Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ

họp tại Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam

Có thể tìm kiếm luận án tại thư viện:

1 Thư Viện Quốc Gia Việt Nam

2 Thư viện của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Gelatinase là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin Gelatinase là enzym chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm

Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau

như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter, Bacillus… Tuy nhiên, phần

lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase Ngoài ra, các vi khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao

Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên, hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi Ngoài ra, gelatinase tái tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật

Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp

Bên cạnh đó, cả nước có diện tích trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017 Sản phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷ 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da

cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác

có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Vì thế, các công nghệ chế biến nhằm tăng giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu, collagen, gelatin, thức ăn được quan tâm hàng đầu

Hiện nay, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời

có thể gây ô nhiễm môi trường Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của axít amin Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như giải pháp an toàn

Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra”

2 Mục tiêu của luận án

Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành

chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu

quả

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các chủng vi sinh

vật tổng hợp gelatinase tự nhiên Từ đó tạo chủng E coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase

hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống

Ý nghĩa thực tiễn

Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm đen nhằm nâng cao hiệu quả

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của Khoa Công

nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E coli BL21(DE3), XL1-blue, nhận

từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20±2°C cho đến khi xử lý và phân tích

- Da cá Tra được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20±2°C cho đến khi xử lý và phân tích

Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, đồng đều kích cỡ 7 cm/con, khối lượng cá trung bình

7,067 g/con được thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra với quy mô phòng thí nghiệm, triển khai tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN

-Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai ở phạm vi mô hình thử nghiệm, được triển khai tại trại thực nghiệm nuôi hải sản – Trường Đại học Vinh

4.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017

5 Những đóng góp mới của luận án

-Là luận án đầu tiên phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập tại Việt Nam

- Đã tạo được chủng E coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh gelatinase

- Ứng dụng hiệu quả rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế phẩm axít amin bổ

sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống

Cấu trúc của luận án:

Luận án chính gồm 119 trang với 15 bảng số liệu và 39 hình Luận án gồm 5 phần:

Mở đầu (4 trang); Tổng quan tài liệu (45 trang); Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả và thảo luận (46 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang) Luận án tham khảo 199 tài liệu trong đó 20 tài liệu tiếng Việt và 173 tài liệu tiếng Anh, 6 tài liệu từ Website

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong chương này luận án trình bày về cấu trúc, tính chất, ứng dụng của gelatin; đặc điểm, cấu trúc, chức năng, cơ chế hoạt động và nguồn sản xuất của gelatinase; trình bày nghiên cứu về sản xuất gelatinase tái tổ hợp: gen mã hóa gelatinase, biểu hiện gen gelatinase tái tổ hợp, một số yếu tổ ảnh hưởng đến lên men sinh tổng hợp gelatinase, thu hồi và tinh sạch gelatinase; nghiên cứu tình hình sản xuất và ứng dụng gelatinase tại Việt Nam, sản xuất gelatinase, ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá Tra, ứng dụng bổ sung axít amin thủy phân từ da cá Tra vào thức ăn cho cá mú

Sản xuất gelatinase tái tổ hợp đang được nhiều quan tâm nhiều vì chúng là một enzyme thủy phân được ứng dụng để chế biến các nguyên liệu thủy sản còn lại sau chế biến phi lê đang được xem là giải pháp hữu hiệu để tăng giá trị chất lượng sản phẩm thủy phân, đồng thời việc ứng dụng sản phẩm thủy phân từ da cá Tra vào lĩnh vực thực phẩm, chăn nuôi đang được quan tâm nhiều Vì vậy, sản phẩm của đề tài luận án sẽ là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng enzyme tái tổ hợp này vào thủy phân da cá Tra để phục vụ cho nhiều mục đích khác

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu nghiên cứu

phố Cần Thơ Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20 ±2oC cho đến khi xử lý và phân tích

- Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, kích cỡ 7,009 ± 0,185 cm/con, nặng 7,038 ± 0,176 g/con được

thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An

• Thức ăn công nghiệp dạng viên (loại thức ăn dùng cho cá biển cỡ cá giống)

2.2 Nội dung nghiên cứu

-Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam

-Tạo chủng E coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện lên men biểu hiện

rGEL

-Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu đặc tính của rGEL -Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra

2.3.Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase

2.4.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao

* Định tính gelatinase bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Ball, 1997):

* Xác định khả năng hóa lỏng gelatine của dịch nuôi cấy (Shanmugasundaram et al., 2012)

*Xác định hoạt tính gelatinase ( Tran và Nagano, 2002)

2.4.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn

* Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn lựa chọn

* Đặc điểm sinh trưởng của chủng vi khuẩn lựa chọn

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường:

2.4.1.3 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hoá 16S rDNA

* Tách chiết ADN tổng số ( Sambrook và Russell, 2001)

*Phân loại chủng tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA

2.4.2 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp

2.4.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gel E faecalis MD4

2.4.2.2 Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase

2.4.2.3 Giải trình tự và phân tích gen gelE

2.4.2.4 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE

* Chuẩn bị tế bào khả biến

* Chuyển gen gelE vào vector tách dòng

* Biến nạp vào tế bào khả biến E coli (Sambrook và Russell, 2001)

*Tách chiết plasmid

*Điện di DNA trên gel agarose

2.4.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E coli

2.4.2.6 Phương pháp kiểm tra protein tái tổ hợp

*Điện di protein trên gel polyacryalmide SDS – PAGE ( Laemmli, 1970)

*Định lượng protein (Bradford, 1976)

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL

2.4.3.1 Nuôi cấy E coli tái tổ hợp

2.4.3.2 Thu nhận GEL từ E coli tái tổ hợp

2.4.3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện: pH, nhiệt độ IPTG, thời gian thu hồi

2.4.4 Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL

2.4.4.1 Thu hồi và tinh sạch rGEL

2.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của rGEL

2.4.4.3 Ảnh hưởng của pH và độ bền pH của rGEL

2.4.4.4 Ảnh hưởng của ion kim loại

2.4.4.5 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa

2.4.4.6 Động học của rGEL với cơ chất gelatin

2.4.5 Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra

2.4.5.1 Phương pháp nghiên cứu thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL

*Phương pháp xử lý mẫu da cá Tra

*Phương pháp trích ly gelatin

*Phương pháp khảo sát điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL

* Phương pháp xác định mức độ thủy phân

* Phương pháp định lượng axit amin trong sản phẩm thủy phân

2.4.5.2 Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen

* Phương pháp bổ sung chế phẩm vào thức ăn công nghiệp:

*Phương pháp xác định tăng trưởng của cá Mú thí nghiệm: định kỳ 7 ngày kiểm tra một lần

về khối lượng, chiều dài thân cá, từ đó đánh giá tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG), tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR) Cuối đợt thí nghiệm đánh giá hệ số sử dụng thức ăn (FCR) Xác định hệ số phân đàn (CV): Đánh giá tại thời điểm thả cá và thời điểm kết thúc thí nghiệm CV (%) = Độ lệch chuẩn/ giá trị trung bình x 100 Xác định tỷ lệ sống của cá Mú ương

2.4.6 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Toàn bộ số liệu được thu thập trong quá trình thí nghiệm và được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell 2007, SPSS 16.0 Dùng phép kiểm định Duncan, LSD0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE

3.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao

Từ bộ sưu tập giống gồm 216 chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzym thủy phân gelatin phân lập từ các mẫu mẫu cá nước ngọt bị bệnh lở loét, xuất huyết, đốm đỏ, tuột nhớt, tuột vẩy tại các hồ nuôi cá ở Hà Nội tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, chúng tôi tiến hành sàng lọc và tuyển chọn chủng có khả năng sinh gelatinase cao để tìm nguồn gen mã hóa gelatinase tạo chủng tái tổ hợp

Bảng 3.1 Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập

phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy

STT Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân

giải gelatin (D-d, mm) Hoạt tính gelatinase (U/ml)

Ghi chú: D: Đường kính vòng phân giải (mm), d: Đường kính lỗ thạch (mm)

Trong số 11 chủng trên, chủng MD4 cho hoạt tính cao nhất, đạt 0,64±0,11 U/ml (Bảng 3.1) và có khả năng hóa lỏng thạch gelatin 7,5g/L (Hình 3.1) được lựa chọn là chủng cung cấp nguồn gen mã hóa gelatinase cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn

* Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn

Ở nhiệt độ 30oC sau 24 giờ khuẩn lạc vi khuẩn có kích thước không đều, bề mặt bóng, mặt cắt hình lồi nhọn, mép khuẩn lạc dạng rễ hình răng cưa, cấu trúc dạng sợi, bề mặt nhớt, vi khuẩn bắt màu xanh tím khi nhuộm Gram, soi trên kính hiển vi với vật kính x100 thấy hình dạng vi khuẩn là hình cầu hoặc bầu dục, liên kết thành cặp hoặc chuỗi kích thước

tế bào từ 0,5 µm đến 0,7µm

a Khuẩn lạc MD4 trên môi

trường MPA

b Hình ảnh tế bào MD4 dưới KHV điện tử quét (x 10.000)

c Nhuộm Gram (x100 lần)

Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới kính hiển vi điện

tử quét (b) và nhuộm Gram (c) Chủng MD4 Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng

MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C

Nguồn Nito (1,0%, w/v) Khả năng

sinh trưởng

Nguồn đường (1,0%, w/v)

Khả năng sinh trưởng

L-Asparagin monohydrate - D glucose +

L-Histidine monohydrate - Arabinose +

Đối chứng âm (MPA) - Đối chứng âm -

Khoảng nhiệt độ sinh trưởng: 20 ÷45°C (nhiệt độ tối ưu: 37°C)

Ghi chú: (+) Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương (D-Glucose); (-) Không phát triển hoặc phát triển yếu hơn đối chứng âm (khoáng); (++) Phát triển rất tốt

* Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hoá 16S rDNA

- Khuếch đại gen 16S rDNA

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA

trên gel agarose 1,0%

Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ); Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng

MD4

Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MD4 cho thấy, sản phẩm PCR cho một băng rất rõ nét và duy nhất có kích thước khoảng 1,4kb (Hình 3.4) Như vậy, sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh sạch và giải trình tự gen 16S rDNA

- Phân tích trình tự gen 16S rRNA

Bảng 3.3 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương

ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI)

Trình tự gene 16S rDNA của chủng vi

khuẩn được so sánh

Mã số truy cập trên GenBank

Độ tương đồng (%)

Enterococcus faecalis UFLA WFC616 KY660402.1 99

Enterococcus faecalis NBRC 100480 NR_113901.1 99

Enterococcus faecalis subsp SJYF 14 KJ174472.1 99

Enterococcus faecalis ATCC 19433 NR_115765.1 99

Enterococcus dispar LMG 13521 NR_114781.2 98

Enterococcus lactis BT159 NR_117562.1 98

Từ cơ sở dữ liệu trên, Cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở khoảng cách

di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining Phân tích giá trị

Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử (Hình 3.5)

Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa trên

việc so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác trên GenBank Giá trị bootstrap (%) thể hiện sự sai khác về mặt di truyền

Kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và so sánh với trình tự gene đã công bố trên Genbank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy chủng MD4 có trình tự tương đồng cao

với chủng Enterococcus faecalis UFLA WFC616 (99%), chủng Enterococcus faecalis NBRC 100480 (99%) (Bảng 3.3 và Hình 3.5) Dựa vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm

hình thái, sinh lý-sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng vi khuẩn MD4 được

định danh là Enterococcus faecalis MD4 Trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 được

đăng ký trên GenBank (NCBI) dưới mã số MG982575.1

3.2 TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP

3.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E faecalis MD4

Mồi xuôi TTATATG↓TCGACATGAAGGGAAATAAAATTTTATACATTTTAGG

SalI

Mồi ngược AATATTA↓AGCTTTTCATTGACCAGAACAGATTCACT

HindIII

3.2.2 Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase

Đoạn gen mã hóa gelE của E faecalis MD4 được khuếch đại bằng PCR từ khuôn DNA bằng cặp mồi EF-F1 và EF-R1 Trên băng 1 xuất hiện một vệt sáng đậm rõ nét

khoảng 1,5 kb (Hình 3.6), tương ứng với kích thước mong đợi khi thiết kế mồi khuếch đại

gen gelE của E faecalis MD4 Như vậy, sản phẩm PCR nhận được là đặc hiệu cho quá trình khuếch đại gen gelE của E faecalis MD4

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của

E faecalis MD4 Giếng L: thang DNA chuẩn; Giếng 1: sản phẩm của PCR khuếch đại gen gelE từ DNA của E faecalis MD4

Sản phẩm PCR được tinh sạch và xử lý bằng enzyme cắt đầu bằng DNA Blunting Enzym và ghép nối vào vector pJet1.2/Blunt, biến

nạp vào E coli DH5α và điện di kiểm tra kích thước plasmid tái tổ

hợp so với plasmid gốc pJet1.2/Blunt (Hình 3.7)

Kb

Hình 3.7 Điện di đồ kiểm tra plasmid đã

mang gen Giếng 1: thang DNA chuẩn;

Giếng 2: Plasmid mang gen gelE; Giếng 3:

3.2.3 Giải trình tự và phân tích gen gelE

Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E faecalis MD4

với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank

tự của gen gelE tương ứng có mã số truy cập M37185.1, D85393.1, EF105504.1, EU862241.3 chỉ có một vài vị trí khác biệt Trình tự axít amin suy diễn của chủng E faecalis MD4 có tương đồng cao (99%) so với các gen gelE khuếch đại từ các chủng E faecalis khác (Hình 3.10).

Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E faecalis MD4

3.2.4 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E coli BL21(DE3)

Để gắn gen gelE vào vector biểu hiện pET-22b(+) đúng chiều, đúng khung đọc, cả pJet1.2: gelE và pET22b(+) được cắt bằng SalI và HindIII tạo ra gen gelE và pET-22b(+) có hai đầu dính tương ứng

a) Thu gen gelE có hai đầu dính của hai enzym HindIII và SalI

Thu vùng agarose chứa vệt DNA mong đợi và tinh sạch thu lấy đoạn gen này bằng

kit Invitrogen Sản phẩm gen gelE sau tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% Gen gelE tinh sạch cho một vệt có kích thước 1,5 kb Như vậy, chúng tôi đã có gen gelE với hai đầu bổ sung được tạo bởi hai enzym HindIII và SalI

b) Tạo 2 đầu dính cho vector pET-22b(+): Plasmid pET-22b(+) cũng được xử lý với

hai enzym giới hạn trên Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% Kết quả cho thấy vector đã được mở vòng hoàn toàn đảm bảo cho việc gắn gen tạo vector biểu hiện Sau khi điện di, phần agarose chứa vector pET-22b(+) được thu lại và xử lý qua kit tinh sạch DNA (Invitrogen) Như vậy, chúng tôi đã có sẵn nguyên liệu cho việc tạo vector biểu hiện

c) Gắn gen gelE vào vector pET-22b(+)

Dưới tác dụng của T4-ligase, gen gelE được gắn vào vector biểu hiện tạo thành hệ

thống biểu hiện hoàn chỉnh Sau phản ứng ghép nối gen, sản phẩm ghép nối được biến nạp

vào tế bào E coli DH5 để tạo dòng gen

Hình 3.12 Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp được xử lý

bằng HindIII và SalI (b) Ghi chú: Giếng 1 (Hình a): pET22b(+) đối chứng, Giếng 2 ÷ 5

(Hình a): pET22b(+) mang đoạn chèn; Giếng 1 (Hình b): Thang DNA chuẩn, Giếng 2