chế phẩm bột citroflavonoidBảng 3.13. Kết quả xác định độ ẩm của
các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TT Tên mẫuTờn mẫu Độ ẩm (%)Độ ẩm (%)
1 M1 4,86 2 M2 5,27 3 M3 5,41 4 M4 5,52 5 M5 5,31 6 M6 5,09 Trung bìỡnh 5,24 Nhận xột:
Độ ẩm của cỏc mẫu sản phẩm bột citroflavonoid nằm trong khoảng từ 4,86% đến 5,52%. Vỡ vậy giới hạn độ ẩm cho chế phẩm quy định khụng được quỏ 6%.
Tro toàn phần
Độ ẩm của các mẫu sản phẩm bột CF nằm trong khoảng từ 4,86% đến 5,52%. Vì vậy giới hạn độ ẩm cho chế phẩm quy định khơng đợc q 6,0%
Tro tồn phần
Tiến hành xác định tro tồn phần ở 6 lơ mẻ khác nhau kết quả đợc trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả tro toàn phần của cỏc mẫu chế phẩm bột
citroflavonoid
Bảng 3.14. Kết quả tro toàn phần của các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TTTT Tờn mẫuTên mẫu Tro sulfat (%)Tro sulfat
(%) 1 M1 1,58% 2 M2 0,78% 3 M3 1,63% 4 M4 2,57% 5 M5 0,69% 6 M6 1,66% Trung bìỡnh 0,92% Nhận xột:
Tro tồn phần của 6 mẫu chiết xuất khỏc nhau nằm trong khoảng từ 0,69% đến 2,57%, trung bỡnh là 1,485%. Vỡ vậy giới hạn tro toàn phần của bột citroflavonoid khụng được quỏ 3,0%
Định tớnh:
Nhận xét:
Tro toàn của 6 mẻ chiết xuất khác nhau nằm trong khoảng từ 0,69% đến 2,57%, trung bình là 1,485%. Vỡ vậy giới hạn tro toàn phần của bột citroflavonoid khơng đợc q 3,0%.
Định tính:
- Pha tĩnh: Silica gel GF254 (Merck), hoạt húa ở 1050C/60 phỳt
- Hệ dung mụi triển khai: Ethyl acetat: methanol: nước (100: 17: 13)
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch hesperidin chuẩn trong methanol cú
nồng độ khoảng 0,2mg/ml)
Dung dịch thử: lấy 0,01 gam bột mẫu thử, thờm 50ml methanol, siờu
õm 15 phỳt, lọc. Bốc hơi dịch lọc trờn cỏch thuỷ đến cũn khoảng 2ml được dung dịch chấm sắc ký.
Quan sỏt dưới ỏnh sỏng UV-VIS 366nm, sắc ký đồ của dung dịch thử cú một vết chớnh Rf 0,4-0,5 cú cựng màu và cựng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu hesperidin.
- Thuốc thử phỏt hiện: Dung dịch nhụm clorua 2% trong ethanol
Quan sát dới UV366nm, sắc ký đồ của dung dịch thử có một vết chính Rf 0,4- 0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu hesperidin.
Định lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành định lượng hesperidin 6 lụ mẻ chiết xuất, kết quả hàm lượng hesperidin được trỡnh bày trờn bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hàm lượng % hesperidin trong cỏc mẫu
chế phẩm bột citroflavonoid
Định lợng:
Tiến hành định lợng hesperidin 6 lô mẻ chiết xuất, kết quả hàm lợng hesperidin đợc trình bày tại bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hàm lợng % hesperidin trong các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TTTT Tờn mẫuTên mẫu Hàm lượng % hesperidin tớnh theo khối lượng sản phẩm
khụ tuyệt đốiHàm lợng %
hesperidin tính theo khối lợng SP khô tuyệt đối.
1 M1 70,01% 2 M2 74,80% 3 M3 70,08% 4 M4 57,30% 5 M5 68,30% 6 M6 66,83% Trung bìỡnh 67,8% Nhận xột:
Hàm lượng hesperidin của cỏc mẫu chế phẩm nằm trong khoảng từ 57,30% đến 74,08%, trung bỡnh 67,8%. Vỡ vậy, giới hạn hesperidin cho chế phẩm citroflavonoid quy định khụng được thấp hơn 55,0%.
Nhận xét:
Hàm lợng hesperidin của các mẫu bột nằm trong khoảng từ 57,30% đến 74,80%, trung bình 67,8%. Vì vậy, giới hạn hesperidin cho chế phẩm citroflavonoid quy định không đợc thấp hơn 55,0%.
Độ nhiễm khuẩn
Mẫu chế phẩm bột citroflavonoid của 3 mẻ chiết xuất được gửi tới Phũng Vi sinh của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương để tiến hành thử độ nhiễm khuẩn theo phụ lục 13.6 – Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.
Kết quả đạt yờu cầu mức 4, theo yờu cầu của Dược điển Việt Nam (đối với thuốc uống).
Từ cỏc khảo sỏt trờn, đưa ra tiờu chuẩn sản phẩm bột citroflavonoid: + Độ ẩm: khụng quỏ 5,0%
+ Tro toàn phần: khụng được quỏ 3,0%
+ Định tớnh: Chế phẩm phải thể hiện phộp thử định tớnh của hesperidin + Định lượng: Hàm lượng hesperidin trong chế phẩm khụng được thấp hơn 505,0% tớnh theo chế phẩm khụ kiệt.
+ Độ nhiễm khuẩn: Đạt yờu cầu mức 4, phụ lục 13.6 – Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.
3.2. Đỏnh giỏ tỏc dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất ciroflavonoid
3.2.1. Thử độc tớnh cấp
Tiến hành thử độc tớnh cấp của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid theo phương phỏp ghi ở mục 2.3.4.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.16.
Lụ n Liều sử dụng (g/kg TTC/24h) Số chuột chết sau 72 giờ Số chuột sống sau 72 giờ 1 10 5 0 10 2 10 10 0 10 3 10 14 0 10 4 10 17 0 10 5 10 22 0 10 6 10 28 0 10 Nhận xột:
Từ kết quả trờn cho thấy, sau khi chuột được cho uống chế phẩm CF với cỏc liều khỏc nhau (liều từ 5- 28g /kg TTC/24h) chuột vẫn khỏe mạnh, hoạt động ăn uống bỡnh thường. Liều 28g bột/ kg TTC/24h là liều tối đa cú thể cho một con chuột nhắt trắng uống trong 1 ngày (nồng độ và thể tớch tối đa cho phộp) mà chuột vẫn khỏe mạnh bỡnh thường. Như vậy, khụng xỏc định được LD50 và LD100 của sản phẩm bột CF trờn chuột nhắt trắng theo đường uống.
Theo dừi sau 72h khụng cú chuột thớ nghiệm bị chết, phẫu thuật chuột thấy cỏc cơ quan bỡnh thường.
LNếu xem liều uống viờn Daflon là 500mg, uống 4-6 viờn/ngày, tức tối đa 3g hoạt chất/ngày cho người bỡnh thường (là 50kg) , thỡ liều sử dụng sẽ là 1050mg/kg/ngày,. S so sỏnh với liều thử tối đa 28g/kg/ngày trờn chuột cho ta thụng tin sản phẩm cú độ an toàn cao.
3.2.2. Đỏnh giỏ ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất citroflavonoid trờn cỏcchỉ số lipid mỏu và mụ bệnh họcchỉ số lipid mỏu và mụ bệnh học chỉ số lipid mỏu và mụ bệnh học
3.2.2.1. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lờn nồng độ triglycerid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của chế phẩm bột CF lờn nồng độ triglycerid được thể hiện qua bảng 3.17.
Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm CF lờn nồng độ triglycerid
Nồng độ triglycerid (mg/dL)
Lụ 1 128,95± 10,22 122,98 ±13,47* 137,49±32,32* 135,42±16,67* Lụ 2 131,52 ± 27,66 182,76±52,37 242,54±74,14 252,54±01,39 Lụ 3 125,54±16,62 182,76±45,40 226,31±44,51 176,49±16,79 Lụ 4 124,68±19,80 179,34±52,18 210,08±31,75 160,84±6,43 Lụ 5 126,39±20,05 166,53±33,74 190,44±37,56 154,94±19,98* Ghi chỳ: *p < 0,05 (so với lụ mụ hỡnh)
Nhận xột:
Kết quả cho thấy sau 4, 8 và 10 tuần uống thuốc liờn tục, nồng độ triglycerid mỏu thỏ của lụ 2 (lụ mụ hỡnh) tăng rừ rệt so với lụ 1 (lụ chứng sinh học) và cú sự khỏc biệt ý nghĩa với p < 0.05. Sau 4 tuần tăng 48,6%, sau 8 tuần tăng 76,4%, sau 10 tuần tăng 86,5 %.
Ở cỏc lụ uống thuốc sau 4 và 8 tuần, nồng độ triglycerid mỏu thỏ của lụ 3 (uống atorvastatin), lụ 4 (lụ uống CF liều thấp là 100mg/kg) và lụ 5 (lụ uống CF liều cao là 200mg/kg) khụng cú sự khỏc biệt so với lụ 2 (lụ mụ hỡnh) (p > 0,05). Sau 10 tuần, nồng độ triglycerid mỏu của 2 lụ uống CF đó cú mức giảm nhiều so với lụ mụ hỡnh, lụ uống CF liều cao cú mức giảm nhiều hơn (38,6%) so với lụ uống CF liều thấp (36,3%). Sự khỏc biệt về nồng độ triglycerid mỏu của lụ thỏ uống CF liều cao với lụ mụ hỡnh rất rừ rệt ở thời điểm sau 10 tuần với p <0,05.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của chế phẩm citroflavonoid lờn nồng độ cholesterol toàn phần
Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của chế phẩm CF lờn nồng độ cholesterol toàn phần được thể hiện qua bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm citroflavonoid lờn
nồng độ cholesterol toàn phần
Nồng độ cholesterol toàn phần (mg/dL)
TT Trước uống 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lụ 2 84,53 ± 11,28 386,39±26,40 400,86±36,08 438,94±32,81 Lụ 3 82,99±11,69 353,96±36,30* 344,70±19,64* 332,67±16,54* Lụ 4 84,15±14,30 391,02±22,22 398,74±51,79 423,96±29,84 Lụ 5 84,15±9,24 391,79±24,02 397,19±37,07 429,09±32,08 Ghi chỳ: * p < 0,05 so với lụ mụ hỡnh Nhận xột:
Sau thời gian 4, 8 và 10 tuần uống thuốc liờn tục nồng độ cholesterol toàn phần của lụ 2 (lụ mụ hỡnh) luụn cú xu hướng tăng, gấp 5 lần so với lụ 1 (lụ chứng sinh học) và cú sự khỏc biệt rừ rệt ( p< 0.05).
Sau khi uống thuốc, nồng độ cholesterol toàn phần của lụ 3 (lụ uống atorvastatin) giảm so với lụ mụ hỡnh (p<0.05): giảm 8,4% sau 4 tuần, giảm 14% sau 8 tuần và 24,2% sau 10 tuần. Tuy nhiờn, nồng độ cholesterol toàn phần của 2 lụ uống CF cú ớt sự thay đổi so với lụ mụ hỡnh và chưa cú sự khỏc biệt rừ rệt.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lờn nồng độ HDL-cholesterol
Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của chế phẩm CF lờn nồng độ HDL- cholesterol được thể hiện qua bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm citroflavonoid
lờn nồng độ HDL-cholesterol
Nồng độ HDL-cholesterol (mg/dL)
TT Trước uống 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lụ 1 29,31± 4,05 30,38 ±3,37* 29,54±2,97* 28,97±4,21* Lụ 2 29,85 ± 3,38 161,92±39,40 193,19±22,33 190,66±19,84
Lụ 3 28,88±4,24 105,23±31,30* 192,04±14,62 185,26±23,13 Lụ 4 30,65±4,42 181,08±26,25 197,96±18,92 182,05±22,25 Lụ 5 30,65±2,96 176,23±22,55 208,77±15,75 226,37±44,10
Ghi chỳ : *p<0,05 so với lụ mụ hỡnh
Nhận xột:
Từ kết quả cho thấy nồng độ HDL-C của lụ mụ hỡnh (lụ 2) tăng cao cú ý nghĩa so với lụ chứng sinh học (lụ 1): sau 4 tuần tăng gấp 5,3 lần, sau 8 tuần tăng gấp 6,5 lần, và sau 10 tuần tăng gấp 6,62 lần.
Ở cỏc lụ thỏ uống CF, nồng độ HDL-C của lụ uống thuốc atorvastatin và 2 lụ uống CF đều khụng cú sự khỏc biệt so với lụ mụ hỡnh với p>0,05.
3.2.2.4. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid lờn nồng độ LDL-cholesterol
Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của chế phẩm bột CF lờn nồng độ LDL- cholesterol được thể hiện qua bảng 3.20. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.20. Kết quả ảnh hưởng của chế phẩm bột CF
lờn nồng độ LDL-cholesterol
Nồng độ LDL-cholesterol (mg/dL)
TT Trước uống 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lụ 1 27,12± 11,58 26,08 ±11,22* 24,02±6,91* 24,52±9,66* Lụ 2 28,38 ± 12,65 187,91±42,04 159,16±22,29 197,77±33,34 Lụ 3 29,00±12,36 212,18±25,41 107,40±18,13* 112,11±32,93* Lụ 4 28,56±17,07 174,07±24,63 158,76±46,23 209,74±42,60 Lụ 5 28,22±11,24 182,25±36,66 150,34±41,72 171,73±44,89 Ghi chỳ : *p<0,05 so với lụ mụ hỡnh Nhận xột:
Sau khi uống thuốc 4, 8 và 10 tuần liờn tục, nồng độ LDL-cholesterol của lụ mụ hỡnh tăng nhiều so với lụ chứng sinh học (tăng cao gấp khoảng 7 lần) và cú sự khỏc biệt rừ rệt.
Nồng độ LDL-cholesterol của lụ uống thuốc atorvasatin (lụ 3) so với lụ mụ hỡnh sau 4 tuần chưa thấy rừ rệt sự khỏc biệt. Tuy nhiờn, sau 8 tuần và 10 tuần uống, mức giảm lần lượt là 32,5% và 43,3% và cú ý nghĩa thống kờ với p <0,05. Nồng độ LDL- cholesterol của 2 lụ uống CF tuy thấp hơn so với lụ mụ hỡnh và cú xu hướng giảm dần qua cỏc tuần, nhưng sự khỏc biệt so với lụ mụ hỡnh và chưa cú ý nghĩa thống kờ.
3.2.3. Ảnh hưởng của chế phẩm bột citroflavonoid trờn động mạch chủ
Tại thời điểm sau 8 tuần và 10 tuần uống thuốc, thỏ ở tất cả cỏc lụ được lấy ngẫu nhiờn 30% để tiến hành nghiờn cứu tỏc dụng của thuốc đến mụ bệnh học. Số thỏ được lựa chọn được đem giết, búc tỏch lấy động mạch chủ ở cỏc bộ phận tim, phổi, mạch mỏu để cắt tiờu bản, xột nghiệm đại thể, vi thể của động mạch chủ, đoạn ngay trước khi đổ vào động mạch vành.
Kết quả xột nghiệm đại thể và vi thể của động mạch chủ (ĐMC) được túm tắt trong bảng 3.21 và phụ lục 3.
Bảng 3.21. Kết quả quan sỏt đại thể và vi thể động mạch chủ
TT Đại thể Vi thể
8 tuần 10 tuần 8 tuần 10 tuần Lụ 1 Lũng mạch bỡnhthường, nhẵn, khụng cú mảng vữa xơ Lũng mạch bỡnh thường, nhẵn, khụng cú mảng vữa xơ ĐMC bỡnh thường ĐMC bỡnh thường Lụ 2 - Xung quanh tim , phổi, mạch mỏu cú nhiều mỡ. - Lũng ĐMC cú nhiều mảng vữa xơ dọc theo chiều dài.
- Nhiều mỡ xung quanh tim, quai ĐMC
- ĐM cú nhiều mảng vữa xơ toàn bộ lũng mạch. ĐMC mảng vữa xơ mỡ dày, mức độ vừa đến nặng, cú hoại tử, vụi hoỏ. ĐMC cú mảng vữa mỡ dày mức độ vừa, đó cú xơ hoỏ mảng vữa. Lụ 3 - Cú ớt mỡ xung quanh tim. - Lũng ĐMC cú mảng vữa xơ. Thõn ĐMC cú ớt, quai ĐMC cú nhiều mảng vữa xơ rừ. - Cú ớt mỡ quanh cuống tim - Quai ĐMC cú ớt mảng xơ vữa; thõn ĐMC cú rải rỏc mảng vữa xơ. ĐMC mảng vữa xơ mỡ dày mức độ vừa. ĐMC mảng vữa xơ mỏng đến vừa, đó cú xơ hoỏ. Lụ 4 - Cú mỡ xung quanh tim, phổi, mạch mỏu.
- Lũng ĐMC cú nhiều mảng vữa xơ; đoạn quai ĐMC bị vữa xơ nhiều hơn đoạn
- Cú nhiều mỡ xung quanh tim và quai ĐMC - Quai ĐMC cú nhiều mảng bỏm dày đặc, thõn ĐMC ngực cú nhiều mảng bỏm, ĐMC ĐMC mảng vữa xơ mỡ dày mức độ vừa Mảng vữa mỡ lan toả cú bề dày mức độ vừa, trong mảng vữa mỡ đó xuất hiện cỏc tế bào xơ và hiện tượng vụi hoỏ
thõn. bụng cú ớt mảng bỏm hơn
Lụ 5
- Cú mỡ xung quanh tim, quai ĐMC. - Lũng ĐMC đoạn quai cú mảng vữa xơ, đoạn ngực cú rất ớt mảng vữa xơ. - Cú mỡ xung quanh tim, cuống tim.
- ĐMC cú ớt mảng vữa xơ ở đoạn quai và đoạn thõn. -ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ nhẹ đến vừa. Mảng vữa mỡ mức độ vừa và nặng, bắt đầu cú biểu hiện xơ hoỏ và cú vựng tỏi tạo nội mụ.
Nhận xột:
Từ cỏc kết quả đỏnh giỏ cỏc chỉ số lipid mỏu và quan sỏt vi thể, đại thể động mạch chủ thỏ sau khi dựng chế phẩm citroflavonoid trờn mụ hỡnh gõy tăng lipid mỏu ngoại sinh cho thấy:
- Thỏ uống chế phẩm CF liều 100mg/kg uống liờn tục trong 8-10 tuần chưa thể hiện rừ tỏc dụng giảm lipid mỏu. Tuy nhiờn, cú sự hạn chế xơ vữa động mạch chủ thỏ ở mụ hỡnh gõy tăng lipid mỏu ngoại sinh.
- Thỏ uống chế phẩm CF ở liều 200mg/kg đó thể hiện rừ rệt tỏc dụng làm hạ triglycerid và LDL-cholesterol và hạn chế mức độ vữa xơ vữa động mạch chủ.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về nguồn nguyờn liệu dựng chiết xuất citroflavonoid
Trong phạm vi thực hiện đề tài, tiến hành khảo sỏt trờn 10 mẫu vỏ quả
Citrus cú nguồn gốc tại nhiều địa phương trờn cả nước. Kết quả khảo sỏt hàm
lượng citroflavonoid từ 10 mẫu vỏ quả trờn là một phần khảo sỏt nhỏ nằm trong cụng trỡnh “ Nghiờn cứu xõy dựng quy trỡnh cụng nghệ chiết xuất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
citroflavonoid từ vỏ quả của một số loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae” của Viện Dược liệu (phụ lục7).
Trong khuụn khổ đề tài cụng nghệ này, nhúm tỏc giả đó tiến hành xỏc định hàm lượng hesperidin và naringin trong 60 mẫu vỏ quả của 8 loài Citrus
thu thập được từ cỏc địa phương khỏc nhau trong cả nước bằng phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả cho thấy naringin là thành phần chớnh cú trong vỏ quả bưởi, cũn hesperidin là thành phần chớnh trong vỏ quả cỏc loài
Citrus khỏc (cam, quýt, chanh, phật thủ, quất). Hàm lượng hesperidin trong cỏc
Kết quả khảo sỏt cũng gợi ý rằng vỏ bưởi, vỏ cam và vỏ quýt cú thể là nguồn nguyờn liệu sử dụng cho chiết xuất citroflavonoid để làm thuốc chữa bệnh.
Đề tài đó thực hiện xõy dựng quy trỡnh chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả quýt (Citrus reticulata Blanco.) cú thành phần chớnh là hesperidin. Cần cú những nghiờn cứu tiếp theo để xõy dựng quy trỡnh chiết xuất citroflavonoid với thành phần chớnh là naringin (cú nhiều trong vỏ bưởi).
Mặc dự thực tế quả cỏc loài thuộc chi Citrus cú bỏn rất nhiều trờn thị trường và sản lượng vỏ quả dư thừa để cú thể sản xuất ở quy mụ cụng nghiệp, nhưng việc thu gom đủ số lượng vỏ quả làm nguyờn liệu sản xuất citroflavonoid thực sự gặp khú khăn. Theo thúi quen người tiờu dựng sau khi ăn quả khụng giữ vỏ quả lại để cho mục đớch làm thuốc. Cỏc nhà mỏy sản xuất thực phẩm từ quả Citrus ở Việt nam chưa cú nhiều để thu mua nguyờn