CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.3. Phương phỏp định lượng citroflavonoid bằng quang phổ tử ngoại
* Nguyờn tắc
Cỏc citroflavonoid hấp thụ mạnh ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 280- 290nm. Do vậy, cú thể xỏc định hàm lượng của citroflavonoid toàn phần tớnh theo một chất chuẩn nào đú bằng phương phỏp đo quang. Đối tượng nghiờn cứu của đề tài là citroflavonoid nờn cú thể lựa chọn hai chất điển hỡnh là hesperidin hoặc naringin để xõy dựng phộp định lượng.
* Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu đối chiếu
Mẫu đối chiếu naringin
Cõn chớnh xỏc 0,0050g naringin đối chiếu vào bỡnh định mức 50ml. Thờm 40 MeOH, lắc siờu õm đến hũa tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phũng, thờm MeOH đến vạch, lắc đều. Hỳt chớnh xỏc 1ml thu được vào bỡnh định mức 10ml. Thờm MeOH đến vạch, lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch naringin đối chiếu ở bước súng 283nm so với MeOH (Dc)
Mẫu đối chiếu hesperidin
Cõn chớnh xỏc 0,0050g hesperidin đối chiếu vào bỡnh định mức 250ml. Thờm 200ml MeOH, lắc siờu õm đến hũa tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phũng, thờm MeOH đến vạch và lắc đều. Hỳt chớnh xỏc 5ml dung dịch thu được vào bỡnh định mức 10ml. Thờm MeOH đến vạch và lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch hesperidin đối chiếu ở bước súng 283nm so với MeOH (Dc)
- Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu
Cõn chớnh xỏc khoảng 2,5g bột dược liệu (P g) cho vào tỳi giấy lọc rồi cho vào bỡnh Soxhlet. Chiết với n-hexan cho đến khi dịch chiết khụng màu. Lấy tỳi giấy lọc đựng dược liệu ra để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ phũng rồi cho vào bỡnh Soxhlet chiết tiếp với MeOH trong 12 giờ đến khi dịch chiết khụng màu. Dịch chiết thu được chuyển vào bỡnh cất quay và đem cụ dưới ỏp suất giảm đến khụ kiệt. Hũa cắn trong 50ml MeOH rồi chuyển định lượng vào bỡnh định mức 100ml. Rửa bỡnh cầu 2-3 lần thu được dung dịch A. Hỳt chớnh xỏc 1ml dung dịch A vào bỡnh định mức 50ml. Thờm MeOH đến vạch, lắc đều thu được dung dịch thử. Đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bước súng 283nm so với MeOH (Dx)
Chuẩn bị mẫu thử từ bột chế phẩm
Cõn chớnh xỏc khoảng 0,100g (P g) bột chế phẩm citroflavonoid vào cốc thủy tinh. Hũa tan bột trong 50ml MeOH rồi chuyển định lượng vào bỡnh
định mức 100ml. Rửa cốc 2-3 lần bằng MeOH, chuyển dịch rửa vào bỡnh định mức. Thờm MeOH đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch A. Hỳt chớnh xỏc 1ml dung dịch A vào bỡnh định mức 50ml. Thờm MeOH đến vạch, lắc đều thu được dung dịch thử. Đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bước súng 283nm so với MeOH (Dx)
* Kết quả
Hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong dược liệu được tớnh theo cụng thức:
X (%)= Trong đú:
X: hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong dược liệu tớnh theo naringin hoặc hesperidin (%)
P: khối lượng bột dl đó cõn để định lượng (g) Dx: Mật độ quang của mẫu thử ở 283nm
Dc: Mật độ quang của mẫu naringin hoặc hesperidin đối chiếu ở 283nm W: độ ẩm của bột dl (%)
Hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm chiết được tớnh theo cụng thức:
Trong đú:
X: hàm lượng citroflavonoid toàn phần tớnh theo naringin hoặc hesperidin trong sản phẩm chiết xuất (%).
P: khối lượng sản phẩm cx đó cõn để định lượng (g). Dx: Mật độ quang của mẫu thử ở 283 nm.
2.3.4. Phương phỏp định lượng citroflavonoid trong dược liệu và sản phẩm chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Định lượng hàm lượng citroflavonoid trong dược liệu và trong sản phẩm chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành theo phương phỏp từ
nghiờn cứu “ Xõy dựng phương phỏp định tớnh, định lượng đồng thời naringin
và hesperidin trong vỏ quả cỏc loài thuộc chi Citrus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao“ (Pphụ lục 8).
- Dung dịch mẫu chuẩn: Chuẩn bị một dóy dung dịch chuẩn hesperidin
trong methanol cú nồng độ chất chớnh xỏc khoảng: 5, 30, 60, 100 và 200 àg/ml.
- Dung dịch thử từ dược liệu: Cõn chớnh xỏc khoảng 0,2g bột dược liệu,
thờm chớnh xỏc 50,0ml MeOH, cõn xỏc định khối lượng bỡnh, siờu õm 30 phỳt, để nguội, bổ sung lượng MeOH hao hụt cho vừa đủ khối lượng cõn trước, lọc qua giấy lọc rồi lọc qua màng lọc kớch cỡ 0,45àm được dung dịch để tiờm sắc ký.
- Dung dịch thử từ chế phẩm bột citroflavonoid: Cõn chớnh xỏc khoảng
0,02g bột chế phẩm vào bỡnh định mức 100, thờm 80ml methanol, siờu õm 30 phỳt, để nguội, bổ sung methanol vừa đủ, lọc qua màng lọc kớch cỡ 0,45àm được dung dịch để tiờm sắc ký.
- Điều kiện sắc ký:
Cột LiChrospher RP18 (250 x 4,6mm ID, 5àm).
Detector Diod array L-2455 với bước súng 280nm, quột phổ trong khoảng từ 200nm đến 400nm.
Tốc độ dũng: 0,7 ml/phỳt, điều chỉnh nếu cần thiết (trong khoảng 0,5- 1ml/phỳt).
Thể tớch tiờm: 10àl.
Pha động: Acetonnitril (A) và dung dịch acid phosphoric 0,1% (B). Pha động được rửa giải theo chương trỡnh gradient như sau:
Thời gian (phỳt) A (%, tt/tt) B (%, tt/tt) Kiểu rửa giải 0 – 27 22 78 Đẳng dũng 27 – 40 70 30 Gradient 40 – 43 22 78 Gradient 43 – 45 22 78 Đẳng dũng - Cỏch tiến hành:
+ Kiểm tra tớnh thớch hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn chuẩn cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 60 àg/ml đó chuẩn bị ở trờn, độ lệch chuẩn tương đối của cỏc diện tớch đỏp ứng từ 6 lần tiờm lặp lại khụng được lớn hơn 2,0%.
+ Tiờm riờng biệt cỏc dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận cỏc sắc ký đồ. Thiết lập đường chuẩn của hesperidin giữa nồng độ dung dịch (àg/ml)
và diện tớch pic tương ứng theo phương trỡnh y= ax+b
+ Tiờm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ. Tớnh nồng độ hesperidin trong dung dịch thử (àg/ml) dựa trờn phương trỡnh đường chuẩn đó xõy dựng.
Hàm lượng hesperidin cú trong mẫu dược liệu (%) tớnh theo dược liệu khụ kiệt được tớnh bằng cụng thức:
X (%) = C x 50
mdl x (100 –a) x 100
Hàm lượng hesperidin cú trong mẫu chế phẩm bột citroflavonoid (%) tớnh theo chế phẩm khụ kiệt được tớnh bằng cụng thức:
X (%) = msp x (100 –a) Trong đú:
C: Nồng độ của hesperidin trong dung dịch mẫu thử (àg/ml) mdl: Khối lượng mẫu thử dược liệu (g)
msp: Khối lượng mẫu thử chế phẩm bột citroflavonoid (mg) a: Độ ẩm mẫu thử (%)