CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1.4.Xõy dựng tiờu chuẩn cho nguyờn liệu và sản phẩm chiết xuất
3.1. Xõy dựng quy trỡnh chiết xuất Citroflavonoid
3.1.4.Xõy dựng tiờu chuẩn cho nguyờn liệu và sản phẩm chiết xuất
phẩm của 6 mẻ chiết được thể hiện qua bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng citroflavonoid toàn phần
trong sản phẩm (quy mụ 1000g/mẻ) Mẻ Khối lượng DL (g) Khối lượng SP (g) Hiệu suất chiết xuất (%) Hàm lượng CF (%) Mẻ 1 1000 78,8 7,88 82,33 Mẻ 2 1000 77,9 7,82 83,07 Mẻ 3 1000 78,9 7,89 82,22 Mẻ 4 1000 79,8 7,98 81,94 Mẻ 5 1000 78,5 7,85 82,87 Mẻ 6 1000 79,4 7,94 82,59 TB 1000 78,93±0,68 7,89±0,06 82,50±0,44 Nhận xột:
Kết quả chiết 6 mẻ, mỗi mẻ 1kg dược liệu cho thấy quy trỡnh chiết xuất khỏ ổn định với hiệu suất là 7,89±0,06% và hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm là 82,50 ± 0,44%. Hiệu suất thu được citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm so với lượng citroflavonoid toàn phần trong dược liệu là 77,46 ± 0,65 %.
3.1.4. Xõy dựng tiờu chuẩn cho nguyờn liệu và sản phẩm chiết xuấtcitroflavonoidcitroflavonoid citroflavonoid
3.1.4.1. Xõy dựng tiờu chuẩn cho dược liệu vỏ quýt
Qua những khảo sỏt về nguồn nguyờn liệu và xõy dựng quy trỡnh chiết xuất
citroflavonoid cho thấy chất lượng dược liệu đầu vào cho quy trỡnh sản xuất là yếu tố quan trọng hàng đầu ảnh hưởng đến kết quả sản xuất.
Xõy dựng tiờu chuẩn dược liệu vỏ quýt dựa trờn cỏc chỉ tiờu chung được quy định tại Dược điển Việt Nam IV gồm: Mụ tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm
phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC), định lượng bằng phương phỏp HPLC....
Trong khuụn khổ luận văn, tiến hành xõy dựng tiờu chuẩn cho dược liệu vỏ quýt về cỏc chỉ tiờu định tớnh và định lượng.
Độ ẩm
Xỏc định độ ẩm của cỏc mẫu dược liệu theo DĐVN IV, phụ lục 12.13.
Tiến hành ở 3 lụ mẻ khỏc nhau trước khi đưa vào chiết xuất, kết quả được
trỡnh bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xỏc định độ ẩm của cỏc mẫu vỏ quýt
TT Tờn mẫu Khối lượng
(g) V1(ml) V2(ml) Độ ẩm (%) 1 TB1TB (Hưng Yờn) 10,45 1,1 2,2 10,9 2 TB2TB (Bắc Giang) 10,21 1,0 2,1 10,7 3 TB3TB (Hà Nội) 10,8 1,4 2,8 12,9 Trung bỡnh 11,5 Nhận xột:
Ta thấy độ ẩm cỏc mẫu dược liệu ở cỏc lụ mẻ chiết xuất đều khỏ ổn định dưới 13% theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Vỡ vậy tiờu chuẩn dược liệu vỏ quýt quy định độ ẩm khụng quỏ 13,0%.
Tro toàn phần
Tiến hành xỏc định tro toàn phần của cỏc mẫu dược liệu ở 3 lụ mẻ khỏc nhau kết quả được trỡnh bày tại bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả xỏc định tro toàn phần của cỏc mẫu vỏ quýt
TT Tờn mẫu Lượng cõn (g) Độ ẩm (%) Khối lượng tro (g) Độ tro (%) 1 TB1TB (Hưng Yờn) 3,1 10,9 0,085 3,10
2 TB2TB (Bắc Giang) 3,5 10,7 0,091 2,91 3 TB3TB (Hà Nội) 3,4 12,9 0,085 2,87
Trung bỡnh 2,96
Nhận xột:
Độ tro toàn phần của cỏc mẫu nằm trong khoảng từ 2,87% đến 3,1% vỡ vậy quy định tiờu chuẩn cho dược liệu vỏ quýt về độ tro toàn phần khụng quỏ 5,0%.
Tro khụng tan trong acid hydrochloric
Tiến hành xỏc định độ ẩm của cỏc mẫu dược liệu ở 3 lụ mẻ khỏc nhau kết quả được trỡnh bày tại bảng 3.10:
Bảng 3.10. Kết quả xỏc định độ tro khụng tan trong acid clohydric
của cỏc mẫu vỏ quýt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TT Tờn mẫu Lượng cõn (g) Độ ẩm (%) Khối lượng tro (g) Tro khụng tan trong acid clohydric (%) 1 TB1TB (Hưng Yờn) 3,1 10,9 0,024 0,89 2 TB2TB (Bắc Giang) 3,5 10,7 0,022 0,69 3 TB3TB (Hà Nội) 3,4 12,9 0,013 0,45 Trung bỡnh 0,68 Nhận xột:
Độ tro toàn phần của dược liệu nằm trong khoảng từ 0,45% đến 0,89%, trung bỡnh 0,68%, Vỡ vậy tiờu chuẩn dược liệu được quy định độ tro khụng tan trong acid clohydric khụng quỏ 1,0%.
Tạp chất
Tạp chất lẫn trong dược liệu gồm tất cả cỏc chất ngoài quy định của dược liệu đú như: đất đỏ, cỏc bộ phận khỏc của cõy như lỏ, cành, hạt, …Xỏc định tạp chất của cỏc mẫu dược liệu ở 3 lụ mẻ khỏc nhau kết quả được trỡnh bày tại tại bảng 3.11.
TT Tờn mẫu Hàm lượng % tạp chất 1 TB1 (Hưng Yờn) 0,12% 2 TB2TB (Bắc Giang) 0,50% 3 TB3TB (Hà Nội) 1,20% Trung bỡnh 0,60% Nhận xột:
Tạp chất trong cỏc mẫu nguyờn liệu đưa vào sản xuất chủ yếu là cỏc bộ phận khỏc của cõy như lỏ, cành, hạt và chiếm khụng nhiều, trung bỡnh khoảng 1,0%. Vậy quy định tiờu chuẩn cho nguyờn liệu vỏ quýt tạp chất khụng quỏ 1,0%.
Định tớnh
Phương phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với cỏc điều kiện như ở mục 2.3.2.
- Pha tĩnh: Silica gel GF254 (Merck) đó được hoạt húa ở nhiệt độ 1050C trong 60 phỳt trước khi dựng.
- Hệ dung mụi triển khai: Ethyl acetat: methanol: nước (100: 17: 13)
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch hesperidin chuẩn trong methanol cú
nồng độ khoảng 0,2mg/ml)
Dung dịch thử: lấy 0,01 gam bột mẫu thử, thờm 50ml methanol, siờu
õm 15 phỳt, lọc. Bốc hơi dịch lọc trờn cỏch thuỷ đến cũn khoảng 2ml được dung dịch chấm sắc ký.
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ TLC của vỏ quýt (Citrus reticulata Blanco.)
Hệ dung mụi: Ethyl acetat: methanol: nước (100: 17: 13) Ký hiệu: H: Hesperidin; T1: mẫu thử 1; T2: mẫu thử 2
Quan sỏt dưới UV 366nm, sắc ký đồ của mẫu thử T1 và T2 cú một vết chớnh Rf 0,4-0,5 cú cựng màu và cựng Rf với sắc ký đồ của dung dịch hesperidin đối chiếu.
Phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tiến hành sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao với cỏc điều kiện như ở mục 2.3.4. Tiờm cỏc mẫu thử, chuẩn vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó lựa chọn ở phần định lượng, ghi sắc ký đồ của cỏc mẫu kết quả trờn sắc ký đồ của mẫu thử cho pic cú thời gian lưu trựng với thời gian lưu của hesperidin của mẫu chuẩn (hỡnh 3.3)
0 10 20 min 0 10 20 30 mAU 280nm4nm (1.00) He sp er id in A B
Hỡnh 3.3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chứa hesperidin (A) và dược liệu vỏ quýt (B).
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 mAU Ch1-280nm,4nm (1.00) /1 8 .2 5 7 N a rin g in /1 9 .3 7 3 h es pe ri di n /2 1. 1 79 /2 3 .0 6 6 /2 5 .7 96
Định lượng
Kết quả định lượng thành phần hesperidin bằng phương phỏp HPLC trong cỏc mẫu vỏ quýt được trỡnh bày tại bảng 3.12.
Bảng 3.12. Hàm lượng hesperidin trong cỏc mẫu vỏ quýt
TT Tờn mẫu Hàm lượng % hesperidin tớnh theo khối lượng khụ tuyệt đối
1 TB1TB (Hưng Yờn) 5,8%
2 TB2TB (Bắc Giang) 5,3% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 TB3TB (Hà Nội) 3,8%
Trung bỡnh 5,2%
Nhận xột:
Hàm lượng hesperidin trong cỏc mẫu thử nằm trong khoảng từ 3,8% đến 5,8%. Để ổn định nguyờn liệu đầu vào cho sản xuất chế phẩm bột citroflavonoid, giới hạn hàm lượng hesperidin trong dược liệu quy định trong tiờu chuẩn khụng được thấp hơn 4,0%
Từ cỏc khảo sỏt trờn, đưa ra tiờu chuẩn cho dược liệu vỏ quýt dựng làm nguyờn liệu để chiết xuất citroflavonoid:
+ Độ ẩm: khụng quỏ 13,0%
+ Tro toàn phần: khụng quỏ 5,0%
+ Tro khụng tan trong acid hydroclorid: khụng quỏ 1,0% + Tạp chất: tạp chất khỏc khụng quỏ 1,0%
+ Định tớnh: nhúm flavonoid và hesperidin
+ Định lượng: Hàm lượng hesperidin trong dược liệu khụng được thấp hơn 4,0% tớnh theo dược liệu khụ kiệt.
Tiến hành xõy dựng tiờu chuẩn cho sản phẩm bột citroflavonoid dựa trờn cỏc chỉ tiờu chung được quy định tại Dược điển Việt Nam IV gồm: mụ tả, độ ẩm, tro toàn phần, tro khụng tan trong acid, định tớnh, định lượng....
Kết quả thu được như sau:
Mụ tả
Bằng cảm quan ta thấy: Bột citroflavonoid là chế phẩm cú màu trắng ngà, khụng vị, mựi đặc trưng của dược liệu.
Độ ẩm
Tiến hành xỏc định độ ẩm của cỏc mẫu sản phẩm bột citroflavonoid ở 6 lụ mẻ khỏc nhau. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả xỏc định độ ẩm của cỏc mẫu
chế phẩm bột citroflavonoidBảng 3.13. Kết quả xác định độ ẩm của
các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TT Tên mẫuTờn mẫu Độ ẩm (%)Độ ẩm (%)
1 M1 4,86 2 M2 5,27 3 M3 5,41 4 M4 5,52 5 M5 5,31 6 M6 5,09 Trung bìỡnh 5,24 Nhận xột:
Độ ẩm của cỏc mẫu sản phẩm bột citroflavonoid nằm trong khoảng từ 4,86% đến 5,52%. Vỡ vậy giới hạn độ ẩm cho chế phẩm quy định khụng được quỏ 6%.
Tro toàn phần
Độ ẩm của các mẫu sản phẩm bột CF nằm trong khoảng từ 4,86% đến 5,52%. Vì vậy giới hạn độ ẩm cho chế phẩm quy định không đợc quá 6,0%
Tro toàn phần
Tiến hành xác định tro toàn phần ở 6 lơ mẻ khác nhau kết quả đợc trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả tro toàn phần của cỏc mẫu chế phẩm bột
citroflavonoid
Bảng 3.14. Kết quả tro toàn phần của các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TTTT Tờn mẫuTên mẫu Tro sulfat (%)Tro sulfat (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(%) 1 M1 1,58% 2 M2 0,78% 3 M3 1,63% 4 M4 2,57% 5 M5 0,69% 6 M6 1,66% Trung bìỡnh 0,92% Nhận xột:
Tro tồn phần của 6 mẫu chiết xuất khỏc nhau nằm trong khoảng từ 0,69% đến 2,57%, trung bỡnh là 1,485%. Vỡ vậy giới hạn tro toàn phần của bột citroflavonoid khụng được quỏ 3,0%
Định tớnh:
Nhận xét:
Tro toàn của 6 mẻ chiết xuất khác nhau nằm trong khoảng từ 0,69% đến 2,57%, trung bình là 1,485%. Vỡ vậy giới hạn tro toàn phần của bột citroflavonoid không đợc quá 3,0%.
Định tính:
- Pha tĩnh: Silica gel GF254 (Merck), hoạt húa ở 1050C/60 phỳt
- Hệ dung mụi triển khai: Ethyl acetat: methanol: nước (100: 17: 13)
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch hesperidin chuẩn trong methanol cú
nồng độ khoảng 0,2mg/ml)
Dung dịch thử: lấy 0,01 gam bột mẫu thử, thờm 50ml methanol, siờu
õm 15 phỳt, lọc. Bốc hơi dịch lọc trờn cỏch thuỷ đến cũn khoảng 2ml được dung dịch chấm sắc ký.
Quan sỏt dưới ỏnh sỏng UV-VIS 366nm, sắc ký đồ của dung dịch thử cú một vết chớnh Rf 0,4-0,5 cú cựng màu và cựng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu hesperidin.
- Thuốc thử phỏt hiện: Dung dịch nhụm clorua 2% trong ethanol
Quan sát dới UV366nm, sắc ký đồ của dung dịch thử có một vết chính Rf 0,4- 0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu hesperidin.
Định lượng
Tiến hành định lượng hesperidin 6 lụ mẻ chiết xuất, kết quả hàm lượng hesperidin được trỡnh bày trờn bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hàm lượng % hesperidin trong cỏc mẫu
chế phẩm bột citroflavonoid
Định lợng:
Tiến hành định lợng hesperidin 6 lô mẻ chiết xuất, kết quả hàm lợng hesperidin đợc trình bày tại bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hàm lợng % hesperidin trong các mẫu chế phẩm bột citroflavonoid
TTTT Tờn mẫuTên mẫu Hàm lượng % hesperidin tớnh theo khối lượng sản phẩm
khụ tuyệt đốiHàm lợng %
hesperidin tính theo khối lợng SP khơ tuyệt đối.
1 M1 70,01% 2 M2 74,80% 3 M3 70,08% 4 M4 57,30% 5 M5 68,30% 6 M6 66,83% Trung bìỡnh 67,8% Nhận xột:
Hàm lượng hesperidin của cỏc mẫu chế phẩm nằm trong khoảng từ 57,30% đến 74,08%, trung bỡnh 67,8%. Vỡ vậy, giới hạn hesperidin cho chế phẩm citroflavonoid quy định khụng được thấp hơn 55,0%.
Nhận xét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lợng hesperidin của các mẫu bột nằm trong khoảng từ 57,30% đến 74,80%, trung bình 67,8%. Vì vậy, giới hạn hesperidin cho chế phẩm citroflavonoid quy định không đợc thấp hơn 55,0%.
Độ nhiễm khuẩn
Mẫu chế phẩm bột citroflavonoid của 3 mẻ chiết xuất được gửi tới Phũng Vi sinh của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương để tiến hành thử độ nhiễm khuẩn theo phụ lục 13.6 – Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.
Kết quả đạt yờu cầu mức 4, theo yờu cầu của Dược điển Việt Nam (đối với thuốc uống).
Từ cỏc khảo sỏt trờn, đưa ra tiờu chuẩn sản phẩm bột citroflavonoid: + Độ ẩm: khụng quỏ 5,0%
+ Tro toàn phần: khụng được quỏ 3,0%
+ Định tớnh: Chế phẩm phải thể hiện phộp thử định tớnh của hesperidin + Định lượng: Hàm lượng hesperidin trong chế phẩm khụng được thấp hơn 505,0% tớnh theo chế phẩm khụ kiệt.
+ Độ nhiễm khuẩn: Đạt yờu cầu mức 4, phụ lục 13.6 – Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.