Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sulforaphane có tác dụng phòng chống vi khuẩn helicobacter pylori từ một số rau họ cải của việt nam

MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI RAU HỌ CẢI 1.1.1 Thành phần hoạt chất loại rau họ Cải .3 1.1.2 Giới thiệu số rau họ cải Việt Nam 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SULFORAPHANE 1.2.1 Giới thiệu glucosinolate .8 1.2.2 Enzyme myrosinase .14 1.2.3 Sự hình thành, cấu trúc hóa học tính chất hóa lý sulforaphane 16 1.2.4 Tính chất dƣợc lý có lợi cho sức khỏe Sulforaphane .17 1.2.5 Cơ chế tác dụng Sulforaphane 19 1.2.6 Tính an toàn Sulforaphane 20 1.2.7 Vi khuẩn Helicobacter pylori 20 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN HOẠT CHẤT SINH HỌC SULFORAPHANE 23 1.3.1 Các nghiên cứu giới 23 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc .30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 VẬT LIỆU 33 2.1.1 Nguyên liệu rau họ cải 33 2.1.2 Hóa chất 33 2.1.3 Thiết bị 33 2.2 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 34 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 34 2.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng hoạt chất 35 2.2.4 Phƣơng pháp thử tác dụng diệt vi khuẩn Helicobacter pylori(HP) 38 2.2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 39 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn rau nguyên liệu thời điểm thu hoạch thích hợp cho thu hồi hoạt chất Sulforaphane với hàm lƣợng cao .39 2.3.2 Nghiên cứu ứng dụng Enzyme myrosinase thủy phân glucosinolates rau nguyên liệu để nâng cao hàm lƣợng hoạt chất 40 2.3.3 Khảo sát số yếu tố chiết xuất ảnh hƣởng tới khả chiết xuất thu nhận sulforaphane từ số rau họ cải Việt Nam 40 2.3.4 Bƣớc đầu đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn Helicobacter pylori chế phẩm có chứa hoạt chất sinh học điều kiện in vitro 42 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Ảnh hƣởng lựa chọn rau nguyên liệu thời điểm thu hoạch thích hợp tới hàm lƣợng hoạt chất Sulforaphane (SFN) .43 3.1.1 Ảnh hƣởng lựa chọn rau nguyên liệu đến hàm lƣợng hoạt chất SFN 43 3.1.2 Ảnh hƣởng độ tuổi rau nguyên liệu thu hoạch đến hàm lƣợng hoạt chất SFN 45 3.2 Nghiên cứu ứng dụng enzyme myrosinase thủy phân glucosinolates rau nguyên liệu để nâng cao hàm lƣợng hoạt chất sulforaphane 47 3.2.1 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane .47 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 49 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 51 3.2.4 Ảnh hƣởng pH tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 52 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố công nghệ tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 54 3.3.1 Ảnh hƣởng công suất siêu âm tới khả chiết xuất hoạt chất SFN .54 3.3.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tới khả chiết xuất hoạt chất sinh học sulforaphane 57 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ trích ly tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 59 3.3.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 60 3.3.5 Ảnh hƣởng thời gian trích ly tới khả chiết xuất hoạt chất SFN .62 3.3.6 Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết Sulforaphane quy mô phòng thí nghiệm .64 3.4 Kết tác dụng diệt Helicobacter pylori 66 KẾT LUẬN 67 ĐỀ XUẤT 68 PHỤ LỤC 74 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM GIẤY XÁC NHẬN ĐĂNG BÁO LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Tất Thắng Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, học viên, sinh viên làm việc phòng thí nghiệm Trung tâm kiểm tra chất lƣợng Nông sản thực phẩm Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu tham khảo luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2015 Tác giả luận văn ký tên Dƣơng Thị Thu LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc động viên giúp đỡ lớn nhiều thầy, cô giáo, gia đình bạn bè bảo động viên từ cán nghiên cứu phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu kiểm tra chất lƣợng Nông sản thực phẩm, Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm nhận đƣợc giúp đỡ bạn bè ngƣời thân Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy Cô hƣớng dẫn: TS Nguyễn Tất Thắng (Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch) PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên (Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội) quan tâm bảo, tận tình giúp đỡ động viên suốt thời gian nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu chế biến Nông sản thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài nghiên cứu Và xin chân thành cảm ơn tất bạn bè, ngƣời thân theo dõi, giúp đỡ động viên để hoàn thành tốt luận án thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn bạn đồng môn lớp 13B.CNSH đồng hành, trải qua năm Học viên dƣới mái trƣờng ĐHBKHN thân yêu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình toàn thể bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi, giúp hoàn thành tốt Luận văn Hà nội, ngày 20 tháng năm 2015 Dƣơng Thị Thu Hằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên Ký hiệu Helicobacter pylori H pylori Sulforaphane SFN Glucosinolate GLS Isothiocyanate ITC Rau mầm RM Trƣởng thành TT Chất khô CK sắc ký lỏng cao áp HPLC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Hàm lƣợng glucosinolate số loại rau họ cải .4 Bảng 1.2: Thành phần hóa học 100 gam rau súp lơ Bảng 1.3: Tên thông thƣờng tên hoá học GLS thƣờng tìm thấy rau thuộc họ cải [34] 10 Bảng 1.4: Một số ITCs đƣợc nghiên cứu hoạt tính chống ung thƣ 14 Bảng 1.5 Một số nghiên cứu chiết xuất chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ siêu âm .28 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng lựa chọn rau nguyên liệu đến hàm lƣợng hoạt chất sulforaphane 43 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng độ tuổi rau nguyên liệu thu hoạch đến hàm lƣợng hoạt chất SFN 45 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 48 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 50 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 51 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng pH tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 53 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng công suất siêu âm tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 54 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng loại dung môi tới khả chiết xuất hoạt sulforaphane 56 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 58 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng nhiệt độ trích ly tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 59 Bảng 3.11: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả chiết xuất hoạt chất SFN 61 Bảng 12: Ảnh hƣởng thời gian trích ly đến khả chiết xuất sulforaphane 62 Bảng 3.1: kết đo đƣờng kính vòng vô khuẩn hoạt chất 66 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Công thức hoá học chung glucosinolate .9 Hình 1.2: Sinigrin sản phẩm thủy phân sinigrin 11 Hình 1.3: Một số sản phẩm thuỷ phân GLS .12 Hình 1.4: Cấu trúc hoá học chung isothiocyanate 13 Hình 1.5: Cơ chế glucosinolate xúc tác enzyme myrosinase 15 Hình 1.6 Quá trình chuyển hóa Glucoraphanin thành Sulforaphane thực vật 16 Hình 1.7 Cấu trúc sulforaphane .17 Hình 2.1: Đƣờng chuẩn sinigrin 37 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn sulforaphane .38 Hình 3.1 Ảnh hƣởng lựa chọn rau nguyên liệu đến hàm lƣợng hoạt chất sulforaphane 44 Hình 3.2 Ảnh hƣởng độ tuổi rau nguyên liệu thu hoạch đến hàm lƣợng hoạt chất SFN 46 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 48 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 50 Hình 3.5 Ảnh hƣởng thời gian tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 52 Hình 3.6 Ảnh hƣởng pH tới trình thủy phân glucosinolates tạo hoạt chất sulforaphane 53 Hình 3.7 Ảnh hƣởng công suất siêu âm tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 55 Hình 3.8: Ảnh hƣởng loại dung môi tới khả chiết xuất hoạt sulforaphane 57 Hình 3.9 Ảnh hƣởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 58 Hình 3.10: Ảnh hƣởng nhiệt độ trích ly tới khả chiết xuất hoạt chất sulforaphane 60 Hình 3.11: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả chiết xuất hoạt chất SFN 61 Hình 12: Ảnh hƣởng thời gian trích ly đến khả chiết xuất hoạt chất SFN 63 Hình 3.13 Quy trình công nghệ chiết xuất thu nhận hoạt chất sulforaphane 64 MỞ ĐẦU Ngày không phủ nhận đƣợc tầm quan trọng công nghệ sinh học kinh tế quốc dân nƣớc ta nói riêng giới nói chung Việt Nam nƣớc nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển thực vật đƣợc coi kho tàng vô giá nguồn hợp chất tự nhiên nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nƣớc nhà Trong năm gần đây, công nghệ tách chiết hợp chất từ thực vật không ngừng phát triển bƣớc đầu đạt đƣợc thành đáng kể Trên giới từ lâu ngƣời ta ứng dụng công nghệ để sản xuất chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất phục vụ lợi ích ngƣời Những nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật phát triển từ năm 1950 Có khoảng 30.000 hợp chất đƣợc chiết xuất từ thực vật có hoạt tính có giá trị sống Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh viêm loét ung thƣ dày vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori) gây ngày phổ biến Vi khuẩn nguyên nhân gây bệnh chủ yếu viêm, loét ung thƣ dày chiếm khoảng 50% dân số giới Các chủng H pylori mang gen CagA (+) gây độc tế bào chiếm tỉ lệ cao (70-100%) Sulforaphane sản phẩm thủy phân enzym từ glucoraphanin đƣợc nhiều nghiên cứu giới chứng minh có vai trò quan trọng kiểm soát ngăn ngừa hay phong tỏa hình thành phát triển ung thƣ Chất đƣợc chứng minh có tác dụng làm giảm di chứng vi khuẩn H pylori có hiệu ngăn ngừa khối u dày vi khuẩn gây Hoạt chất sinh học sulforaphane có mặt với hàm lƣợng cao hầu hết loại rau họ cải (Brassicacea) nhƣ cải xanh, cải bắp, súp lơ, cải brussel, cải xanh cải xoăn Công nghệ tổng hợp hoá dƣợc ngày phát triển mạnh mẽ, tạo biệt dƣợc khác sử dụng công tác phòng, chữa bệnh, nhờ giảm tỷ lệ tử vong nhiều nhiên phƣơng pháp tốn kém, nhiều thời gian, sử dụng Nhận xét: Kết nghiên cứu cho thấy pH khoảng 7,0 - 7,5 hàm lƣợng GLS chuyển hóa với hiệu suát cao, sản phẩm chủ yếu sulforaphane với hàm lƣợng đạt 863,5 mg/ 100gCK rau mầm cải 1857,2 mg/ 100gCK rau mầm súp lơ xanh Kết nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết công bố Mc Gregor et al (1983) Jan Jezek et al, (1999) cho khoảng pH thích hợp cho trình tách chiết SFN 7,0 Kết luận: Chúng chọn pH môi trƣờng cho trình tách chiết SFN 7,0 3.3.5 Ảnh hƣởng thời gian trích ly tới khả chiết xuất hoạt chất SFN Theo thời gian trích ly hợp chất nhóm glucosinolate bị chuyển hóa, cấu tử SFN đƣợc hình thành tăng dần hàm lƣợng Để xác định thời gian tối ƣu trình trích ly SFN, thí nghiệm đƣợc tiến hành điều kiện công nghệ nhƣ phần 3.2.3.2 với mẫu rau mầm cải rau mầm súp lơ xanh đƣợc xác định Kiểm tra lƣợng GLS bị chuyển hóa lƣợng SFN tạo thành Kết đƣợc trình bày bảng 3.12 Bảng 12: Ảnh hƣởng thời gian trích ly đến khả chiết xuất sulforaphane Thời Rau mầm cải Rau mầm súp lơ xanh Phần trăm thu hồi (%) gian (phút) Hàm lƣợng Hàm lƣợng Hàm lƣợng Hàm lƣợng Rau Rau GLS SFN GLS SFN mầm mầm (mg/100g (mg/100g (mg/100g (mg/100g cải súp lơ CK) CK) CK) CK) 15 444,9 ±15,2 124,6±10,1 757,4 ±16,2 160,6±21,1 28,0 21,2 30 1271,8±34,6 1017,5±45,6 2811,7±31,6 2212,8±35,6 80,0 78,7 45 1327,4±25,3 1108,4±23,1 3011,8±23,3 2538,9±13,1 83,5 84,3 60 1333,8±17,4 1119,1±34,2 3018,9±11,4 2550,9±34,2 83,9 84,5 75 1096,9±22,6 756,9±15,3 1594,2±15,3 69,0 66,8 2386,5±22,6 62 xanh Hàm lượng sulforaphane,mg/100gCK 3500 Hàm lƣợng SFN RM cải ngọt,mg/100gCK 3000 Hàm lƣợng SFN RM súp lơ xanh,mg/100gCK 2500 2000 1500 1000 500 15 30 45 60 Thời gian, phút 75 Hình 12: Ảnh hƣởng thời gian trích ly đến khả chiết xuất hoạt chất SFN Nhận xét: Kết nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng GLS hai mẫu rau mầm cải súp lơ xanh chuyển hóa với hiệu suất cao sau 45 phút trích ly Hàm lƣợng SFN tạo thành tăng dần khoảng 45 - 60 phút trích ly, sau gần nhƣ không thay đổi sau phút thứ 45 Tuy nhiên, giá trị tăng lên không đáng kể phút thứ 60 so với phút thứ 45 trích ly Mặt khác, kéo dài thời gian chiết xuất tạo điều kiện thuận lợi cho cấu tử khác hòa tan vào dịch chiết làm tăng tỉ lệ tạp chất Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Malcolm Elliott cộng (1970) cho thời gian tối ƣu cho trình chuyển hóa GLS thành SFN 40 - 50 phút Điều giải thích trình xử lý nguyên liệu, sóng siêu âm làm tăng tốc độ phá vỡ tế bào mô thực vật nhƣ tốc độ truyền khối, thời gian GLS chuyển hóa thành SFN đƣợc rút ngắn Kết luận: Chúng chọn thời gian trích ly SFN 45 phút 63 3.3.6 Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết Sulforaphane quy mô phòng thí nghiệm Nguyên liệu (Rau mầm cải ngọt, rau mầm súp lơ xanh) Làm sạch, sấy đông khô (w ≤ 8%) (t0 = 550C; w ≤ 8%) Thủy phân enzyme myrosinae (Nồng độ enzyme: 0,2%, to= 50oC, pH=6.5,thời gian:120 phút) - Nhiệt độ: 50 oC - pH: 6,5 - Thời gian: 120 phútly Trích Bã Trích ly (Điều kiện trích ly giống lần 1) Lần 1: dung )môi kết hợp sóng siêu âm (320W; 20 kHz/45 phút) (pH = 7,0; to= 30oC) Dịch trích ly Ethyl acetate(90%, nguyên liệu/dung môi = 1/4) Dung môi (thu hồi) Bã thải Ly tâm (10.000 v/phút) Dịch (chứa sulforaphane) Hình 3.13 Quy trình công nghệ chiết xuất thu nhận hoạt chất sulforaphane 64 b, Thuyết minh quy trình - a chọn ngu ên li u Rau mầm cải rau mầm súp lơ xanh đƣợc thu mua vùng trồng rau sạch, có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng; đƣợc phân tích kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng, dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật, vi sinh vật Chọn rau tƣơi, thu hoạch, không bị dập nát, thối hỏng - Xử lý sơ ngu ên li u Rau nguyên liệu đƣợc làm tạp chất (rửa nƣớc bể rửa siêu âm) - Nghiền ngu ên li u Sau làm sạch, rau đƣợc nghiền nhỏ (kích thƣớc rau nguyên liệu sau nghiền 2-5mm) - Sấ ngu ên li u Nguyên liệu đƣợc sấy đông khô -18oC, độ ẩm rau nguyên liệu đạt ≥ 5,5% - Thủy phân enzyme myrosinae: Enzyme myrosinae nội sinh có nguyên liệu thủy phân phần glucosinolates trình xay nghiền để tăng hiệu suất thu hồi nhƣ thủy phân hoàn toàn glucosinolates tiến hành bổ sung enzyme myrosinae thƣơng mại từ bên vào nhằm xúc tác thủy phân thủy phân hoàn toàn glucosinolates với nồng độ enzyme: 0,2%, to= 50oC, pH=6.5,thời gian:120 phút - ch chiết ho t chất S N b ng dung m i ết h p v i sóng siêu âm: Quá trình đƣợc thực hệ thống thiết bị tách chiết siêu âm chân điều chỉnh nhiệt độ Tách chiết hoạt chất SFN đƣợc tiến hành hai lần: lần đƣợc thực nhiệt độ 30oC, công suất sóng siêu âm 320W, tần số sóng siêu âm 20 kHz 45 phút; nguyên liệu sau tách chiết lần xong đƣợc tiến hành tách chiết lần Sử dụng dung môi tách chiết tách chiết ethyl acetate, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi = 1/4 Tách chiết thời gian 45 phút, nhiệt độ 30oC, pH môi trƣờng 7,0; tốc độ khuấy trộn 100 vòng/phút Sau đó, lọc qua NaCl Na 2SO3 thu đƣợc dịch chiết chứa SFN Phần bã đƣợc sử dụng để tách chiết thêm lần thứ với điều kiện tách chiết giống nhƣ 65 - hu hồi dịch chứa ho t chất Dịch chiết chứa Sulforaphane đƣợc ly tâm loại bỏ số tạp chất 10.000 vòng/phút, phần dịch lọc đem cô đặc điều kiện chân không nhiệt độ ≤ 55oC đến nồng độ SFN dịch chiết ≥ 40% thu đƣợc dịch cô đặc chứa SFN 3.4 Kết tác dụng diệt Helicobacter pylori Từ năm 1983 đến nhà khoa học xác định có mặt của vi khuẩn HP bệnh viêm loét dày tá tràng(DDTT), Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh HP có vai trò chủ yếu chế gây viêm loét DDTT Vì cần chứng minh xem hoạt chất sulforaphane chiết xuất từ rau họ cải có tác dụng diệt H Pylori hay không Tiến hành theo mục 2.2.4.2 kết đƣợc ghi bảng, thí nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình kết thử xác định hàm lƣợng hoạt chất sulfraphane có khả ức chế vi khuẩn H Pylori theo phƣơng pháp khuếch tán môi trƣờng thạch (Phƣơng pháp Kerby- Bauer) Bảng 3.1: kết đo đƣờng kính vòng vô khuẩn hoạt chất Nồng độ dung dịch Sulfo Số lần lặp Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) 1,7 5,5 ± 0,06 3,3 6,7 ± 0,10 5,0 11.2 ± 0,15 6,7 12,7 ± 0,17 (mg/mL) Nhận xét khả diệt H.Pylori Sulforaphane có liên quan thuận với nồng độ Sulforaphane điều kiện in vitro Nghiên cứu tác dụng diệt H.Pylori điều kiện in vitro Sulforaphane, phƣơng pháp khuếch tán thạch, đo đƣờng kính vô khuẩn tính nồng độ ức chế thuốc Kết bƣớc đầu cho thấy: dung dịch Sulforaphane có tác dụng diệt H.Pylori phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ cao tác dụng ức chế H.Pylori mạnh 66 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: Lựa chọn đƣợc loại rau mầm chứa hàm lƣợng hoạt chất cao rau mầm cải ngọt, rau mầm súp lơ xanh tuổi rau nguyên liệu thích hợp để tách chiết hoạt chất Sulforaphane: Đối với rau mầm cải sau gieo ngày đạt 654,9 mg/100gCK, rau mầm súp lơ xanh đạt 1480mg/100gCK Ứng dụng enzyme myrosinase để thủy phân glucosinolates rau nguyên liệu để nâng cao hàm lƣợng hoạt chất sulforaphane - Nồng độ enzyme: 0,2% - Nhiệt độ: 50 oC - pH: 6,5 - Thời gian: 120 phút Hàm lƣợng sulforaphane đạt cao rau mầm cải 841,5 mg/100gCK, 1901,8mg/100g CK rau mầm súp lơ xanh Khảo sát đƣợc số thông số trình tách chiết hoạt chất sulforaphane: - Công suất sóng siêu âm: 320W - Dung môi trích ly: ethyl acetate - Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 4/1 - Nhiệt độ trích ly: 30oC - pH môi trƣờng: 7,0 - Thời gian trích ly: 45 phút Hàm lƣợng sulforaphane đạt cao rau mầm cải 1108,4mg/100gCK, rau mầm súp lơ xanh 2538,9 mg/100g CK Bƣớc đầu đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn Helicobacter pylori chế phẩm sulforaphane thô Vòng vô khuẩn có đƣờng kính là: 12,8 ± 0,17 mm nồng độ thử nghiệm 6,7mg/ml 67 ĐỀ XUẤT Qua kết nghiên cứu nhận thấy rằng: Cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao hiệu suất chiết xuất, nhƣ quy trình tinh hoạt chất sulforphane từ nâng cao quy mô sản xuất nhằm mục đích tạo sản phẩm sulforaphane tinh khiết có chất lƣợng ổn định 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [2] Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Quốc Khánh, Lê Thị Lan Oanh, Viện Công nghệ sinh học, (2001), Khảo sát Polysacarit số thuốc, Kỷ yếu - Annual Report, 520-529 [3] Vũ Thị Thu Hiền, (2012), Nghiên cứu số chất kháng oxy hóa rau mầm họ cải, Luận văn thạc sỹ Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội [4] Lê Thị Khánh, (2008), Giáo trình rau, Trƣờng Đại học nông lâm Huế [5] Nguyễn Đình Lục, (2006), Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị siêu âm công suất 1,5KW ứng dụng làm sạch, chiết suất hợp chất tự nhiên từ củ họ gừng Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ [6] Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Trần Thập Nhị, Lê Doãn Diên, “Thực phẩm chức năng”, Tạp chí Lƣơng thực Thực phẩm số 11-2006; 12 [8] Trần Hữu Thị, Lê Doãn Diên, Bành Nhƣ Cƣơng, Phạm Thị Mai, (2008), Nghiên cứu thăm dò hoat chất glucosinolate nhóm sulforaphane indol-3carbinol số loài súp lơ xanh Brassica sp,(họ Cải Brassicaceae) Việt nam, Hội nghị khoa học toàn quốc lần IV: Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, 648 – 653 [9] Nguyễn Đức Tiến cs, ( 2011), nghiên cứu khảo sát trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi, nấm Hương, nấm Đầu khỉ công nghệ sóng siêu âm công nghệ Soxhlet thông thường, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch 69 [10] Lê Ngọc Tú (Chủ biên), Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cần (2001), Hóa học thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [11] Axon A.T.R, (2007), Relationship between Helicobacter pylori gastritis, gastric cacer and gastric acid secretion, Advance in Medical Science, 52, 55- 60 [12] Alarco T et al, (2003), Clarithromycin resistance among Helicobacter pylori strains isolated from chidren: prevalence and study of mechanism of resistance by PCR- restriction fragment length pholymorphism analysis, J Clin Microbiol, 41, 486- 499 [13] Blaser M.J and Berg D.E, (2001), Helicobacter pylori Genetic diversity and risk of human disease, The Journal of Clinical Investigation,107(7), 767 - 773 [14] B.G Shofran et al, (1998), Antimicrobial properties of sinigrin and its hydrolysis products, Journal of food science, volume 63, No.4 [15] Clarke J.D, Dashwood R.H., Ho E, (2008), Multi-targeted prevention of cancer by sulforaphane, Cancer Lett, 269, 291-304 [16] Campas-Baypoli, O N, Sánchez-Machado, D I., Bueno-Solano, C., RamírezWong, B and López-Cervantes, J, (2010), HPLC method validation for measurement of sulforaphane level in broccoli by-products, Biomed, Chromatogr., 24: 387-392 doi: 10.1002/bmc,1303 [17] Cartea, María Elena, Pablo Velasco, Sara Obregón, Guillermo Padilla, Antonio de Haro, (2008), Seasonal variation in glucosinolate content in Brassica oleracea crops grown in northwestern Spain, Phytochemistry 69, 403–410 [18] Doig et al, (1999), Helicobacter pylori physiology Microbiol Mol Biol Rev, 63: 669 - 707 Bỏ[18] Fahey J.W, Talalay P, (1999), Antioxidant functions of sulforaphane: a potent inducer of phase II detoxifi-cation enzymes, Food Chem Toxicol, 37, 973979 [19] Fahey JW, Haristoy X, Dolan PM, et al, (2002), Sulforaphane inhibits 70 extracellular, intracellular, and antibiotic-resistant strains of Helicobacter pylori and prevents benzo[a]pyrene-induced stomach tumors, Proc Natl Acad Sci2002;99:7610-7615 [20] Gao X., Kinkova-Kostova A.T., Talalay P, (2001), Powerful and prolonged protection of human retinal pigment epithelial cells, keratinocytes, and mouse leukemia cells against oxidative damage: the indirect antioxidant effects of sulforaphane Proc Natl Acad Sci, 15, 221-15226 [21] Jan Jezek et al, (1999), Determination of glucosinolate using their alkaline degradation and reaction with ferricyanide, Food Chem, 47, 4669 - 4674 [22] Jane V Higdon, Barbara Delage, David E Williams, Roderick H Dashwood, (2007), Cruciferous vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and mechanistic basis Vol 224 – 236 55 [23] Kiyotaka N., Umeda T., Higuchi O., Tsuzuki T., Suzuki T., and Miyazawa T., (2006), Evaporative Light-Scattering Analysis of Sulforaphane in Broccoli Samples:  Quality of Broccoli Products Regarding Sulforaphane Contents, J Agric Food Chem, 54 (7), 2479–2483 [24] Kensler T.W., Chen J.G., Egner P.A., et al., (2005), Effects of glucosinolaterich broccoli sprouts on urinary levels of aflatoxin-DNA adducts and phenanthrene tetraols in a randomized clinical trial in He Zuo Township, Qidong, People’s Republic of China Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 14, 2605-2613 [25] Kong J.S., Yoo S.A., Kim H.S., et al., (2010), Inhibition of synovial hyperplasia, rheumatoid T cell activation, and experimental arthritis in mice by sulforaphane, a naturally occurring isothiocyanate Arthritis Rheum, 62:159-170 [26] Kiyotaka N., Umeda T., Higuchi O., Tsuzuki T., Suzuki T., and Miyazawa T., (2006) Evaporative Light-Scattering Analysis of Sulforaphane in Broccoli Samples:  Quality of Broccoli Products Regarding Sulforaphane Contents J Agric Food Chem., 54 (7), 2479–2483 [27] Li Yang, (2009), Separation and Purification of Sulforaphane from Broccoli Sprouts and Determination of Anticancer Activity Master's thesis 71 [28] Liang H, Li C., Yuan Q., Vriesekoop F., (2007), Separation and Purification of Sulforaphane from Broccoli Seeds by Solid Phase Extraction and Preparative High-Performance Liquid Chromatography, J Agric Food Chem., 55 (20), 80478053 [29] M Grazia Botti, Malcolm G Taylor and Nigel P Botting, Investigation of the effect of glycosyl acceptors on enzyme activity, the School of Chemistry, The Purdie Building, The University of St [30] McCarty Mark F., (2008), Scavenging of peroxynitrite-derived radicals by flavonoids may support endothelial NO synthase activity, contributing to the vascular protection associated with high fruit and vegetable intakes, Medical Hypotheses 70, 170–181 [31] Murashima M., Watanabe S., Zhuo X.G., et al., (2004) Phase study of multiple biomarkers for metabolism and oxidative stress after one-week intake of broccoli sprouts, Biofactors, 22, 271-275 [32] Myzak M.C., Tong P., Dashwood W.M., et al., (2007), Sulforaphane retards growth of human PC-3 xenografts and inhibits HDAC activity in human subjects Exp Biol Med, 232, 227-234 [33] Martinez V.C., Frias J., Gulewicz P., Gulewisz K., Vidal V.C, (2008), Food safety evaluation of broccoli and radish sprouts, Food and chamical Toxicology, 46, pp 1635-1644 Perez CS (2011) [34] Ruud Verkerk et al, (2008), Glucosinolates in Brassica vegetables: The influence of the food supply chain on intake, bioavailability and human health, Mol Nutr Food Res, 53, S219 –S265 [35] Reidl M.A., Saxon A., Diaz-Sanchez D., (2009), Oral sulforaphane increases phase II antioxidant enzymes in the human upper airway, Clin Immunol, 130, 244251 [36] Shankar S., Ganapathy S., Srivastava R., (2008) Sulforaphane enhances the therapeutic potential of TRAIL in prostate cancer orthotopic model through regulation of apoptosis, metastasis, and angiogenesis, Clin Cancer Res, 14, 6855-6865 72 [37] Tarozzi A, Morroni F, Merlicco A, et al, (2009), Sulforphane as an inducer of glutathi-one prevents oxidative stress-induced cell death in dopaminergic-like neuroblastoma cell line, J Neurochem, 111, 1161-1171 [38] Tim O.H., Lesleigh F., Lung W and Donald I, (2006), Anti-cancer Potential of Asian Brassicas Glucosinolates & Chemoprevention, A report for the Rural Industries Research and Development Corporation, Project No DAQ307A, ISSN 1440-6845 [39] Toribino et al, (2007), Chromatography A, 966, 1170, 44-51 [40] Tran Ngoc Anh, Le Van Phung, Nguyen Khanh Trach, Ta Long, (2002), Distribution of distinct vacA, cagA of H pylori in gastric cancer in Viet Nam [41] Wu L., Noyan-Ashraf M.H., Facci M., et al.,( 2004) Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system, Proc Natl Acad Sci, 101, 7094-7099 [42] West et al, (2002) J Chromatography A, 966, 227-232 [43] Wehrli C, Schutz J, (2013), Process For Extraction of Glucosinolates From Broccoli Seeds, US Patent, No.: US 2013/0030162 A1 Pub [44] Yanaka A, Fahey JW, Fukumoto A, Nakayama M, Inoue S, Zhang S, Tauchi M, Suzuki H, Hyodo I, Yamamoto M, (2009), Dietary Sulforaphane-Rich Broccoli Sprouts Reduce Colonization and Attenuate Gastritis in Helicobacter pyloriInfected Mice and Humans, Cancer Prev Res (Phila), 2(4), 353-60 [45] Zhansheng Li, Yumei Liu, Zhiynan Fang, et al, (2012), Development and verification of sulforaphane extraction method in cabbage (Brassica oleracea L var capitata) and broccoli (Brassica oleracea L var italica Planch.), Journal of Medicinal Plants Research Vol 6(33), pp.4796-4803 73 PHỤ LỤC Kêt HPLC Mẫu chuẩn Name Sulforaphane RT 11.952 Area 55679 Height 3871 Amount Height 10180 Amount 1108.4 HPLC Mẫu RM cải (Mẫu 1) Name Sulforaphane RT 11.894 Area 156628 74 HPLC Mẫu RM súp lơ xanh (Mẫu 2) Name Sulforaphane RT 11.887 Area 184124 Phụ lục hình ảnh: Một số hình ảnh thí nghiệm 75 Height 11818 Amount 2538.9 76 ... hiểu đề tài: Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sulforaphane có tác dụng phòng chống vi khuẩn Helicobacter pylori từ số rau họ cải Vi t Nam” Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu xác định đƣợc số đặc tính... sinh học xây dựng đƣợc quy trình công nghệ thu nhận hoạt chất Sulforaphane có tác dụng phòng chống vi khuẩn Helicobacter pylori với hàm lƣợng cao số rau họ cải Vi t Nam Địa điểm nghiên cứu: Nghiên. .. hoá học GLS thƣờng tìm thấy rau thuộc họ cải [34] 10 Bảng 1.4: Một số ITCs đƣợc nghiên cứu hoạt tính chống ung thƣ 14 Bảng 1.5 Một số nghiên cứu chiết xuất chất có hoạt tính sinh học