Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất của lectin từ hạt đậu đỏ tây (phaseolus vulgais) và đề xuất hướng ứng dụng

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA LECTIN TỪ HẠT ĐẬU ĐỎ TÂY (PHASEOLUS VULGAIS) VÀ ĐỀ XUẤT HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã số : 60.54.02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học:PG S T S.Trần Thị Xô Phản biện 1: GS.TS Đào Hùng Cường Phản biện 2: GS.TSKH Lê Văn Hoàng Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ k ỹ t h u ậ t họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng năm 2011 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin -Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lectin glycoprotein có hoạt tính sinh học, có khả gắn kết với tế bào hồng cầu, tương tác có chọn lọc với saccharide Lectin ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nông nghiệp, sinh hóa, vi sinh vật học, tế bào học, miễn dịch học, y dược học… Lectin có khả gây ngưng kết với tế bào vi khuẩn, nấm men nấm mốc Do vậy, lectin từ ñậu tương (SBA) ốc sên (HPA) dùng ñể nhận dạng vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis (chủng khó phân biệt với chủng Bacillus khác) [13] Lectin ñược phân bố rộng rãi thực vật, ñộng vật vi sinh vật Lectin thu nhận từ nguồn khác có cấu trúc, trọng lượng phân tử thành phần hóa học đặc tính sinh học khác Xuất phát từ lí trên, để sâu vào nghiên cứu lectin họ đậu chúng tơi chọn ñề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất lectin từ hạt đậu đỏ tây (phaseolus vulgaris) đề xuất hướng ứng dụng”, nhằm góp phần khai thác nguồn tài nguyên lectin phong phú từ nguồn thực vật Việt Nam MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Chiết tách lectin từ hạt ñậu ñỏ tây, tinh lectin - Khảo sát số tính chất lý hóa lectin - Đề xuất hướng ứng dụng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Nguyên liệu hạt ñậu ñỏ tây - Tế bào hồng cầu người - Nấm men bia - Nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm, phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein, phương pháp xác ñịnh hàm lượng gluxit tổng phương pháp Bertran, phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ lectin, phương pháp ñiện di gel polyacrylamide Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Khảo sát số thành phần hóa học hạt đậu đỏ tây mua ñịa bàn Đà Nẵng Khảo sát ñược hàm lượng lectin có đậu đỏ tây - Tăng thêm hiểu biết cấu tạo tính chất lectin họ ñậu Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng qui trình chiết tách xác định tính chất lý hóa đặc trưng lectin, từ thu nhận lectin quy mơ lớn ñể ñưa vào ứng dụng thực tế - Từ nguồn lectin nghiên cứu đặc tính ñề xuất hướng ứng dụng khác CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngồi phần mở đầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục luận văn ñược thành chương sau : Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương TỔNG QUAN 1.1 LƯỢC SỬ VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Sơ lược lịch sử lectin 1.1.2 Tình hình nghiên cứu lectin giới Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu lectin giới 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu lectin Việt Nam 1.2 SỰ PHÂN BỐ LECTIN TRONG SINH GIỚI 1.2.1 Sự phân bố lectin thực vật Ở Việt Nam tính phổ biến lectin lần ñầu tiên ñược nghiên cứu vào năm 1983 Nguyễn Thị Thịnh cộng Kết nghiên cứu 90% lồi đậu Việt Nam có chứa lectin [11] 1.2.2 Sự phân bố lectin ñộng vật 1.2.3 Sự phân bố lectin vi sinh vật 1.3 TÍNH CHẤT CỦA LECTIN 1.3.1 Thành phần hóa học, cấu trúc khối lượng phân tử lectin 1.3.1.1 Thành phần hóa học Vậy lectin có chất protein, chủ yếu glycoprotein 1.3.1.2 Cấu trúc lectin Lectin loại protein nên lectin có cấu trúc bậc 1, 2, bậc protein thông thường khác Ngồi lectin có cấu trúc khơng gian đơn giản, lectin có cấu trúc khơng gian phức tạp ñều chứa trung tâm hoạt ñộng, ñây nơi liên kết với carbohydrate ñịnh hoạt ñộ lectin Theo tác giả Bourillon (1973) gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt ñộng, số ion kim loại tham gia hoạt ñộng lectin ion Mg2+, Mn2+ 1.3.1.3 Khối lượng phân tử lectin Lectin polyme sinh học, có khối lượng phân tử lớn, khối lượng phân tử dao ñộng phạm vi rộng từ hàng ngàn cho ñến hàng trăm ngàn Dalton [30] Lectin từ nguồn gốc thực vật có khối lượng phân tử bé lectin từ rễ Urtica dioica (họ gai Urticaceae), khoảng 8,5 kDa Lectin từ số thực vật ñã ñược xác ñịnh khối lượng phân tử lectin số loài mít chi Artocarpus có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa, lectin từ lồi tảo đỏ (Plumosa plumosa) có khối lượng phân tử 150 kDa [20] 1.3.2 Các tính chất ñặc trưng lectin 1.3.2.1 Tính tan lectin 1.3.2.2 Sự tương tác lectin với ñường Khả tương tác với đường tính chất điển hình lectin Lectin liên kết với phân tử ñường ñơn lẫn gốc ñường nằm bề mặt tế bào Các loại ñường glucose, galactose, manose … có khả tương tác với nhiều loại lectin [20] Khả tương tác ñặc hiệu lectin - ñường ñã ñược ứng dụng nhiều nghiên cứu tế bào học, huyết học miễn dịch học 1.3.3 Đặc tính sinh học miễn dịch học lectin 1.3.3.1 Khả gây ngưng kết tế bào 1.3.3.2 Khả kích thích kìm hãm phân bào 1.3.3.3 Các ñịnh kháng nguyên nhận biết 1.4 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu ứng dụng sớm nhất, cho ñến cịn áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nhóm máu lectin cho kết nhanh, xác mà khơng cần dùng huyết mẫu Lectin sử dụng cơng cụ chẩn đốn có hiệu (dựa vào khả tác dụng ñặc hiệu lên số loại vi sinh vật), kết hợp với xét nghiệm thơng thường khác để nâng cao giá trị chẩn ñoán bệnh Do bề mặt vi khuẩn mang gốc đường, lectin kết hợp với vị trí liên kết tiềm này, thêm vào tính đặc hiệu khiến chúng trở thành cơng cụ hữu ích việc nhận dạng vi khuẩn [22] Do có khả liên kết với ñường hợp chất chứa ñường (thành phần cấu tạo quan trọng bề mặt tế bào), lectin có tiềm ứng dụng lớn sinh - y học Việc nghiên cứu lựa chọn lectin tương tác ñặc hiệu với loại vi khuẩn giúp ích việc định danh vi sinh vật 1.5 TỔNG QUAN VỀ ĐẬU ĐỎ TÂY Đặc tính thực vật: đậu tây (Phaseolus vulgaris) thuộc họ thực vật Fabiaceae Cây thuộc loại thân thảo thấp hay dây leo Hàm lượng protein ñậu tây chiếm khoảng 17-23% trọng lượng chất khô [24] Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu hạt ñậu ñỏ tây (Phaseolus vulgaris) Thu mua Trung tâm Thương nghiệp, thành phố Đà Nẵng 2.1.2 Hóa chất Những hố chất sử dụng nghiên cứu hố chất có ñộ tinh khiết cao, sử dụng phân tích, ñược mua hãng Sigma, Merk Trung Quốc Các dụng cụ hóa chất thuộc trung tâm cơng nghệ sinh học mơi trường thuộc đại học Bách Khoa Đà Nẵng trung tâm y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng - Hồng cầu nhóm máu người khoa Huyết học, bệnh viện Đa Khoa Đà Nẵng cung cấp 2.1.3 Dụng cụ thiết bị Sử dụng dụng cụ thiết bị thuộc trung tâm công nghệ sinh học mơi trường thuộc đại học Bách Khoa Đà Nẵng trung tâm y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm [14] 2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein 2.2.2.1 Xác định hàm lượng protein thơ [14] 2.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein tổng số phương pháp ño quang [6] Xác ñịnh hàm lượng protein tổng số ño hấp thụ quang λ=280 λ=260 (nm) máy quang phổ kế hiệu UV (SmartSpecTM Plus Spectrophotometer - Bio Rad) Hàm lượng protein tính theo cơng thức PC (pr) = (1,55*A280 - 0,77*A260)* D Trong đó: (mg/ml) PC (pr): Nồng độ protein (mg/ml) A260, A280 : Độ hấp thụ quang mẫu λ = 260 (nm) λ = 280 (nm) D: Độ pha loãng dung dịch mẫu (lần) 2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng gluxit tổng phương pháp Bertran 2.2.4 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ lectin [13] Hoạt ñộ lectin ñược xác ñịnh theo phương pháp ngưng kết hồng cầu Gebauer nhựa ñáy nhọn microtitter Cách tiến hành: Dùng micropipetter cho vào giếng nhựa microtitter 50 µl đệm PBS pH 7,2 Lấy 50 µl mẫu thí nghiệm cho vào giếng thứ trộn đều, lấy 50 µl đưa vào giếng thứ hai trộn ñều, lại lấy 50 µl từ giếng thứ hai cho vào giếng thứ 3… giếng thứ 10 (lấy 50 µl bỏ đi) Như ta có nồng độ mẫu pha lỗng 2n lần (n số giếng pha lỗng, ñây giếng thứ 10) Giếng thứ 11 12 khơng có mẫu sử dụng làm mẫu đối chứng Cho vào giếng nhựa 50 µl hồng cầu nhóm máu Hồng cầu nhóm máu trước sử dụng rửa nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) từ 2-3 lần (ly tâm 3000 rpm/5’) pha lỗng nồng độ 2-5% nước muối sinh lý Vậy tổng thể tích mẫu hồng cầu giếng 100 µl 10 Để yên nhựa chứa mẫu lectin hồng cầu nhiệt độ phịng từ 30 phút đến giờ, tiến hành ñọc kết Kết ñược ñọc dựa ñối chiếu với giếng ñối chứng Giếng đối chứng có tượng hồng cầu tụ gọn xuống ñáy giếng Giếng mà hồng cầu tạo lớp màng mỏng khơng tụ gọn xuống đáy giếng chứng tỏ có tượng ngưng kết, nghĩa có hoạt tính lectin Kết đọc giếng cuối có ngưng kết Hoạt tính gây ngưng kết tính sau : - Hoạt độ chung (HĐC) lectin (viết tắt HAA) ñược xác ñịnh nghịch ñảo ñộ pha loãng lớn dịch lectin mà cịn có khả gây ngưng kết toàn lượng hồng cầu [28] HĐC (Đv/ml) = Trong 2n V n số giếng cịn hoạt tính lectin V : thể tích mẫu thí nghiệm (µl) - Hoạt ñộ riêng (HĐR): giá trị hoạt ñộ lectin mg protein HĐR (Đv/mgpr) = HĐC mgpr 2.2.5 Phương pháp chiết tách tinh lectin 2.2.6 Phương pháp ñiện di gel polyacrylamide [27] 2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG TÁC CỦA ION KIM LOẠI - LECTIN VÀ CÁC LOẠI ĐƯỜNG - LECTIN 2.3.1 Tương tác ion kim loại - lectin 2.3.2 Tương tác loại ñường - lectin 12 3.2 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH LECTIN 3.2.1 Nghiên cứu phương pháp chiết tách Q trình chiết tách thực theo sơ đồ sau: Bột đậu đỏ Hịa đệm PBS (pH =7,2) Tỷ lệ bột ñậu: ñệm 1:5 Ly tâm lạnh (40C) 6000 vịng/ 15phút Cặn Dịch chiết protein thơ Với mục tiêu khảo sát điều kiện chiết dịch lectin thơ ñạt hiệu cao, tiến hành theo phương pháp khác nhau: Lấy lượng bột ñậu ñỏ (50g) hịa tan vào lượng đệm (250ml) tiến hành chiết theo phương pháp khác nhau: - Phương pháp 1: Bột ñậu sau hịa đệm tiến hành khuấy (30 phút) - Phương pháp 2: Bột đậu sau hịa đệm tiến hành siêu âm máy siêu âm (30 phút) - Phương pháp 3: Bột đậu sau hịa đệm tiến hành làm lạnh đơng - tan giá - lạnh đơng - tan giá Sau chiết tách dịch protein thô phương pháp trên, tiến hành xác ñịnh hàm lượng protein thơ theo phương pháp đo quang mục (2.2.2.2) Kết thu ñược bảng 3.2 13 Bảng 3.2: Hàm lượng protein dịch chiết thô Phương pháp Hàm lượng protein (mg/ml) 49,19 51,83 49,90 Hàm lượng protein thô thu nhận theo phương pháp cao sử dụng tác nhân vật lý sóng siêu âm có tác dụng phá vỡ tế bào nên protein giải phóng nhiều Nhằm xác ñịnh hoạt ñộ lectin thu ñược theo phương pháp tiến hành thử khả ngưng kết với hồng cầu theo phương pháp trình bày mục 2.2.4 Kết ñược thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Hoạt ñộ lectin mẫu thu nhận theo phương pháp Nhóm HĐC (đv/ml) HĐR (đv/mgpr) máu 3 A 1280 2560 2560 26,02 49,39 51,3 B 1280 2560 2560 26,02 49,39 51,3 O 640 640 640 13,01 12,35 12,8 AB 2560 2560 2560 52,04 49,39 51,3 1- Mẫu thu ñược theo phương pháp 2- Mẫu thu ñược theo phương pháp 3- Mẫu thu ñược theo phương pháp Để so sánh hoạt ñộ chung lectin thu ñược mẫu tơi xây dựng đồ thị hình 3.2 3.3 14 HĐC (ñv/ml) 3000 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2500 Mẫu 2000 Mẫu 1500 1280 Mẫu 1280 1000 640 640 640 500 A B O AB Nhóm máu Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hoạt ñộ chung mẫu HĐR (đv/mg) dịch lectin thơ 60 50 49.39 51.3 49.39 51.3 52.0449.39 51.3 40 Mẫu Mẫu 30 26.02 26.02 Mẫu 20 13.01 12.3512.8 10 A B O AB Nhóm máu Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn hoạt ñộ riêng mẫu dịch lectin thô 15 Kết cho thấy hoạt ñộ chung lectin mẫu thấp so với mẫu lại Trong ñó mẫu mẫu có hoạt ñộ chung ngưng kết nhóm máu Mẫu có HĐR thấp so với mẫu Mẫu có HĐR cao so với mẫu lại Qua chiết tách dịch lectin theo phương pháp cho thấy phương pháp ñạt hiệu suất chiết tách cao, nhiên phương pháp lại tiêu tốn nhiều thời gian nhiên liệu so với phương pháp Dựa vào kết thu trên, chúng tơi chọn mẫu chiết tách theo phương pháp ñể thực nghiên cứu 3.2.2 Khảo sát tỷ lệ ñệm dùng ñể chiết Nhằm khảo sát tỷ lệ ñệm PBS dùng ñể chiết tách lectin đạt hiệu cao chúng tơi tiến hành chiết tách lectin theo phương pháp ñã chọn phần sử dụng ñệm PBS (pH = 7,2) với mẫu 1,2,3 tương ứng theo tỷ lệ nguyên liệu ñệm khác 1:4; 1:5; 1:6 ñược chiết lượng bột ñậu 50g Sau chiết tách chúng tơi tiến hành xác định hàm lượng protein tổng hoạt ñộ lectin Kết thu ñược ñược biểu diễn ñồ thị hình 3.4 16 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hoạt ñộ lectin mẫu với tỷ lệ ñệm chiết khác Kết hình 3.4 thấy lượng đệm tăng lượng protein thu nhận ñược tăng theo Hàm lượng protein thu nhận ñược nhiều mẫu không lớn nhiều so với mẫu Đồ thị cho thấy hoạt ñộ riêng lectin mẫu lớn (49,911đv/mgpr) so với mẫu cịn lại 17 Trên sở so sánh hàm lượng protein tổng số hoạt ñộ lectin thu ñược theo tỷ lệ đệm khảo sát khác nhận thấy sử dụng tỷ lệ bột ñậu ñỏ: ñệm PBS 1:5 cho hiệu chiết tách cao Vì tơi chọn tỷ lệ đệm dùng để chiết tách dịch protein lectin 1:5 ñể chiết tách 3.3 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA LECTIN 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt độ lectin Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ lectin Nhiệt độ tối thích cho lectin hoạt động khoảng 300C ÷ 400C Kết phù hợp với kết công bố số tác giả nghiên cứu lectin họ ñậu [1] 18 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ lectin Kết hình 3.6 cho thấy lectin ñậu ñỏ tây biểu hoạt ñộ cao vùng pH trung tính kiềm, pH = ÷ Trong khoảng pH hoạt ñộ cao 2560ñv/ml Theo kết nghiên cứu tác giả Trương Văn Châu lectin chiết tách từ hạt đậu cove có khoảng pH tối thích ÷ 8, tương tự với kết thu nhận nghiên cứu Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ lectin 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại ñến hoạt ñộ lectin Bảng 3.4: Ảnh hưởng ion kim loại ñến hoạt ñộ lectin Muối Nồng ñộ kìm hãm Nồng ñộ kích thích BaCl2 - 0,25M CuSO4 - 0,0625M Mg(NO3)2 - 0,25M CaCO3 - 0,25M KCl - - 19 Ghi chú: dấu “-“ bảng biểu thị phản ứng không bị kìm hãm Từ kết thực nghiệm cho thấy muối KCl khơng ảnh hưởng đến hoạt độ lectin Các loại muối cịn lại, thành phần chúng có cation Ba2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+ có ảnh hưởng ñến hoạt ñộ lectin Sự có mặt ion làm tăng hoạt ñộ lectin Tuy nhiên khả kích thích cation Cu2+ mạnh nồng độ thấp 0,0625M có tác dụng làm tăng hoạt độ lectin 3.3.4 Khảo sát tương tác ñặc hiệu với loại ñường Kết thu ñược bảng 3.5 Bảng 3.5: Tương tác ñặc hiệu ñường với loại lectin Tên loại đường Nồng độ kìm hãm D - Glucose - D - Manose - D - Arabinose - Lactose - Saccharose - Ghi chú: - khơng kìm hãm Qua kết thu thấy loại ñường sử dụng D-glucose, D-manose, D-arabinose, lactose, saccharose khơng có loại đường có khả ức chế rõ rệt ñến hoạt ñộ lectin ñậu ñỏ tây Kết tương ñồng với nghiên cứu trước lectin đậu đỏ tây khơng tương tác với loại đường đơn mà tương tác với oligosaccharide polysaccharide [20] 20 3.4 TINH SẠCH LECTIN ĐẬU ĐỎ TÂY Tiến hành tinh lectin thơng qua sơ đồ tinh lectin sau Bột ñậu ñỏ tây Chiết rút ñệm PBS, pH 7,2 tỉ lệ bột ñậu: ñệm PBS 1:5 Khuấy, siêu âm 30 phút; li tâm lạnh (4oC), 6000 vòng/phút Ly tâm lạnh (40C), 6000 vòng/ 15phút Cặn (bỏ) Dịch chiết protein thô chứa lectin Kết tủa protein etanol 96% (tỉ lệ dịch chiết: etanol 1:3, t = 30 phút, 40C) Dịch tủa protein Ly tâm lạnh (40C), 6000 vòng/ 15phút Dịch (bỏ) Thu tủa protein Hòa tan lại ñệm PBS (pH = 7,2) Chế phẩm lectin thô Chạy qua cột sắc ký Silicagel Chế phẩm lectin 3.4.1 Xử lý sơ mẫu thô Mẫu dịch lectin sau tiến hành sơ bước kết thu có hàm lượng protein thơ 22,03mg/ml hoạt ñộ lectin 2560ñv/ml ... trên, để sâu vào nghiên cứu lectin họ đậu chúng tơi chọn đề tài nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất lectin từ hạt ñậu ñỏ tây (phaseolus vulgaris) ñề xuất hướng ứng dụng? ??, nhằm... nguyên lectin phong phú từ nguồn thực vật Việt Nam MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Chiết tách lectin từ hạt ñậu ñỏ tây, tinh lectin - Khảo sát số tính chất lý hóa lectin - Đề xuất hướng ứng dụng ĐỐI TƯỢNG VÀ... tạo tính chất lectin họ đậu Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng qui trình chiết tách xác định tính chất lý hóa đặc trưng lectin, từ thu nhận lectin quy mơ lớn để đưa vào ứng dụng thực tế - Từ