan sát dưới đèn UV

Trong khi đó, Rhodes [33] báo cáo có 0,9% plasmalogen trong lòng đỏ trứng Công thức của plasmalogen thể hiện trên hình 1.5 Ela€ˆ——€2——C>FEI—CEl1——(€=FElz)+a————t€—Ela tt CcC—-OoO—-—CH | S @ HsC—O—P—O-— CHs-CHa-NHz “ I CHs3-(CHa)x c — —

Hinh 1.5 : PE plasmalogen trong phospholipid

Cân có nhiêu nghiên cứu hơn nữa về thành phân plasmalogen trong trứng vì có

Trang 30

CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 HOA CHAT, THIET BI, DIA DIEM TIEN HÀNH NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

- Nguyên liệu: Lòng đỏ trứng được đông khô tại nhiệt độ -55°C, áp suất 0,055

bar, thời gian 6 gio

2.1.2 Hóa chất:

- CO; lỏng 99,99% được mua tại nhà máy khí hoá lỏng Yên Viên, Hà Nội - Các chất chuẩn PL do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp

- Dung môi: ethanol, 2-propanol, nước, n-hexane, triethylamine, acid acetic, chloroform, acid acetic, đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích

- Xtic tac Niken — Raney sử dụng của céng ty Yakuri Pure Chemicals, Nhat Ban

- Nước để thử nội độc tố (nước BET)

- Nội độc tố chuẩn

2.1.3 Thiết bị:

- Can phan tich Mettler (Thuy Si)

- Can ky thuat Sartorius (Duc) - May siéu 4m Bransonic (My)

- Thiét bi loc hut chan khéng

- Bình định mức, bình nón, pipet, dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

Trang 31

- Thiết bị phản ứng cao áp Parr Inst (Mỹ), máy cô quay chân không Heidolph

(Duc);

- Máy chuẩn độ đo thế 751 GPD Titrino Metrohm

- May phan tich nhiét vi sai Mettler Toledo 2.1.4 Địa điểm tiễn hành nghiên cứu

Các nghiên cứu trong đề tài được tiễn hành ở các địa điểm khác nhau, cụ thé là:

> Viện hóa học công nghiệp Việt Nam và Bộ môn Hóa Sinh — Trường Đại

học Dược Hà Nội: chiết xuất, tỉnh chế và cải tiến công thức

phospholipid

> Phòng thí nghiệm các hợp chất sinh học, viện Krict, Hàn Quốc: phân tích

thành phần acid béo và phân tích câu trúc của phospholipid chưa hydrogen hóa và phân tích thành phần của phospholipid đã hydrogen hóa

> Phòng Hóa lý 2 (phòng kiểm nghiệm nguyên liệu) — Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương: Xác định chỉ số acid, chỉ số peroxyd, giới hạn kim loại

nặng, hàm lượng nước của phospholipid đã hydrogen hóa

> Phòng Dược lý — Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương: thực hiện phép thử nội độc tố vi khuẩn của phospholipid đã hydrogen hóa

> Phòng Vi sinh — Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương: Xác định giới hạn

nhiễm khuẩn của phospholipid đã hydrogen hóa

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Quy trình chiết xuất, tỉnh chế và cải tiễn công thức phospholipid tir lòng đỏ trứng đông khô

Trang 32

Tiến hành chiết xuất theo phương pháp nghiên cứu trước [2], được mô tả

tóm tắt như sau:

Quá trình chiết tách PL được thực hiện trên thiết bị chiết siêu tới hạn SFT - 250,

dung tích bình chiết 2 L Điều kiện tối ưu của quá trình chiết xuất là:

Giai đoạn 1: chiết loại lipid trung tính và cholesterol trong lòng đỏ trứng

đông khô tại điều kiện:

Nhiệt độ (T): 47 °C

Ap suat (P): 316 bar

Thoi gian (tg): 123 phut

Giai doan 2: B6é sung thém dung môi phụ trợ là ethanol và chiết

phospholipid tai diéu kién: Nhiét d6 (T): 51 °C Ap suat (P): 368 bar Thời gian (tg): 120 phút Hàm lượng dung môi phụ trợ (C): 8,14 % - Giai doan 1:

Nạp 100 g lòng đỏ trứng đông khô vào bình chiết 2 L CO; ở trạng thái lỏng từ trong bình chứa khí được dẫn qua thiết bị truyền nhiệt làm lạnh xuống khoảng

0 - 1C, sau đó được bơm cao áp (hỗ trợ bởi dòng khí có áp lực 10 bar) nén vào

bình chiết tới áp suất 316 bar đã đặt trước Tiến hành gia nhiệt đến 47 C dé dua

Trang 33

điều áp, tháo dịch chiết vào bình tách có áo gia nhiệt Tại đây, CO; hóa hơi thoát

ra ngoài, phần cặn thu được là lipid trung tính

- Giai đoạn 2:

Trong giai đoạn 2 của quá trình chiết xuất, dung môi phụ trợ ethanol (8,14%)

được bố sung bằng cách đồ trực tiếp vào bình chiết hay thông qua bơm với tốc

độ bơm dung môi phụ trợ 0,8 ml/ phút CO; được bơm cao áp nén vào bình chiết

tới áp suất 368 bar Tiến hành gia nhiệt đến 51C để đưa CO; về trạng thái siêu tới hạn Sau 120 phút, giảm áp suất về 45 bar bằng van điều áp, tháo dịch chiết vào bình tách có áo gia nhiệt Tai day, CO, hoa hoi thốt ra ngồi, phần cặn thu được là PL

2.2.1.2 Tỉnh chế PL

- Nguyên tắc: Lipid trung tính tan trong ethyl acetate lạnh, PC ít tan nên khi

khuấy trộn PL với ethyl acetate lạnh thì lipid trung tính sẽ hòa tan trong ethyl

acetate còn PC không tan - Tiến hành:

Sản phẩm PL thu được sau quá trình chiết tách bằng SC-CO; đươc khuây trôn voi ethyl acetate lạnh, tỷ lệ 1 : 2 (mg/ml) ở nhiệt độ -10 °%C + -20 °C Sau 1 giơ,

tiên hanh gan bo lơp ethyl acetate ở phía trên (dùng phương pháp ly tâm) Lặp |ai quá trình trên cho đến khi dung dich et hyl acetate gân như không mau (4 lần)

Căn PL giau PC đươc đông khô đề loai dung môi va bao quan trong ]o tôi mau ơ nhiét đô lanh

2.2.1.3 Hydrogen hóa PL

Trang 34

hydrogen héa lecithin cua D.M.Philips [12] Qui trình được mô tả tóm tắt như

sau:

Phản ứng hydrogen hóa PL được thực hiện trong thiết bị phản ứng cao áp

Parr inst voi dung tích bình phản ứng 3,75 lít (Hình 2.1)

Hình 2.1: Thiét bị phản ứng cao áp Parr Hình 2.2: Máy cô quay Heidolph

- Cho 100g PL, 1500ml metanol và 3g xúc tác Niken-Raney đã hoạt hoá

vào bình phản ứng, vặn chặt nắp bình Tiến hành đuôi không khí bằng khí nitơ ở

áp suất 10 — 20 bar khoảng 5 - 6 lần

- Sau khi đuôi hết không khí, dùng hidro ở áp suất 10 — 20 bar đuôi nitơ ra

khỏi môi trường phản ứng 5 - 6 lần Sau đó, nâng dần nhiệt độ và áp suất của hệ lên giá trị các giá trị tương ứng tại 50 °C va 2 bar Trong suốt quá trình phản ứng,

áp suất và nhiệt độ được giữ không đôi

Trang 35

- Dung dịch sau phản ứng được cô cất lọai dung môi bằng máy cất cô quay

chân không ở áp suất 6,6 mPa, 40°C, 4h (Hình 2.2) Sản phẩm được bảo quản ở

nh†êt đô lanh trong lo tôi mau

2.2.1.4 Lọc tiệt khuẩn và loại tạp chất

Qúa trình lọc tiệt khuẩn và loại tạp chất của sản phẩm thu được sau khi

hydrogen hóa PL diễn ra như sau:

- Lọc dung dịch thu được qua màng lọc polycarbonat 0,08 um qua áp lực sử

dụng bơm chân không

- Đem cất cô quay dung dịch trên bằng máy cô quay chân không ở ở áp suất 6,6

mPa, 40 °C trong 4 giờ Cặn thu được để trong bình hút âm chứa silicagel Sản

phẩm được bảo quản lạnh đưới -10 °C và trong lọ thủy tinh tối màu, có sục khí

Np

2.2.2 Xác định thành phần và biện giải cấu trúc của PL lòng đỏ trứng 2.2.2.1 Xác định thành phần của PL lòng đó trứng:

Sản phẩm PL lòng đỏ trứng được phân tích thành phan bằng phương pháp HPLC-ELSD có so sánh với chất chuẩn được tiễn hành tại phòng thí nghiệm các hợp chất sinh học, viện Krict, Hàn Quốc với các điều kiện sau:

Dung dich A: 1341,6 g n-hexan + 334,1g 2-propanol + 39,4 g acid acetic + 1,45

g triethylamine (hoac 2,0 ml triethylamine)

Dung dịch B: 663,5 g 2-propanol + 140,0 g nước + 15,8 g acid acetic + 0,58 g triethylamine

Dựng môi: n-hexan, 2-propanol, trietfhylamine (23: 23:4) (Đề tránh tách thành 2 pha, trộn 2-propanol với nước trước sau đó thêm n-hexan vào)

Trang 36

Bang 2.1: Chế độ gradient của pha động Các Thời gian | Tôc độ dòng | Dung dịch | Dung dich B bước (phút) (ml/phút) A(%) (%) 1 0 1,0 95 5 2 5,0 1,0 80 20 3 8,5 1,0 60 40 4 15,0 1,0 0 100 5 17,5 1,0 0 100 6 17,6 1,0 95 5 7 21,0 1,0 95 5 8 22,0 2,0 95 5 9 27,0 2,0 95 5 10 29,0 1,0 95 5

Dung dịch mâu thứ: Cho 100 mg mẫu thử vào bình định mức 25 ml Hòa tan

trong dung mơi và pha lỗng Tính tỉ lệ % các chất theo diện tích pic

Trang 37

Tại phòng thí nghiệm các hợp chất sinh học, viện Krict, Hàn Quốc, tiễn hành phân tích và biện giải cấu trúc của sản phẩm thu được sau khi tinh chế bằng cthyl

acetate

Phân tích thành phần acid béo

Tiến hành phân tích thành phần acid béo của PL trứng bằng phương pháp GC-M§S có thực hiện methyl hóa các acid béo theo chuyên luận về xác

định thành phân acid béo của chất béo của USP34-NF29

Hệ thống sắc ký có điều kiện như sau:

- Detector: detector 1Ion hóa ngọn lửa, nhiệt độ 260 °C

- Cột DB-5: 0.53 mm x 30 m Duy trì nhiệt độ cột ở 70 °C sau khi tiêm mẫu, sau đó tăng dần nhiệt độ lên đến 240 °C với tốc độ 5 °C/ phút, và cuối cùng duy trì ở nhiệt độ 240 °C trong 5 phút Sau đó, nhiệt độ được giữ ở 220 °C - Khí mang: khí helium

* Phân tich cau tric bang LC-MS

Tiến hành xác định cau trúc của các thành phan trong mau PL bang

phương phap sac ky long — khdéi phé (LC-MS)

Mẫu được phân tách và tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lỏng, sau đó mẫu

được đưa vào máy khối phố để xác định khối lượng nguyên tử của chất có

trong mẫu

- Mẫu PL được tiễn hành phân tích bằng sắc ký lỏng, hệ dung môi pha động

là methanol: nước

- Dung dich 6 đầu ra của máy sắc ký được đưa vào máy khối phổ và các

Trang 38

m/z khác nhau thành từng phân riêng biệt Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau, trong đó bộ Q; và Q› làm nhiệm vụ phân tích (Hình 2.3) Q: Q) Q; Detector > bh r „ Vv Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực chập ba

Q; sẽ tách các ion va phan tich cho ra khéi phé MS 1an 1, mot số ion được chọn lọc tử đây được đi vào Q; và tại đầy được phân mảnh tiếp tạo ra các lon nhỏ hơn Các ion mới được hình thành được đưa đến Q; tách riêng và tới

đetector và cho hình ảnh khối phô MS lần 2 Kỹ thuật phân tích này gọi là

phân tích khối phố hai lần MS/MS [4] - _ Biện giải phổ khối:

Trên phố khối, đỉnh phân tử là đỉnh có số khối lớn nhất cho biết khối lượng

phân tử của chất Từ khối lượng phân tử của các mảnh chìa khóa suy ra cau tạo của từng mảnh Biết câu tạo nhiều mảnh suy ra câu trúc phân tử của hợp chất [2]

2.2.3 Các phương pháp đánh giá tiêu chuẩn cơ sở của PL lòng đỏ trứng làm nguyên liệu chế tạo dược phẩm thuốc tiêm dạng liposom

2.2.3.1 Kim loại năng

* Xác định giới hạn kim loại nặng theo phương pháp 2, phụ lục kim loại nặng

<231> của được điền Mỹ 2011 (USP34-NF29)

* Nguyên tắc: dựa vào phản ứng tạo màu của ion kim loại với thioacetamid * Địa điểm thí nghiệm: Phòng hóa lý 2 (Kiém nghiệm nguyên liệu) — Viện kiêm nghiệm thuốc trung ương

Trang 39

Lay 2 ml dung dich Pb”* chuan (20ug Pb) vao ống so màu thê tích 50 ml, thêm nước tới thể tích 25 ml, điều chỉnh bằng dung dich acid acetic 1 N hoac

dung dịch NHNO; 6 N tới pH 3 - 4, thêm nước tới thê tích 40 ml, trộn lẫn

- Dung dich thu

Lay 2 g mẫu thử cho vào nổi nung thích hợp, thêm acid sulfuric vừa đủ để

làm ướt mẫu thử Đốt cháy ở nhiệt độ thấp đến khi toàn bộ đã bị carbon hóa

Thêm vào hỗn hợp da carbon hóa 2 ml acid nitric va 5 giot acid sulfuric, va

làm nóng cần thận đến khi không còn xuất hiện khói màu trăng Làm nóng

chảy trong lò nung ở 500°C - 600 °C cho đến khi carbon bị cháy hoàn toàn

Làm mát, thêm 4 ml acid HCI 6 N, đậy nắp và đặt trong bồn hơi nước trong

15 phút, mở nắp và từ từ bốc hơi hết trong bồn hơi nước đến khô Làm âm dư

lượng bang 1 giọt acid HCI, thêm 10 ml nước nóng, để yên trong 2 phút

Thêm từng giọt acid HCI 6 N đến khi dung dịch kiểm hóa với giấy quỳ, pha loãng với nước đến 25 ml và điều chỉnh bằng acid HCI 1 N đến pH trong

khoảng 3,0 — 4, 0 Lọc nếu cần, rửa lò nung và giấy lọc bang 10 ml nước, gom dịch lọc vào ống so màu 50 ml, pha loãng bằng nước đến 40 ml va tron lên

- Tiển hành:

Với mỗi ống có chứa các mẫu chuẩn và mẫu thử, thêm 2 ml đệm acetatc

pH 3.5, thêm 1, 2 ml thioacetamide-glycerin base , pha loãng bằng nước đến

50 mỊ, trộn lên, đề yên trong 2 phút và quan sát xuống đưới với nền trắng - _ Yêu cầu: Màu nâu trong ống thử không được đậm hơn màu trong ống mẫu 2.2.3.2 Chỉ số acid

- Địa điểm thí nghiệm: Phòng hóa lý 2 (Kiểm nghiệm nguyên liệu) - Viện kiểm

Trang 40

- Chỉ số acid là số miligam kali hydroxyd cần thiết để trung hòa các acid tự do

chứa trong 1 gam chế phẩm

- Chỉ số acid của PL được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid- base, theo

phụ lục về chỉ số acid <401> của USP34-NF29

- Tiến hành:

Lay chính xác 2g PL cho vào bình nón 250ml, hòa tan PL bằng 50 ml ether

petroleum, sau đó thêm vào dung dich nay 50 mÌ alcohol Trước tiên, trung hòa

phenolphtalein bằng dung dịch NaOH 0.1N Thêm phenolphtalein TS, chuẩn độ

bằng dung dich NaOH 0.1 N đến khi màu hồng xuất hiện tồn tại trong 5 giây Tính lượng KOH cần để trung hòa acid tự do trong 1.0 g mẫu thử theo công

thức:

56,11xNxV

W

Trong đó:

N: Nông độ của dung dịch NaOH

V: Thẻ tích dung dịch NaOH thu được trong phép chuẩn độ (ml)

W: khối lượng mẫu thử (g) 2.2.3.3 Chỉ số peroxyd (PV)

- Địa điểm thí nghiệm: Phòng hóa lý 2 (Kiểm nghiệm nguyên liệu) — Viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương

- Chỉ số peroxyd là số mili đương lượng gam oxy hoạt tính biểu thị lượng

peroxide chứa trong 1000 g chế phẩm Đơn vị đo: meq/ kg