Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân da cá da trơn thành acid amin làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM THỊ TÂM TS ĐẶNG MINH HIẾU Hà Nội - 2015 MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 13 MỤC TIÊU 14 2.1 Mục tiêu chung 14 2.2 Mục tiêu cụ thể 14 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 3.1.1 Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học gelatinase tái tổ hợp 14 3.1.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp 15 3.1.3 Nghiên cứu đánh giá tiêu an toàn thực phẩm acid amin thủy phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trƣờng diễn ) 15 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 15 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 I Tổng quan gelatin gelatinase 16 I.1 Gelatin 16 I.2 Gelatinase 18 I.3 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase .19 I.3.1 Vi khuẩn Pseudomonas 19 I.3.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 21 I.4 Tình hình thực tế nuôi trồng cá da trơn chế biến phụ phẩm cá da trơn Việt Nam 23 I.5 Thành phần thủy phân từ da cá 25 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 II.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .28 II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 II.2.1 Vật liệu hóa chất .28 II.2.2 Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học gelatinase tái tổ hợp 29 II.2.2.1 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 30 II.2.2.2 Phƣơng pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính độ bền nhiệt gelatinase tái tổ hợp 30 II.2.2.3 Phƣơng pháp xác định pH thích hợp cho hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 31 II.2.2.4 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 31 II.2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 31 II.2.3 Nghiên cứu điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp .32 II.2.3.1 Phương pháp tiền thủy phân hóa học da cá da trơn 32 II.2.3.2 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng nồng độ enzyme khả thủy phân enzyme gelatinase tái tổ hợp mẫu da cá xử lý qua dung dịch kiềm NaOH 2M 34 II.2.3.3 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng pH khả thủy phân enzyme gelatinase tái tổ hợp mẫu da cá tra/ ba sa qua tiền xử lý dung dịch kiềm NaOH 2M 35 II.2.3.4 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu thủy phân 35 II.2.3.5 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng thời gian đến hiệu thủy phân 36 II.3 Nghiên cứu đánh giá tiêu an toàn thực phẩm acid amin thủy phân 36 II.3.1 Phƣơng pháp kiểm tra tiêu vi sinh vật 36 II.3.1.1 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) 36 II.3.1.2 Xác định Salmonella sp: TCVN 4829:2005 (ISO 06579:2002) 36 II.3.1.3 Xác định Staphylococcus sp: TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999, With Amd :2003) 36 II.3.2 Phƣơng pháp xác định độc tính cấp tính 37 II.3.3 Phƣơng pháp xác định độc tính bán trƣờng diễn 37 III.1 Xác định số đặc tính vật lý, hóa học gelatinase tái tổ hợp 39 III.1.1 Ảnh hƣởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 39 III.1.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ độ bền nhiệt gelatinase tái tổ hợp 40 III.1.3 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính enzyme gelatinase tái tổ hợp 42 III.1.4 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 42 III.1.5 Ảnh hƣởng dung mơi hữu đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 43 III.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp .44 III.2.1 Các điều kiện tiền thủy phân da cá 44 III.2.1.1 Kết xác định nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/basa 44 III.2.1.2 Kết xác định pH tiền thủy phân da cá tra/basa 45 III.2.1.3 Kết xác định thời gian tiền xử lý da cá tra/basa 46 III.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân da cá enzyme gelatinase tái tổ hợp 46 III.2.2 Ảnh hƣởng chất kiểm soát pH đến trình thủy phân da cá enzyme gelatinase tái tổ hợp .47 III.2.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 48 III.2.4 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất thủy phân 49 III.2.5 Phân tích thành phần axit amin sản phẩm thủy phân 49 III.3 Đánh giá tiêu an toàn thực phẩm acid amin thủy phân 50 III.3.1 Kết kiểm tra tiêu vi sinh vật 50 a Xác định mật độ vi sinh hiếu khí tổng số 51 b Kết định lƣợng mật độ E.coli 51 c Kết định lƣợng Salmonella sp Staphylococcus sp 52 III.3.2 Kết xác định độc tính cấp tính chuột nhắt trắng [3,4] 53 III.3.3 Kết xác định độc tính bán trƣờng diễn 53 Công thức máu chó thí nghiệm 53 Kết theo dõi số chức gan 58 Kết theo dõi số chức thận 61 Đánh giá bệnh tích vi thể gan, thận chó thí nghiệm 62 PHẦN III – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1 Kết luận 66 4.1.1 Xác định số đặc tính vật lý, hóa học enzyme gelatinase tái tổ hợp sau: 66 4.1.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp 66 4.1.3 Kiểm tra tiêu vi sinh, độc tính mẫu acid amin thủy phân từ da cá tra/cá basa 67 4.2 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 I Tài liệu tham khảo tiếng Việt 68 II Tài liệu tham khảo tiếng Anh 68 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy giáo, cô giáo giảng dạy môn Công nghệ sinh học – Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi em học tập hồn thành khóa học Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Thị Tâm TS Đặng Minh Hiếu, thầy cô trực tiếp hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới hỗ trợ tài nhƣ phƣơng pháp từ đề tài cấp Nhà nƣớc mã số KC06.15/11-15 Em xin cảm ơn tập thể cán Khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Sau đại học trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em để em thực đƣợc nội dung đề tài Trong trình học tập thực đề tài em khơng tránh khỏi đƣợc sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn bỏ qua đóng góp ý kiến để em hoàn thiện Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học Hà Nội, tháng năm 2015 Ngƣời viết luận văn Đào Văn Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu tơi, nằm nhánh nhỏ đề tài “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất gelatinase tái tổ hợp ứng dụng công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm “ cấp Nhà nƣớc mang mã số KC06.15/11-15 Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tác giả Đào Văn Nguyên DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần axit amin gelatin 17 Bảng Một số loài vi khuẩn có khả sinh gelatinase 19 Bảng Các thành phần acid amin chủ yếu da số loại cá nƣớc lạnh, nƣớc ấm bì lợn (thành phần 1000g) .26 Bảng - Ảnh hƣởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp .39 Bảng 5: Thành phần acid amin dịch thủy phân .50 Bảng 6a: Kết xác định mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí mẫu 51 axit amin 51 Bảng 6b: Kết xác định mật độ E coli bột axit amin 51 Bảng 7: Kết xác định mật độ Salmonella Staphylococcus 52 bột axit amin 52 Bảng 8: Kết kiểm tra cơng thức máu chó sau 15 ngày uống thuốc .54 Bảng 9: Kết kiểm tra công thức máu chó sau 30 ngày uống thuốc .55 Bảng 10: Kết kiểm tra công thức máu chó sau 60 ngày uống thuốc 56 Bảng 11: Kết kiểm tra cơng thức máu chó trƣớc 15 ngày dừng 57 uống thuốc 57 Bảng 12: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 15 ngày 58 uống thuốc 58 Bảng 13: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 30 ngày 59 uống thuốc 59 Bảng 14: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 60 ngày uống thuốc 59 Bảng 15: Kết kiểm tra số chức gan chó trƣớc 15 ngày dừng uống thuốc 60 Bảng 16: Nồng độ albumin huyết chó lơ thí nghiệm (mg/dl) 61 Bảng 17: Nồng độ creatinin huyết chó lơ thí nghiệm (µmol/l) 62 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Thành phần cấu trúc gelatin 17 Hình 2a Cấu trúc gelatinase A 18 Hình 2b Cấu trúc gelatinase B 18 Hình Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa .20 Hình Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas 21 Hình Hình thái A hydrophila 22 Hình Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila .23 Hình 8.a Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase 41 Hình 8.b Ảnh hƣởng thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính gelatinase 41 Hình - Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 42 Hình 10 - Ảnh hƣởng chất tẩy rửa đến hoạt tính 43 gelatinase tái tổ hợp 43 Hình 11 - Ảnh hƣởng dung mơi hữu đến hoạt tính gelatinase 44 Hình 12 Ảnh hƣởng nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/cá basa 45 Hình 13 - Ảnh hƣởng độ pH dịch thủy phân đến hiệu tiền xử lý 46 Hình 14 - Ảnh hƣởng thời gian tiền thủy phân tới hiệu thủy phân .46 Hình 15 - Ảnh hƣởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân .47 Hình 16- Ảnh hƣởng pH đến hoạt động enzyme gelatinase tái tổ hợp trình thủy phân da cá tra/ ba sa qua tiền xử lý kiềm 47 Hình 17 - Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 49 Hình 18 - Ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất thủy phân 49 Hình 19 - Hình ảnh vi thể gan chó bình thƣờng .63 Hình 20 - Hình ảnh vi thể gan chó sử dụng amino acid 63 Hình 21 - Mơ học sinh thiết thận chó bình thƣờng 64 Hình 22 - Mơ học sinh thiết thận chó sử dụng bột amino acid thủy phân 65 10 Bảng 9: Kết kiểm tra công thức máu chó sau 30 ngày uống thuốc Lơ uống thuốc Chỉ tiêu theo dõi Đối chứng 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg 9.65 ± 0.33 9.46 ± 0.34 9.65 ± 0.33 9.45 ± 0.34 62.16 ± 0.29 63.21 ± 0.18 63.26 ± 0.29 63.25 ± 0.18 6.05 ± 0.15 5.70 ± 0.22 5.8 ± 0.15 5.72± 0.22 (Monocytes, %) 3.32 ± 0.19 3.75 ± 0.24 3.65 ± 0.19 3.7 ± 0.24 Lâm ba cầu (Lymphocytes, %) 21.04 ± 0.32 26.83 ± 0.25 21.07 ± 0.32 26.45 ± 0.25 %) 0.53 ± 0.05 0.51 ± 0.05 0.51 ± 0.05 0.51 ± 0.05 Số lƣợng hồng cầu (triệu/mm3) 5.69 ± 0.41 6.27 ± 0.35 5.89 ± 0.41 6.06± 0.35 Hàm lƣợng huyết sắc tố (g%) 12.25 ± 0.28 13.88 ± 0.25 13.05 ± 0.28 13.25 ±0.34 Tỉ khối huyết cầu (%) 37,89 ± 0.42 38.92 ± 0.27 38.11 ± 0.42 38.21 ± 0.18 62.61 ± 0.39 62.07 ± 0.33 61.55 ± 0.39 51.70 ± 0.22 33,92 ± 0.29 34.11 ± 0.35 33.78 ± 0.29 33.75 ± 0.24 21,98 ± 0.22 23.05 ± 0.12 21.62 ± 0.22 21.83 ± 0.25 Số lƣợng bạch cầu (nghìn/mm3) Bạch cầu đa nhân trung tính (Neutrophile, %) Bạch cầu toan (Eosinophile, %) Bạch cầu đơn nhân lớn Bạch cầu kiềm (Basophile, Thể tích trung bình hồng cầu (µm3) Lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (%) 55 Bảng 10: Kết kiểm tra cơng thức máu chó sau 60 ngày uống thuốc Lô uống thuốc Chỉ tiêu theo dõi Đối chứng 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg 9.25 ± 0.33 9.27 ± 0.34 9.35 ± 0.33 9.25 ± 0.34 62.16 ± 0.29 63.21 ± 0.18 63.16 ± 0.29 63.15 ± 0.18 5.25 ± 0.15 5.29 ± 0.22 5.19 ± 0.15 5.22± 0.22 (Monocytes, %) 3.42 ± 0.19 3.25 ± 0.24 3.28 ± 0.19 3.26 ± 0.24 Lâm ba cầu (Lymphocytes, %) 21.47 ± 0.32 21.27 ± 0.25 21.25 ± 0.32 21.28 ± 0.25 Bạch cầu kiềm (Basophile, %) 0.51 ± 0.05 0.51± 0.05 0.51 ± 0.05 0.51 ± 0.05 Số lƣợng hồng cầu (triệu/mm3) 6.21 ± 0.41 6.17± 0.35 6.44± 0.41 6.16± 0.35 Hàm lƣợng huyết sắc tố (g%) 13.17 ± 0.28 13.15 ± 0.25 13.13 ± 0.28 13.28 ±0.34 Tỉ khối huyết cầu (%) 38.29 ± 0.42 38.21 ± 0.27 38.29 ± 0.42 38.33± 0.18 52.71 ± 0.39 51.87 ± 0.33 51.55 ± 0.39 51.69± 0.22 33,62 ± 0.29 33.81 ± 0.35 33.78 ± 0.29 33.89 ± 0.24 22,18 ± 0.22 22.35 ± 0.12 21.62 ± 0.22 21.73 ± 0.25 Số lƣợng bạch cầu (nghìn/mm3) Bạch cầu đa nhân trung tính (Neutrophile, %) Bạch cầu toan (Eosinophile, %) Bạch cầu đơn nhân lớn Thể tích trung bình hồng cầu (µm3) Lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (%) 56 Bảng 11: Kết kiểm tra công thức máu chó trƣớc 15 ngày dừng uống thuốc Lơ uống thuốc Chỉ tiêu theo dõi Đối chứng 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg 9.45 ± 0.34 9.41 ± 0.34 9.5 ± 0.33 9.65 ± 0.33 63.25 ± 0.18 63.28 ± 0.18 63.25 ± 0.29 62.16 ± 0.29 6.05 ± 0.15 5.70 ± 0.22 5.8 ± 0.15 5.72± 0.22 (Monocytes, %) 3.32 ± 0.19 3.75 ± 0.24 3.65 ± 0.19 3.7 ± 0.24 Lâm ba cầu (Lymphocytes, %) 21.04 ± 0.32 26.83 ± 0.25 21.07 ± 0.32 26.45 ± 0.25 Bạch cầu kiềm (Basophile, %) 0.53 ± 0.05 0.51 ± 0.05 0.51 ± 0.05 0.51 ± 0.05 Số lƣợng hồng cầu (triệu/mm3) 5.69 ± 0.41 6.27 ± 0.35 5.89 ± 0.41 6.06± 0.35 Hàm lƣợng huyết sắc tố (g%) 12.25 ± 0.28 13.88 ± 0.25 13.05 ± 0.28 13.25 ±0.34 Tỉ khối huyết cầu (%) 37,89 ± 0.42 38.92 ± 0.27 38.11 ± 0.42 38.21 ± 0.18 62.61 ± 0.39 62.07 ± 0.33 61.55 ± 0.39 51.70 ± 0.22 33,92 ± 0.29 34.11 ± 0.35 33.78 ± 0.29 33.75 ± 0.24 Nồng độ huyết sắc tố trung bình 21,98 ± 0.22 23.05 ± 0.12 21.62 ± 0.22 21.83 ± 0.25 Số lƣợng bạch cầu (nghìn/mm3) Bạch cầu đa nhân trung tính (Neutrophile, %) Bạch cầu toan (Eosinophile, %) Bạch cầu đơn nhân lớn Thể tích trung bình hồng cầu (µm3) Lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) 57 hồng cầu (%) Nhận xét: Khi cho chó uống bột amino acid liều khác nhau, kết cho thấy: - Số lƣợng bạch cầu: thời điểm đánh giá: sau 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày uống thuốc liên tục khơng thấy có khác biệt đáng kể (P > 0,05) lô đối chứng lô uống thuốc thời điểm Tuy nhiên, so sánh với thân động vật trƣớc dùng thuốc lơ lơ sau 60 ngày uống thuốc số lƣợng bạch cầu tăng có ý nghĩa thống kê nhƣng sau ngừng thuốc số lƣợng bạch cầu lại trở bình thƣờng - Số lƣợng hồng cầu: Nhìn chung lô uống thuốc, số lƣợng hồng cầu thay đổi ý nghĩa thống kê (P > 0,05) - Nồng độ hemoglobin: Ở thời điểm theo dõi, không thấy có khác biệt nồng độ hemoglobin lơ thử thuốc lô chứng nhƣ so sánh với thân trƣớc dùng thuốc Nhƣ vậy, cho uống bột amino acid liều khác khơng thấy ảnh hƣởng có ý nghĩa thống kê số huyết học Kết theo dõi số chức gan Kết theo dõi nồng độ bilirubin, hoạt độ enzym AST, hoạt độ enzym ALT, protein tồn phần máu thỏ lơ thí nghiêm đƣợc trình bày bảng 12, 13, 14, 15 Bảng 12: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 15 ngày uống thuốc Chỉ tiêu Đơn vị Bình thƣờng Đối chứng Lơ uống thuốc 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg AST* U/l 8,9 - 48,5 10.46 ± 0.34 10,6 ± 3,25 10.8 ± 0.15 10.46 ± 0.34 ALT* U/l 8,2 - 57,3 23.21 ± 0.18 24,4 ± 4,60 23.65 ± 0.19 24.21 ± 0.18 58 Urea Mmol/L 3,1 - 9,2 6.70 ± 0.22 6,7 ± 0,08 7.07 ± 0.32 6.70 ± 0.22 Creatinin µmol/L 44,3 - 138,4 83.75 ± 0.24 84,4 ± 2,20 83.51 ± 0.05 83.75 ± 0.24 Protein g/L 25,1 - 75,2 68.83 ± 0.25 68,3 ± 2,05 67.89 ± 0.41 66.83 ± 0.25 Albumin g/L 25,8 - 39,7 32.51 ± 0.05 32,6 ± 1,69 33.05 ± 0.28 32.51 ± 0.05 *: AST: aspartate amino tranferase, ALT: alanin amino transferase Bảng 13: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 30 ngày uống thuốc Chỉ tiêu Đơn vị Bình thƣờng Đối chứng Lơ uống thuốc 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg AST* U/l 8,9 - 48,5 10.46 ± 0.34 10.65 ± 0.33 10.25 ± 0.28 10.88 ± 0.25 ALT* U/l 8,2 - 57,3 23.21 ± 0.18 23.16 ± 0.29 22,89 ± 0.42 22.92 ± 0.27 Urea Mmol/L 3,1 - 9,2 6.70 ± 0.22 7.05 ± 0.15 6.61 ± 0.39 6.07 ± 0.33 Creatinin µmol/L 44,3 - 138,4 83.75 ± 0.24 83.32 ± 0.19 83,92 ± 0.29 84.11 ± 0.35 Protein g/L 25,1 - 75,2 68.83 ± 0.25 67.04 ± 0.32 67,98 ± 0.22 67.05 ± 0.12 Albumin g/L 25,8 - 39,7 32.51 ± 0.05 32.53 ± 0.05 33.75 ± 0.24 32.51 ± 0.05 Bảng 14: Kết kiểm tra số chức gan chó sau 60 ngày uống thuốc Chỉ tiêu Đơn vị Bình thƣờng Đối chứng Lô uống thuốc 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg AST* U/l 8,9 - 48,5 10.67 ± 0.33 10.88 ± 0.25 10.65 ± 0.33 10.25 ± 0.28 ALT* U/l 8,2 - 57,3 23.26 ± 0.29 22.92 ± 0.27 23.16 ± 0.29 22,89 ± 0.42 59 Urea Mmol/L 3,1 - 9,2 7.8 ± 0.15 6.07 ± 0.33 7.05 ± 0.15 6.61 ± 0.39 Creatinin µmol/L 44,3 - 138,4 83.65 ± 0.19 84.11 ± 0.35 83.32 ± 0.19 83,92 ± 0.29 Protein g/L 25,1 - 75,2 67.07 ± 0.32 67.05 ± 0.12 67.04 ± 0.32 67,98 ± 0.22 Albumin g/L 25,8 - 39,7 32.51 ± 0.05 32.51 ± 0.05 32.53 ± 0.05 33.75 ± 0.24 Bảng 15: Kết kiểm tra số chức gan chó trƣớc 15 ngày dừng uống thuốc Chỉ tiêu Đơn vị Bình thƣờng Đối chứng Lô uống thuốc 0,1mg /kg 0,5mg /kg 1mg /kg AST* U/l 8,9 - 48,5 10.46 ± 0.34 10.8 ± 0.15 10.88 ± 0.25 10.25 ± 0.28 ALT* U/l 8,2 - 57,3 24.21 ± 0.18 23.65 ± 0.19 22.92 ± 0.27 22,89 ± 0.42 Urea Mmol/L 3,1 - 9,2 6.70 ± 0.22 7.07 ± 0.32 6.61 ± 0.39 6.07 ± 0.33 Creatinin µmol/L 44,3 - 138,4 83.75 ± 0.24 83.51 ± 0.05 84.11 ± 0.35 83,92 ± 0.29 Protein g/L 25,1 - 75,2 66.83 ± 0.25 67.89 ± 0.41 67.05 ± 0.12 67,98 ± 0.22 Albumin g/L 25,8 - 39,7 32.51 ± 0.05 33.05 ± 0.28 32.51 ± 0.05 33.75 ± 0.24 Nhận xét: : Ở lô thử nghiệm cho uống amino acid với liều khác nhau, số chức gan cho thấy: - Nồng độ bilirubin, hoạt độ enzyme AST, ALT huyết ổn định, khơng có thay đổi có ý nghĩa đƣợc thấy tất lô thử nhƣ lô chứng, trƣớc sau thử thuốc, kể ngừng thuốc - Nồng độ protein huyết thanh: Nhìn chung, thuốc khơng có ảnh hƣởng rõ rệt đến nồng độ protein huyết chó lơ thử so với lô đối chứng thời 60 điểm Tuy nhiên có khác biệt nồng độ protein huyết có ý nghĩa sau 60 ngày uống chế phẩm so với trƣớc uống tất lô thử Kết theo dõi số chức thận Kết theo dõi số thuộc chức thận bao gồm: ure huyết creatinin huyết bảng 16 17 Bảng 16: Nồng độ albumin huyết chó lơ thí nghiệm (mg/dl) Lơ thử Lơ Trƣớc uống 2,360 ± 3,72 Sau 15 uống uống uống ngày ngừng 2,07 ± 6,40 2,97 ± 5,42 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 2,72 ± 4,70 2,50 ± 2,97 2,46 ± 5,96 2,69 ± 2,55 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 2,36 ± 2,06 35,91 ± 3,47 28,39 ± 2,35 39,35 ˃ 0,05 trƣớc Lô Sau 60 ngày 2,87 ± 1,90 Lô P so với 2,355 ± 3,78 P so với chứng Sau 30 ngày 2,69 ± 3,47 P so với trƣớc P so với chứng Sau 15 ngày P so với trƣớc 3,60 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 2,15 ± 3,78 2,72 ± 4,70 2,8 ± 2,97 2,46 ± 5,96 2,69 ± 2,55 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 P so với trƣớc P so với chứng 2,47 ± ˃ 0,05 P so với chứng Lô ± 33,80 ˃ 0,05 61 Bảng 17: Nồng độ creatinin huyết chó lơ thí nghiệm (µmol/l) Trƣớc Sau 15 ngày Sau 30 ngày Sau 60 ngày Sau 15 ngày uống uống uống uống ngừng 1,7 ± 4,72 1,78 ± 15,44 1,82 ± 10,09 1,76 ± 8,78 1,79 ± 5,13 P so với trƣớc ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 P so với chứng ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 Lô 1,91 ± 10,60 1,94 ± 3,77 1,92 ± 8,76 1,88 ± 5,37 P so với trƣớc ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 P so với chứng ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 Lô 1,91 ± 5,75 1,86 ± 7,62 1,76 ± 7,89 1,86 ± 6,22 P so với trƣớc ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 P so với chứng ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 Lô 1,87 ± 11,28 1,8 ± 3,46 1,84 ± 10,32 1,9 ± 7,74 P so với trƣớc ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 P so với chứng ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 ˃ 0,05 Lô thử Lô 1,68 ± 5,03 1,86 ± 5,55 1,91 ± 3,49 Kết bảng 16 17 cho thấy: nồng độ albumin creatinin huyết chó khơng thấy có thay đổi có ý nghĩa lô thử thuốc lô đối chứng điều kiện thí nghiệm (P > 0,05) Đánh giá bệnh tích vi thể gan, thận chó thí nghiệm Kết theo dõi biến đổi mức độ vi thể gan thận chó thông qua mẫu sinh thiết đƣợc thể hình 18, 19 hình 20, 21 62 Hình 19 - Hình ảnh vi thể gan chó bình thƣờng Hình 20 - Hình ảnh vi thể gan chó sử dụng amino acid Nhìn chung, gan chó sử dụng amino acid khơng có biểu bất thƣờng tố chức vi thể Mơ gan bình thƣờng, tế bào khơng có biến đổi hình thái, 63 cấu trúc nhân, nguyên sinh chất Các tĩnh mạch cửa gan sáng, khơng có biểu sung huyết, xuất huyết Với hàm lƣợng amino acid 0,1mg/kg, 0,5mg/kg, 1mg/kg sử dụng đƣờng cho ăn cho chó khơng gây biến đổi tổ chức vi thể gan Hình 21 - Mơ học sinh thiết thận chó bình thƣờng 64 Hình 22 - Mơ học sinh thiết thận chó sử dụng bột amino acid thủy phân Giải phẫu vi thể thận chó đƣợc uống amino acid cho thấy: lòng ống thận sáng, nhân tế bào biểu mô, gian mô nội mô bắt màu rõ nét, nguyên sinh chất phân bố đều, lịng mạch sáng, khơng có biểu xung huyết, xuất huyết, khơng có phát cặn lịng ống thận 65 PHẦN III – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1.1 Xác định số đặc tính vật lý, hóa học enzyme gelatinase tái tổ hợp sau: - Các ion Mg2+, Ca2+, Cu2+ khơng làm ảnh hƣởng mà cịn làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gelatinase, ion Ca2+ Trong ion nhƣ: Fe2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzyme EDTA β-mercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính enzyme gelatinase - Các kết nghiên cứu rằng, enzyme gelatinase tái tổ hợp hoạt động tốt 50oC 12 xử lý - Gelatinase tái tổ hợp hoạt động mạnh khoảng pH từ – 7.5 có bổ sung Ca2+ - Tween 20 nồng độ 0,3 – % hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến hoạt tính gelatinase - Triton X-100 nồng độ 1% có ảnh hƣởng nhẹ đến hoạt tính gelatinase, nồng độ hoạt tính gelatinase đạt 87% so với hoạt tính ban đầu - Nồng độ SDS cao hoạt tính enzyem gelatinase tái tổ hợp thấp - n-butanol (nBtOH) có ảnh hƣởng ức chế rõ rệt hoạt tính enzyme gelatinase Ví dụ nhƣ: Sau ủ với n-butanol 50oC, hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh xuống cịn 75% nồng độ 10% n-butanol 64% nồng độ 20% 30% - Các dung môi hữu khác nhƣ methanol, ethanol, isopropanol aceton hầu nhƣ không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính enzyme 4.1.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp a Các điều kiện thủy phân da cá: xử lý da cá trƣớc thủy phân enzyme gelatinase tái tổ hợp 80oC, pH = 10, t = 10h b Nồng độ thích hợp enzyme 75UI thử với dung dịch 30% gelatin bột 66 c pH thích hợp cho hoạt động enzyme gelatinase tái tổ hợp thủy phân phụ phẩm chế biến cá tra/ ba sa qua tiền xử lý pH = 7,5 d Nhiệt độ từ 500C -550C thích hợp cho q trình thủy phân đạt hiệu cao e Ở thời điểm 12h, hiệu trình thủy phân đạt giá trị cao 75,21%, sau giảm nhẹ 6h tiếp theo, sau 24h hiệu suất thủy phân giảm mạnh đạt 21,69% 4.1.3 Kiểm tra tiêu vi sinh, độc tính mẫu acid amin thủy phân từ da cá tra/cá basa Kết kiểm tra số vi sinh vật thử nghiệm động vật thí nghiệm cho thấy acid amin đảm bảo tiêu chuẩn an tồn vệ sinh thực phẩm, có tính an tồn với động vật thí nghiệm 4.2 Kiến nghị - Có thể tiến hành thử nghiệm tính an tồn acid amin thủy phân từ da cá da trơn gelatinase tái tổ hợp nhiều đối tƣợng khác để làm sở quan trọng mở rộng diện ứng dụng sản phẩm - Nghiên cứu sử dụng bột acid amin để sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm - Phối hợp sử dụng gelatinase để thủy phân phụ phẩm chế biến cá da trơn thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao - Tiếp tục nghiên cứu, tuyển chọn, tạo chủng giống có hoạt tính gelatinase mạnh, nhằm làm đa dạng nguồn enzyme để ứng dụng vào thực tiễn 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Trần Thanh Nhãn "Tối ƣu hóa quy trình sản xuất gelatine từ da cá tra nhờ cơng nghệ enzyme" Tạp chí Nghiên cứu y học, phụ số 2, 2009 [2] Phạm Mỹ Dung, Đào Thị Hồng Vân, Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Lê Huy Hàm (2014) Biểu ge mã hóa gelatinase Pseudomonas sp Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn số 102014 [3] Đỗ Trung Đàm, Phƣơng pháp xác định độc tính cấp thuốc, NXB Y học – Hà Nội, (1996) [4] Viện Dƣợc liệu, Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc từ dƣợc thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật, (2006) II Tài liệu tham khảo tiếng Anh [5] B Jamilah, K.G Harvinder, 2002 Properties of gelatins from skins of fishblack tilapia ( Oreochromis mossambicus) and red tilapia (Oreochromis nilotica) Food Chemistry 77 (2002) page: 81–84 [6] C.S.Cheow, M.S Norizad, Z.Y.Kyaw, N.K.Howell, 2007 Preparation and characterisation of gelatins from the skins of sin croaker (Jonius dussumieri) and shortfin scad (Decapterus macrosoma), Food Chemistry, 101, 2007, p386 – 391 [7] M.C Gómez-Guillén, B Giménez, P Montero Extraction of gelatin from fish skins by high pressure treatment, 2005, Food Hydrocolloids, 19, 5, 923-928 [8] Gudmundsson, M., Hafsteinsson, H., 1997 Gelatin from cod skins as affected by chemical treatments, journal of food science, 62, 37 – 39 [9] Ball, A S Bacterial Cell Culture (Essential Data) 1997 p.64 John Wiley & Sons Ltd UK [10] Tran, L H., and Nagano, H J of Food Science; 2002 67(3): 1184 [11] Rosen, H Arch of Biochem Biophys 1957.67: 10 68 [12] Nguyen, H.T.M., Sylla, K.S.B., Randriamahatody, Z., Donnay-Moreno, C., Moreau, J., Tran, L.T., Bergé, J.P 2011 Enzymatic hydrolysis of yellowfi n tuna (Thunnus albacares) by-products using Protamex protease Food Technology and Biotechnology 49 (1): 48 - 55 [13] Liaset, B, Nortvedt, R, Lied, E, Espe, M 2002 Studies on the nitrogen recovery in enzymatic hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar, L.) frames by ProtamexTM protease Process Biochemistry 37: 1263-1269 [14] Benjakul, S., Morrissey, M.T 1997 Protein hydrolysates from Pacific whiting solid waste J Agric Food Chemistry.45: 3423-30 [15] Hoyle, N.T and Merritt, J.H 1994 Quality of fish protein hydrolysates from herring (Clupea harengus) Journal of Food Science 59(1): 76-79 [16] AOAC 2000 Official Methods of Analysis Association of Offi cial Analytical Chemists Arlington Bo Gohl 1993 Thức ăn gia súc nhiệt đới Nhà xuất Nông nghiệp, 547p [17] Grossman Shlomo and Bergman Margalit, Process for the production of gelatin from fish skins, Freepatentsonline, 1992 [18] Muyonga, J H., Cole, C G B., & Duodu, K G (2004) Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus) Food Chemistry, 85, 81–89 [19] Avena-Bustillos, R J., Olsen, C W., Chiou, B., Yee, E., Bechtel, P J., & McHugh, T H (2006) Water vapor permeability of mammalian and fish gelatin films Journal of Food Science, 71, E202–E207 69 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN LÀM... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết nghiên cứu số đặc tính gelatinase tái tổ hợp ứng dụng thủy phân da cá da trơn thành acid amin III.1 Xác định số đặc tính vật lý, hóa học gelatinase tái tổ hợp Trong trình... hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 42 III.1.5 Ảnh hƣởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase tái tổ hợp 43 III.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin gelatinase tái tổ hợp