Đề tài : Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid và đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Hà Nội 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 73 10 Nơi thực hiện đề tài: 1. Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu 2. Bộ môn Dược lý - Trường ĐH Y Hà Nội Thời gian thực hiện: Từ 08/2010 đến 01/2012 HÀ NỘI 2012 LỜI CẢM ƠN 2 Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc nhất tới TS. Trịnh Thị Điệp - Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu, TS. Nguyễn Quỳnh Chi Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phương Thiện Thương – Khoa Hóa phân tích, tập thể cán bộ khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu và tập thể cán bộ Bộ môn Dược lý – trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài này. Trong quá trình học tập, triển khai nghiên cứu đề tài và những gì đạt được hôm nay, tôi xin cảm ơn công lao giảng dạy và hướng dẫn của các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi xin được bày tỏ niềm xúc động lớn lao trước sự động viên kịp thời của lãnh đạo trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, các Phòng, Khoa, các thầy cô giáo trường Đại học Y Dược Thái Nguyên. Và xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các em sinh viên cùng tham gia thực hiện đề tài – Những người đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Dù đã có rất nhiều cố gắng, song luận văn còn có thể có những thiếu sót. Kính mong nhận được sự chia xẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2012. Học viên 3 Đinh Phương Liên 4 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH : Buthanol C. : Citrus CHCl 3 : Chloroform CF : Citroflavonoid DL : Dược liệu ĐMC : Động mạch chủ EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol HDL : High density lipoprotein HES : Hesperidin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao LDL : Low density lipoprotein MeOH : Methanol NAR : Naringin SP : Sản phẩm TB : Trung bình TLC : Sắc ký lớp mỏng TT : Thứ tự TTC : Thể trọng chuột T 0 P : Nhiệt độ phòng tt/kl : Thể tích/ khối lượng tt/tt : Thể tích/ thể tích 5 MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG, BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Thực vật học về chi Citrus 3 1.1.1. Vị trí chi Citrus 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Citrus 5 1.1.3. Tình hình cây trồng một số loài thuộc chi Citrus tại Việt Nam 5 1.2. Nghiên cứu về hóa học của các loài thuộc chi Citrus 7 1.2.1. Carotenoid 8 1.2.2. Tinh dầu 8 1.2.3. Limonoid 8 1.2.4. Coumarin 8 1.2.5. Alcaloid 9 1.2.6. Flavonoid 9 1.3. Tác dụng sinh học của các flavonoid trong chi Citrus 14 1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa 14 1.3.2. Tác dụng giảm mỡ máu 15 1.3.3. Tác dụng chống viêm 15 1.3.4. Tác dụng phòng và chống các bệnh tim mạch 15 1.3.5. Tác dụng chống ung thư 15 1.4. Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus 16 1.5. Các quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ quả các loài thuộc chi Citrus 17 6 1.6. Một số dược phẩm trên thị trường có hoạt chất là các citroflavonoid 21 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.2. Phương tiện nghiên cứu 25 2.2.1. Hóa chất, thuốc thử 25 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 25 2.2.3. Động vật nghiên cứu 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm của dược liệu 26 2.3.2. Phương pháp định tính citroflavonoid trong dược liệu và trong sản phẩm chiết xuất bằng sắc ký lớp mỏng 27 2.3.3. Phương pháp định lượng citroflavonoid bằng quang phổ tử ngoại. .27 2.3.4. Phương pháp định lượng citroflavonoid trong dược liệu và sản phẩm chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 30 Định lượng hàm lượng citroflavonoid trong dược liệu và trong sản phẩm chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành theo phương pháp từ nghiên cứu “ Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời naringin và hesperidin trong vỏ quả các loài thuộc chi Citrus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao“ (Pphụ lục 8) 30 2.3.5. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất citroflavonoid 32 2.3.6. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn của nguyên liệu và sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 33 2.3.7. Phương pháp thử độc tính cấp 34 2.3.8. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid lên chỉ số lipid máu 35 7 2.4. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 36 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 37 3.1. Xây dựng quy trình chiết xuất Citroflavonoid 37 3.1.1. Khảo sát hàm lượng citroflavonoid trong vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus 37 3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất citroflavonoid 38 3.1.2.1. Khảo sát dung môi 38 3.1.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất citroflavonoid 41 3.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết xuất 42 3.1.2.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu 43 3.1.2.5. Khảo sát kích thước dược liệu 45 3.1.3. Xây dựng quy trình chiết citroflavonoid và khảo sát độ ổn định quy trình 46 3.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cho nguyên liệu và sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 48 3.2. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất ciroflavonoid 58 3.2.1. Thử độc tính cấp 58 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid trên các chỉ số lipid máu và mô bệnh học 59 3.2.2.1. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lên nồng độ triglycerid 59 3.2.2.2. Ảnh hưởng của chế phẩm citroflavonoid lên nồng độ cholesterol toàn phần 60 3.2.2.3. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lên nồng độ HDL- cholesterol 61 8 3.2.2.4. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lên nồng độ LDL- cholesterol 62 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 66 4.1. Về nguồn nguyên liệu dùng chiết xuất citroflavonoid 66 4.2. Về xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả Citrus67 4.3. Về xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu và sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 68 4.4. Về thử độc tính cấp của chế phẩm citroflavonoid 70 4.5. Về ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid trên các chỉ số lipid máu và mô bệnh học 70 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 Kết luận 72 Đề xuất 73 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 9 ĐẶT VẤN ĐỀ Các cây thuộc chi Citrus được trồng rất rộng rãi ở nước ta với mục đích chính là lấy quả và làm cảnh. Hiện nay ở Việt nam cũng sử dụng quả hoặc vỏ quả của một số loài để làm thuốc theo Y học cổ truyền, y học dân gian [12], [14] tuy nhiên số lượng sử dụng là không nhiều do nhu cầu thấp. Qua các công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và ở Việt Nam thấy rằng flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài thuộc chi Citrus có nhiều tác dụng sinh học tốt [6],[13], [2637]. Các tác dụng đáng chú ý là tăng trương lực tĩnh mạch, bảo vệ thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống ung thư [7]. Các công ty dược phẩm có uy tín trên thế giới đã nghiên cứu và bào chế thành công sản phẩm thuốc dùng để chữa các bệnh về rối loạn mạch máu từ nguồn dược liệu này. Có thể dễ dàng nhận thấy ở các gia đình, hàng quán, khách sạn, các công ty chế biến thực phẩm một điều là sau khi sử dụng quả của các loài thuộc chi Citrus, vỏ quả giữa (còn gọi là cùi) được đem vứt đi mà không được sử dụng. Rõ ràng chúng ta đang lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc rất dồi dào, sẵn có quanh năm, là phế phẩm của một ngành khác (thực phẩm). Tuy có một số nghiên cứu ở Việt Nam về việc ứng dụng các flavonoid để làm thuốc chữa bệnh, nhưng chưa có nghiên cứu cho quy mô công nghiệp và do đó chưa thể triển khai được trong công nghiệp. Trong khi đó, ngành công nghiệp dược phẩm của nước Pháp đã tận dụng vỏ quả (sau khi sử dụng cho công nghiệp thực phẩm) để chiết xuất citroflavonoid, sản xuất các thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch rất hiệu quả, đem nhiều lợi nhuận về kinh tế. Công nghệ hóa dược và sản xuất dược phẩm ở nước ta đã có những phát triển vượt bậc trong những năm qua. Chúng ta có thể triển khai những quy 1 [...]... tác dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất" Mục tiêu chính của đề tài: 1 Xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus 2 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid lên các chỉ số lipid máu Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: - Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ dược... nghệ chiết xuất và sản xuất thuốc trên những dây chuyền công nghệ mới của các công ty Dược phẩm Như vậy, nếu tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền này để phát triển sản xuất ra thành phẩm có ích thì chúng ta sẽ có đóng góp lớn cho lợi ích kinh tế, môi trường và khoa học công nghệ Với lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài "Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid và đánh giá tác dụng sinh học của. .. dược liệu và sản phẩm chiết xuất citroflavonoid - Thử độc tính cấp của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid - Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid lên các chỉ số lipid máu và mô bệnh học trên mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học về chi Citrus 1.1.1 Vị trí chi Citrus Citrus là một chi lớn nằm trong họ Cam- Rutaceae Họ này có khoảng 150 chi và 2000... dược phẩm trên thế giới đã dựa trên tác dụng này của citroflavonoid để nghiên cứu sản xuất ra các thuốc chữa bệnh [26] 1.3.5 Tác dụng chống ung thư Tác dụng chống ung thư của flavonoid đã được chứng minh trên cả in vitro và in vivo [17],[19],[31],[45] Chúng có tác dụng chống đột biến, vì có tác dụng bảo vệ DNA trước sự tấn công của các tác nhân gây ung thư như các 15 gốc tự do, các tác nhân vật lý và. .. đi sâu đề cập tới các nghiên cứu về các citroflavonoid Nghiên cứu về thành phần flavonoid của các loài Citrus ở Việt Nam có không nhiều Năm 1990, tác giả Nguyễn Thị Chung thực hiện luận án Nghiên cứu chiết xuất và dạng bào chế của các flavonoid từ vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus Việt Nam”[6] Trong luận án này, tác giả đã công bố một số kết qu : (1) Khảo sát nguồn nguyên liệu để chiết xuất citroflavonoid. .. xuất bởi các công ty dDược phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất lớn về các thuốc này 22 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là vỏ quả của một số loài thuộc chi Citrus Vỏ quả Citrus được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Tài Nguyên – Viện Dược liệu, nằm trong khuôn khổ đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid. .. dụng chống viêm [19],[32] Trên mô hình in vivo, diosmin [18] và hesperidin [22] có tác dụng ức chế quá trình viêm gây ra bởi carragenin trên chuột [17] 1.3.4 Tác dụng phòng và chống các bệnh tim mạch Vì có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol trong máu, và tác dụng chống viêm nên các citroflavonoid có tác dụng phòng và chống các bệnh về tim mạch rất hay gặp ở người cao tuổi và người béo phì Các citroflavonoid. .. nhân vật lý và hóa học [18],[45] Các citroflavonoid cũng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của khối u, vì vậy nó có tác dụng phòng ngừa và làm chậm quá trình sinh ung thư [19] 1.4 Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus chủ yếu là về tinh dầu, dinh dưỡng và trồng trọt để thu hái quả và cất tinh dầu Các nghiên cứu về tinh dầu cho... áp dụng trong nghiên cứu cơ bản ở mô hình phòng thí nghiệm, không áp dụng được cho quy mô công nghiệp Để có quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở quy mô công nghiệp và để áp dụng cho sản xuất, chúng ta phải đầu tư nghiên cứu phát triển từ các quy trình đã nêu trên đây Để có hiệu suất chiết citroflavonoid cao trong công nghiệp, người ta chiết với cồn rồi sau đó mới loại tạp chất Dược liệu chiết. .. flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus 13 1.3 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong chi Citrus Như đã trình bày ở trên, flavonoid là một trong những thành phần hóa học chính của các loài Citrus Các flavonoid này, cũng giống như các flavonoid nói chung, có rất nhiều các tác dụng sinh học 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa Các flavonoid có nhóm hydroxy (OH) gắn với vòng thơm có tác dụng chống . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Hà. HỌC Hà Nội 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT LUẬN VĂN. citroflavonoid và khảo sát độ ổn định quy trình 46 3.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cho nguyên liệu và sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 48 3.2. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất ciroflavonoid