Nghiên cứu chiết xuất catechin từ chè xanh tại việt nam

Một số thuốc được các đơn vị nghiên cứu khoa học, côn Lĩ tv, xí nghiệp san xuất đi từ nguồn naiiyên liệu thirc vật sẵn có trong nước đà góp pliần rất lóii cho công tác phòníi chữa bệnh v

P H Ù N G M IN H DŨNG

NGHIÊN CỨU CHIế T XUẤT CATECHIN

TỪ CHÈ XANH VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC s ĩ • • Dược HỌC KHÓA 7 • ♦

Chuvên nshành: CÔNG NGH Ệ DƯỢC PHẨM - B À O CHế

L Ờ I C Ả M ON

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

Gs Lê Quang Toàn

PGs.Ts Phạm Ngọc Bùng

Là những người thầ y đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi nghiên cứu

và hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn bộ môn Bào chế Trư ờ ng Đ ại Học Dược, Ban giam đốc, phòng kiểm nghiệm , phòng nghiên cứu phát triển, xưởng sản xuất số 1 Công ty cổ phần dư ợ c T W - M ediplantex, là những nơi đã hết sứ c tạo điều kiện về mọi m ặt cho tôi trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô giáo trư ờ ng Đ ại học D ư ợ c Hà Nội lòng biết ơn về sự quan tâm giúp đỡ trong thời gian học tập và nghiên cứ u tại trườ ng

Hà Nội, tháng 12 nám 2005

Học viên

Phùng Minh Dũng

CHÚ GLAI CHỦ’ VIẾT TẮT

1.1 CÂY C H È 7

1.1.1 Đặc điểm cây c h è 7

1.1.2 Phân bố 7

1.1.3 Thành phần hoá h ọ c 7

1.1.4 Tác dụng dược lý và công dụng của c h è 8

] 2 H O Ạ T C H Á T C A T E C H IN T R O N G C H È 8

1.2.1 Thànli phần hoá học của C a te ch in 9

1.2.2 Công thức và tínli chất hóa h ọ c 10

1.2.3 Tác dụng dược lý của catechin 11

1.2.4 Phương pháp định tính catechin trong c h è 14

1.2.5 Phương pháp định lượng catech in 15

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u VÊ C A T E C H IN 15

1.3.1 Một số công trìnli nghiên cíai trong nước và trên thế g iớ i 15

1.3.2 Một số phương pháp chiết catechm ừong cây c h è 16

1.3.3 M ột số dạng bào chế của catec h in : 17

1.4 N G m Ẻ N C Ứ U Đ ộ Ổ N Đ ỊN H C Ủ A T H U Ố C : 18

1.4.1.Khái niệm độ ổn định: 18

1.4.2 Mục tiêu của nghiên cíni độ ồn đựili: 18

1.4.3 Các chỉ tiêu đánh giá độ ổn định của th u ố c : 18

] 4.4 Các yếu tố được áp dụng để nchiên cứu độ ổn địnli của th u ố c ; 18 PHẦN 2: ĐỔI T U Ợ N G , NGL YÊN V Ậ T LIỆU, PHƯOTNG TIỆN VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN c ủ ư 20 2.1 ĐỐI Tư ợ n g n g h i ê n C Ú X J: 20

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯ'ƠNG TIỆN NGHIÊN c ứ u 20

2.2.1 Nguyên vật liệu, hoá chất; 20

2.2.2.Phương tiện nehiên c ứ u 21

2.3 PHU'ONG PHÁP NGHIÊN c ứ u 21

2.3.1 Phương pháp chiết xuất catechin 21

2.3.2 Phương pháp xây dimg tiêu chuẩn cơ sờ bột catechin; 25

2.3.3 Phươnti pháp kháo sát các chỉ tiêu đánh giá p h ư ơ n g pháp kiêm n g h iệ m : 26

2.3.4 Phương pháp bào chế viên nén bao phim catechin 27

2.3.5 Phươrm pháp nehiên cứu độ ồn định của thuốc: 28

2.3.6 Phươnc pháp phân tích xử lý số liệu thực n g h iệ m : 28

PHÂN 3: KÉT Q UẢ NG H IÊN CÚX; VÀ BÀN LUẬ N 29 3.1 N G H IÊ N C Ủ ÌJ P H Ư Ơ N G P H Á P V À ĐIÊU KIỆN C H IÊ T X Ư Ả T C A T E C H ĨN :., 29

3.1.1 Chiết xuất catechin bằng dung môi m ethanol: 29

3.1.2 Định tính catechin trong bột chế phẩm thu được: 30

3.1.3 Địnlì tínli, địnli lượng catechin trong chế phẩm thu được bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao: 32

3.1.4 Kiiảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng bột catechin chiết được và hàm lượng E G C G : 37

3.1.5 So sánh với các phương pháp chiết Catechin khác: 38

3.1.6 Nghiên cứu xây dimg quy trình chiết xuất catechin ở qui mô 3 kg một mẻ chiết bằng m ethanol 43

3.2 XÂY DỤNG TIÊU CHUẨN c ơ s ở CHO CHẾ PHẨM CATECHIN C H IẾ T Đ Ư Ợ C : 46

3.2.1 Khảo các chỉ tiêu chất lượng chế phẩm Catechin chiết đ ư ợ c : 46

3.2.2 Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở chế phẩm catechin : 47

3.3 B Ư Ớ C Đ Ầ U Đ Á N H G IÁ Đ ộ Ổ N Đ ỊN H C Ủ A C A T E C H IN T R O N G CHÉ PHẨM CHIÊT Đ ược VÀ TRONG V IÊ N 49

3.3.1 Mầu thử độ ổn địnli: 49

3.3.2 Công thức dir kiến cho viên catechin: 50

3.3.3 Điều kiện thử nghiệm : 53

3.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá: 53

3.4 BÀN L U Ậ N VỀ KÉT Q U Ả N G H IÊ N C Ú V : 54

PHẢN 4 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XƯẨT 5Ó KÉT L U Ậ N : 56

ĐÈ X U Â T : 56

PH U L U C 59

HPMC: H ydroxy propyl m ethyl cellulose

PE: Poly ethylen

EC: Epicatechin

EGC: E pigallocatechin

ECG; E p icate chin ga ila t

EGCG; E p iga ilo cate chin ga lla t

PVP: P olyvinylpyrolidon

D Đ V N III: D ư ợ c điển V iệ t Nam 3

HPLC: High P e rfo m an ce Liquid chrom atography

D A N H Mưc • C Á C B Ả N G

Bảrm 3.1: K h ảo sát độ ổn đ ịnh hệ th ố n g sắc ký 32

B ản s 3.2: Khảo sát sự phụ thuộc giữa nồng độ E G C G và diện tích píc 34

Bản ti 3,3: Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng EGCG 35

Bảng 3.4; Kết q uả xác định độ đúng của phương pháp định lượng 36

Bảng 3.5: K ết q u ả chiết catech in bằntĩ m ethanol có diệt m en 37

Bảng 3.8: K ết q u ả lư ợ n g b ộ t c atech in thu đ ư ợ c v à h àm lư ợ ng 40

E G C G th eo p h ư ơ n g p h á p c h iết với n ư ớ c sôi 45 phút

B ảng 3.9: Kết quả lượng bột catechin thu được và hàm lượng 40

E G C G theo p h ư ơ n g p h á p c h iết hãm với n ư ớ c sôi

B ả n í 3.10: K ết q u ả lư ợ n g b ộ t c atech in thu đư ợ c và h àm lượng 42

E G C G theo p h ư ơ n g p h á p c h iết với ethanol

Bảng 3.12: Kết quả đánh giá pH và hàm ẩm của catechin chiết đưọ'c 47Bảng 3.13; Kết quả định tính, định lượng EGCG 47

Bảng 3.15: K ết q u ả kiểm tra m ộ t số chỉ tiêu chất lư ợ ng viên 51

B ản g 3.17

B ản g 3.18

k h ô n g khí

Kết quà thử độ ổn định ở điều kiện thử nghiệm cấp tốc 53

K ết q u ả th ử độ ổn định ở điều kiện có điều h o à 54

DANH MUC CÁC HÌNH •

H ìn h 2.1; Sơ đồ c h iết xuất, tinh chế catechin bằng m eth an o l 22

Hình 2.2; Sơ đồ chiết xuất, tinh chế catechin bằng nước nóng 23

H ình 2,3: Sơ đồ chiết x u ấ t tinh chế catechin b ằ n g ethanol 24

H ình 3.1: Sắc kv đồ, sắc ký lớp m ỏ n g m ẫu catechin chiết đưọ'c 31

H ình 3.2: Đồ thị khoảng tuyến tính của phương pháp định lưọ'ng 34Hình 3.3; Sơ đồ các b ước chiết catechin bằng nước nóng 39Hình 3.4: Sơ đồ các bước chiết catechin bằng ethanol 41Hình 3.5; Sơ đồ chiết xuất tinh chế catechin 44

ĐẶT VẮN ĐÈ

N ghiên cứu sán xuất thuốc từ nguyên liệu thiên nhiên sẵn có trong nước là một trone n h ừ n ẹ vần đề được quan tâm tro n s những năm sần đâv Một số thuốc được các đơn vị nghiên cứu khoa học, côn Lĩ tv, xí nghiệp san xuất đi từ nguồn naiiyên liệu thirc vật sẵn có trong nước đà góp pliần rất lóii cho công tác phòníi chữa bệnh và chăm sóc sức klioe nhân dân

Nghiên cứu về cây chè xanh và các hoạt chất có trong cây chè ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có m ột số công trình, nhưng cho đến nay mức độ ứng dụng còn thấp và chủ yếu sản phẩm trên thị trường là nhập khẩu hoặc sản xuất từ nguồn nguyên liệu ngoại nhập

Catechin chè xanh được biết đến như là một tác nhân chống oxy lioá rất tốt eiúp cho việc phòng ngừa và điều trị một số bệnh nan y

Trên thế giới các sản phầm từ chè đặc biệt là từ catechm đã được sán xuất dưới nhiều dạng khác nhau như: viên nén, viên nang, thuốc tiêm, kem Các chế phẩm này được ứng dụng rộng rãi dưới dạng thuốc hay thirc phẩm thuốc

Xuất phát từ thực tế trên nên chúng tôi tiến hành đề tài;

“ N g h iên cứ u c h iế t x u ấ t C a tech in từ c h è x a n h Việt N a m " 'ờ VỚI các mục tiêusau;

X â\' dự n g đư ợc qiiy trình chiết xuất Catechin.

X â y dựĩỉ'^ được tiêu chuẩn cơ sở chế phẩm C atechin chiết được từ chè xanh Việt Nam.

B ước đầu đánh g iá độ ổn định của thành p h ầ n chính catechm trong

c h ế p h â m chiếl đư ợc và tron g viên nén bao phim

ở nách lá, có mùi thơm, nhiều nhị Q uả chè nang thư ờ ng có 3 van, chứa mỗi ô

m ột hạt gần tròn, đôi khi nhăn nheo, phôi nạc Hạt không phôi nhũ, lá mầm lớn, có

chứa dầu.[7] [Ì4\

1.1.2 Phân bố

C am ellia sinensis O K untze thuộc họ chè Theaceae là cây được phát triển

m ạnh từ thế kỷ XVI, cây có nguồn gốc từ T rung Quốc, N h ật B ản và sau đó phát triển hầu hết các nước trên thế giới.Việt N am là m ột trong những quê hương của cây chè, được trồng trên 30 tỉnh trong cả nước v à chủ yếu tập trung ở các tỉnh trung du và m iền núi như: Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Hoà Bình, Hà Giang, Tây Nguyên, Lâm Đồng [7] [14]

1.1.3 T hành phần hoá học

Cây chè có thành phần hoá học rất phức tạp, những công trình nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy trong cây chè có khoảng 130 chất, được sắp xếp

thành 13 nhóm sau: đường (như glucose và fructoza ) pectin, tinh dầu (như methyl salicylat, citronel, eeraniol); protein và các acid amiii khôn Sĩ thay thế, một số sắc tố (diệp lục, caroten, x an th o p h y lin ); các chât vô cơ (như sắt, magiê, calci, silic, các vitamin (B1,B2,P,C ) ; các glycozit trong đóphần aglycon là các phenol, fla v o n o id ; tanin; các ezym oxy hoá; enzym catalase; nlìựa; các acid hữu cơ; các alcaloid (cafein, theophylin, theobromin) Trong lá chè còn có nitin, quercetin, flavonoid và anthocyan pectin (6- 7 %).[6

14

1.1.4 Tác dụng dư ợc lý và công dụng của chè

Cây chè được đánh giá là m ột dược liệu quý không những có công năng bảo vệ sức khoẻ m à còn có tác dụng điều trị giúp con người chữa được nhiều loại bệnh N gười T rung Quốc đã từng đánh giá chè là loại nước uống

bồ dưỡng, có giá trị sinh học cao nhờ chữa được nhiều bệnh về tim mạch, tiêii hoá, là loại thuốc lợi tiểu, p h ò n g chống ung thư và chống nhiễm xạ [11] [14]

Qua kinh nghiệm dân gian và nhiều công trình nghiên cứu khoa học trong nước cũng như trên thế giới đã cho thấy cây chè có nhiều tác dụng rất phons; phú

1.2 H O Ạ T C H Ấ T C A T E C H IN T R O N G CHÈ •

Trong các thành phần hoá học của chè, polyphenol là thành phần quan

trọng vì hàm lượng tương đối cao và được chứng minh là có nhiều tác dụng y

siiih học quí đối với con người Trong đó catechin bản chất là hỗn hợp của các

polyphenol Thành phần chính của catechin gồm: epigalỉocatechin (EGC), epicatechin (EC), epigallocatechingallat (EGCG), epicatechingallat (ECG) Nliờ có các catechin, lá chè được dùng rộng rãi trong y học và chữa được

Nhiều nhà khoa học trên thế aiới cũng như trong nước đã quan tâni nclìiên cứu về cliè xanh và công bố thành phần trong cây: iVIỘt sô tác tí;iá cho thấy catechin trong lá chè ở dạng phức hợp có 80- 85% catechin, trong đỏ epicatechin (EC) là 1-5%; epigallocatechin (EGC) lả 15-35%; epigallocatechm íĩallat (E G CG ) là 45-55% epicatechingalate (ECG) là 10- 20%,[5][18]

Đ ặng Ngọc D ung đã chiết xuất và xác định thành phần của polyphenol trong lá chè xanh Việt N am bằng phươ ng pháp sắc ký lỏng cao áp kết quả nhận được như sau: polyphenol toàn phần chiếm 57,13 % khối lượng khô chè, trong đó : gallocatechin (GC) là 11,4 %; epigallocatechin (EGC) là 7,19%; epigallocatechin gallat (E G C G ) là 19,92%, catechin (C) là 4,68%; gallocatechin gallat là 5,53 %, epicatechin gallat là 4,2% [2] M ột số nghiên cứu cho thấy polyphenol trong lá chè lại có tỷ lệ khác so V Ớ I các nghiên cứu trên như vậy có thể thấy tuỳ thuộc phương pháp chiết, giống chè, m ẫu lá lấy, điều kiện sinh thái, thời điểm thu hái m à hàm lượng các thành phần trong chè thay đổi

1.2.1 Thành phàn hoá học của Catechin

Catechin là hỗn hợp chứa chủ yếu epicatechin (EC); epigallocatechin (EGC), epigallocatechin gallat (EGCG), epicatechin gallat (ECG) đây lả những họp chất không màu, dễ dàng bị oxy hóa nhất là khi gia nhiệt trong môi tnrờng acid, bị mất nước để chuyển thành những sản phẩm có m àu khác nhau Tan trong các dung môi hữu cơ phân cực như ethylacetat, ethaiiol, Tan trong nước nóng, cồn, acetone, tan nhẹ trong nước lạnh K hông tan trong cloroform, ether dầu hoả, benzen, ether [11

M ộ t sổ đặc tính vật lỷ của các chất trong catechin

Epicatechin (EC)

Epigallo Catechin (EGC)

Epicatechin gallat (ECG)

Epigallocatechin ; âallat (EGCG)

Epigaỉlo catechin (EGC)

Epicatechin gallat (ECG)

Epigallo catechin gallat

Tỉnh ch ấ t hoá học:

D o đặc điểm cấu tạo hoá học của catechin: có nhóm OH, vòng thơm ben zen nên có khả năng phản ứng rất lớn Dưới đây là những phản ứng hoá học cơ bản của catechin

- Phản ứng của nhóm hydroxyl

- Phản ứng tạo thành liên kết hydro

- Phản ứng este hoá: phản ứng của nhóm carboxyl

- Phản ứng của vòng thơm: phản ứng tạo azoic

- Một số đồng phân có phản ứng của nhóm carbonyl: phản ứng tạo phức với kim loại (Ca,Fe ) [11]

1.2.3 T ác dụng dư ợc lý của catechin

Catechin có nhiều tác dụng rất phong phú, là một chất không độc, chiếm

tỷ lệ cao trong nhóm polyphenol và đã đem lại nhiều lợi ích cho con người.

Catechin trong chè có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm của vi huyết quản, củng cố tính bền thành mạch máu, vì vậy catechin thường được dùng phối hợp với vitamin E trong dự phòng điều trị chảy máu cấp.

Một số nghiên cứu cho thấy EGCG, hoạt chất chiếm khối lượng cao nhất trong các thành phần của catechin có tác dụng làm giảm sự dính bạch cầu vào tế bào nội mạc mạch máu người, ức chế ngưng tập tiểu cầu, huyết khối và nhồi máu cơ tim Kết luận còn cho thấy EGCG có tác dụng chống huyết khối rất tốt

N goài ra catechin còn có tác động đến các biểu hiện lâm sàng khác của bệnh nhân như giảm bớt sốt, giảm nhiễm độc, giảm rối loạn hoạt động của hệ tim mạch Catechin chè làm tăng cường hoạt động của lách và gan.

ở châu âu từ lâu đã dùng catechin làm thuốc cầm máu (dạng rượu, xiro), giải độc do alcaloid, làm nước rửa trong bệnh lậu, giang mai (dung dịch 1%), dùng chữa eczem a (thuốc mỡ 5%), băng cho bệnh nhân bỏng, kích thích miễn dịch Catechin còn được dùng rộng rãi trong y học để chữa các bệnh liên quan đến bộ máy tuần hoàn như bệnh giòn mạch máu, bệnh huyết áp.

Trong một số nghiên cứu được công bố gần đây cho thấy polyphenol trong chè có tác dụng làm hạ glucose huyết được sử dụng trong bệnh đái tháo đường, mà thành phần tác dụng chính là Epigallocatechin- 3-gallat (EGCG) nhiều giả thuyết đã đưa ra các cơ chế: Nhóm hydroxy trong cấu trúc phân tử của polyphenol, có khả năng phản ứng với nhóm carbonyl của protein, ức chế hoạt động của enzym a - amylase của tuỵ làm giảm sự phân huỷ tinh bột thành glucose nên hạ glucose huyết [9’

Theo tác giả Gomes và cộng sự, những người đầu tiên cho rằng EGCG trong chè xanh có tác dụng gây hạ glucose huyết do ức chế sự vận chuyển glucose phụ thuộc kênh N a-glucose tại đường tiêu hoá Tác giả khác cho rằng tác dụng hạ glucose huyết của EGCG là do làm giảm sản xuất glucose tại gan do tăng glycogen gan, tăng sự phophoryl hoá của receptor insulin, điều chỉnh gen

mã hoá cho những enzym tạo glucose và photphoryl hoá protein tyrosin bằng diễn biến trạng thái oxy hoá khử tế bào

Catechin chữa được bệnh phóng xạ do ngăn ngừa stronti 90 xâm nhập vào xương của bệnh nhân bị nhiễm xạ [2] [14]

N hiều nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh tác dụng điều trị những thoái hóa sụn khớp nhất là viêm xương, nhũn xưong, thoái hóa sụn và thấp khớp Catechin có tác dụng điều trị tận gốc thấp khớp và những viêm đau khóp cấp do có bảo vệ các sợi collagen.

Do có khả năng chống oxy hóa, giảm cholesterol, nên catechin được trong điều trị nhiều bệnh như làm thuốc chống oxy hoá, chống xơ vữa động

mạch, chống lão hoá, chống ung thư mà cơ chế chống oxy hoá là do có tác dụng

ức chế quá trình oxy hóa dây truyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động, và khả năng vô hiệu hoá các gốc tự do này Mặt khác, do có khả năng bảo vệ các protein và A D N khỏi sự phá huỷ của quá trình oxy hoá , ức chế di căn do ngăn hình thành các vi quản mới nuôi khối u ,và là chất kìm hãm sự phát triển của khối u bằng cách phá vỡ sự gắn kết của chất sinh ung thư và những vi khuẩn với tế bào, vì vậy catechin được ứng dụng điều trị một số bệnh ung thư rất tốt Một nghiên cứu ở Nhật cho thấy catechin có tác dụng tốt cho ung thư dạ dày và ung thư kết tràng N ghiên cứu ở Mỹ cho biết nó có khả năng chống khối u ở da, giảm tổn thương do tia ư v Trong tất cả các thành phần chính catechin trong chè , gallatepigallocatechin (GEGC) có tác dụng chống oxy hoá tốt nhất và khả năng chống oxy hoá mạnh hơn ascorbat, glutathion, vitamin E [6]

Catechin do khả năng ức chế các nhân tố gây viêm , kháng một số vi khuẩn bằng cách hoạt hoá các vi khuẩn có ích nhưng ức chế hoạt động của các

vi khuẩn độc hại trong đường ruột nên có thể dùng catechin để chữa tiêu chảy, chống viêm loét bảo vệ răng lợ i n g o à i ra catechin còn ức chế nhiều loại vi khuẩn khác như tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn thương hàn, vi khuẩn gây viêm phổi

vì vậy có thể dùng làm thuốc sát trùng ngoài ra và nhiều bệnh khác do vi khuẩn gây nên, dùng làm thuốc săn se, chống loét, khử mùi (bảo vệ răng lợi, giữ cho hơi thở thơm tho) [6]

N goài ra catechin còn có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến chè Các sản phẩm của chè như: chè đen, chè đỏ, chè vàng, chè xanh có hương thơm, màu sắc nước và vị đặc trưng rất khác nhau phụ thuộc vào phản ứng oxy hóa các polyphenol có trong lá chè bởi enzym (và phi enzym) Trong các đồng phân catechin chỉ có hai c h ấ t : L-EGC và L-EGCG là có khả năng tạo thành sản phẩm có màu đỏ tươi đặc trưng của chè đen, nhưng chỉ có hai chất này sắc nước

sẽ có màu vàng cho thấy catechin có vai trò rất quan trọng trong màu sắc và hương vị của sản phẩm chè [1 r

Phản ứ ng p h á t hiện catechỉn:

Các chất catechin khi đun nóng với acid thì tạo thành phloroglucinol Chất này sẽ nhuộm màu lignin cho màu vàng hoặc đỏ khi có mặt của acid clohydric đậm đặc.

X á c định catechin bằng p h ư ơ n g p h á p sắc kỷ lỏ n g hiệu n ă n g cao

N guyên tắc: Hoà tan bột chiết trong dung môi thích hợp, tiến hành chạy

sắc ký ở bước sóng thích hợp trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, so sánh với mẫu chuẩn về thời gian lưu

1.2.5 P hư ơng pháp định lư ợng catechin

Chưa thấy có dược điển nào đưa ra phương pháp định lượng catechin Một số tác giả trong, ngoài nước đã xác định hàm lượng và thành phần catechin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1.3 T ÌN H H ÌN H N G H IÊ N c ứ u V Ẻ C A T E C H IN

1.3.1 M ột số công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

M ộ t sổ c ô n g trĩnh nghiên cứu ở Việt N am

Kỹ sư N gô Văn Thành và DS Triệu Duy Đ iệt đã nghiên cứu tách chiết catechin từ vỏ Xoan Trà từ tỉnh Vĩnh Phú và thử tác dụng bảo vệ phóng xạ trên chuột nhắt trắng SWISS [10

DS N guyễn Khôi giới thiệu các chất catechin trong lá chè và nêu một số tác dụng của chúng [5

Theo tạp chí Nature 1999, số 391, 398 nghiên cứu chè xanh ức chế di căn trong đó chất hiệu quả nhất là Gallatepigallocatechin (GEGC).

Đặng N gọc Dung và cộng sự đã chiết xuất và đánh giá sơ bộ thành phần Polyphenol từ lá chè xanh V iệt Nam [2]

Một sổ công trĩnh nghiên cứu ừ'ên thế giới:

p.Thom pson và một số nhà khoa học khác đã nghiên cứu tìm ra và công

bổ tanin trong chè gồm bốn loại catechin và cho thấy chúng là những vitamin p.

Y.W ang,C.Bachrach.u đã khẳng định tác dụng chống ung thư của Epigallocatechingallat (EGCG) trong chè xanh.

Hara ở công ty MitsuNarin (Nhật Bản) đã dùng catechin làm thuốc chống gốc tự do và giảm béo [19]

Giáo sư T Shim am ura công tác tại trường đại học y khoa Show a (Nhật

Ban) đã có công trình về “tác động diẹt khuẩn E coli -157” tại hội thao

chuyên đề diệt khuẩn của trà xanh

Tiến sỹ Tariq công tác tại trường đại học W estern Reverve 0’ Cleveland, Ohio (Mỹ), đă cùng nhóm nghiên cứu tim hiẻii tác đ ộ n s cua polyphenol đối với bệnh viêm khớp tiến triển tăng dần với các triệu chứng: viêm sưng, đau nhức, thoái hoá khóp

Gần đây các nhà bác học N hật đã cho thấy catechm trong lá chè có lác dụng chữa nhiễm phóng xạ do stronti 90

R Ainarowicz, Shahidi.F đã nghiên cứu chiết xuất catechin từ chè xanh Trung Quốc bằng cách sử dụng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao với dung môi thích hợp

1.3.2 M ột số ph ư ơng pháp chiết catechin trong cây chè

N guyên tắc chimg: [19]

D ựa vào tính chất catechin tan trong cồn, nước, aceton nên dùng các dung môi này để tách riêng catechin ra k]iỏi dược liệu và do k h ả năng catechin không tan trong m ột số dung môi Iiliư hexan, ether dầu hoả, cloroform trong khi các tạp chất tan trong dung môi này để loại tạp chất ra klìỏi catechin Sau đó dùng dung môi chiết lặp di lặp lại hoặc dùng dung môi như ethylacetat, n-butanol, methyl isobutyl ceton, acetori để tinh chế catecliin,

Để phân tích các thành phần của catechin dùng phương pháp sắc ký long hiệu năng cao với hệ dung môi : aceton : tetrahydrofuraii : nước: 10-15:5-15:75- 80

M ột s ổ ph ư ơn g p h á p chiết catechin từ dung m ô i: [ 2 ] [ 12]

Phương pháp chiết bằng dung môi ethanol

Phương pháp chiết bằng nước nóng : Nhiệt độ tò 40®c đến 80-100°C

Phương pháp chiết bằng dung môi nước - ethanol 40-75%

P hư ơng pháp chiết bằng dung môi nước - m ethanol 40-70%

Phương pháp chiết bằng dung môi nước - acetone 30-80%

Phương pháp chiết bằng dung môi methanol

1.3.3 M ột số dạng bào chế của catechin:

N hờ có các chất catechin mà lá chè được dùng rộng rãi trong y học đế chữa được nhiều bệnh khác nhau cho nên việc dùng chè là rất phổ biến

Catechin trên thế giới đã được nghiên cứu chiết tách và sử dụng dưới nhiều dạng

bào chế như: Dạng thuốc tiêm, dạng kem bôi, xiro rưọoi, viên nén, viên nang, viên nén bao film, mỡ gel dùng với tác dụng giảm đau, chống lão hoá.

Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm có chứa catechin như:

- Polyphenol AEC: Catechin 50 mg

Ginkobiloba lOmg Vitamin A,C,E

- Teamex; viên có chứa 25m g EGCG của công ty IMEXPHARM

- Dogarlic trà xanh: Viên bao chứa Cao tỏi, cao nghệ, cao chè xanh của DOM ESCO

- Green tea plus, sản phẩm dinh dưỡng của Nhật

- Catechin green, viên bao phim 50 mg catechin hydrat

- Polyphenol 100, viên chứa catechin toàn phần chiết từ chè xanh

- Thuốc tiêm chứa: 55 mg catechin hydrat

1.4 N G H IÊ N C Ứ U Đ ộ ỎN Đ ỊN H C Ủ A TH U Ố C : [1 ]

1.4.1.Khái niệm độ ổn định:

Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguvên liệu hay thành phâm bào chế) được báo quản trong thời hạn xác định vẫn guì được những đặc tính vốn có về vật lý, hoá học, vi sinh, đặc tính trị liệu \'à độc dưọ'c học trong giới hạn qui định

1.4.2 M ục tiêu của nghiên cứu độ ôn định:

- Lựa chọn công thức bào chế hợp lý, hệ thống bao bi hoàn chinh

- Xác định tuổi thọ của thuốc và điều kiện bảo quản phù họp

- Chứng minh tuổi thọ đã được đề xuất

- Thẩm định được những ảnh hưởng bất lợi đến độ ốn định của thuốc

do SỊI’ th ay đồi tro n g cô n g thức h o ặc q u á trình sản x u ất để k h ắc p h ụ c kịp thời

1.4.3 Các chỉ tiêu đánh giá độ ổn định của thuốc:

- Cảm quan: sự thay đổi về màu sắc, hình dáng

- Vật lý học: thay đổi về màu sắc, mill vị, trạng tíiái, độ rã, độ hoà tan

- Hoá học: đinh tmh, địnli lượng, sản phẩiTi phân hiiỷ, tạp chất liên quan

- Các chỉ tiêu kliác như: sinh vật học, đặc tính điều trị, độc tính

1.4.4 Các yếu tố đ ư ọ c áp dụng để nghiên cứu độ ổn định của thuốc:

- Yếu tố ngoại lai:

+ Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phán ứng phân liLiỷ thuốc, cần xác định được nhiệt độ thực nghiệm tối đa để tránh thay đổi trang thái thuốc và xảy ra những phản ứng mà điều kiện thường không xảy ra

+ Độ ẩm: độ ẩm cao thúc đẩy phản ứng thuỷ phân và làm thay đôi tính chất Iv học của thuốc

+ Ánh sáiig: Nhiều loại dược chất bị phân huỷ dưới tác dụng của ánli sáiig

+ ĐỒ bao gói: Ngiiyên liệu có thể bị ảnh hưởng bởi tứih chất của đồ bao gói.

- Yếu tố nội tại:

+ Sản phẩm phấn huỷ và tạp chất có trong nguyên liệu

+ Nước kết tinh

- Các phương pháp nghiên cửu độ ổn định của thuốc:

+ Phương pháp lão hoá cấp tốc; dạng thuốc được bảo quản trong thời gian 30 ngày, ở nhiệt độ 40°c ± 2°c và độ ẩm không khí 75% ± 5%

+ Phương pháp nghiên cứu ở điều kiện thường; dạng thuốc được bảo quản trong thời gian 12 tháng, ở nhiệt độ 2 5 ° c ± 2°c và độ ẩm không khí 60% ± 5%

+ Ngoài ra người ta còn nghiên cứu độ ồn định của thuốc ở nhừng điềii kiện khắc nghiệt

P H Ầ N 2

ĐỎI TƯỌTVG, NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN

VÀ PHƯONG PHẨP n g h i ê n c ú U

2.1 ĐÔ I T Ư Ọ N G N G H IÊ N CỬU:

Catechin trong lá Chè xanh Việt Nam

Viên nén bao phim bào chế tìr catechin đã nghiên cửu chiết xLiât được

2.2 N G U Y Ê N LIỆ U V À PHƯOÌVG TIỆ N N G H IÊ N cứu

2.2.1 Nguyên vật liệu, hoá chất:

2.2.1.1 N giiyên liệu:

Lá Chè xanh Thái N guyên, giống chè đã được xác định là C am ellia

sinensis, chè được trồng và chăm sóc theo tiêu chuẩn chè xuất khẩu Lá chè

được thu hoạch vào V Ị I xuân

2.2.1.2 H o á c h ẩ t

Ethanol 96% Việt Nam Đạt tiêu chuân DĐVN IIIMethanol Việt Nam Đạt tiêu chuân DĐVN IIIEpigalocatechin gallat Thuỵ sĩ Hoffurann La Roche

Natri cỉorid Tning Quôc Tinh khiêt hoá học

Acid photphoric Tung quôc Tinli khiêt hoá học

n - hexan Trung quôc Tinh khiêt hoá hoc

1

Taitrazin lake Trung Quôc Nhà sản xuât

Đỏ Ponceau Trung Quôc Nhà sản xuât

2.2.2.Phưo’ng tiện nghiên cứu

Thiết bị chiét xuất:

Bình ngấm kiệt ( Việt Nam)

M áy xay dược liệu Roco B (Đức)

Rây các cờ ( Trung quốc)

Bộ cất quay Biichi ( Thuỵ sỳ)

Thiêt bị kiêm n^hiộm :

Hệ thốne sắc ký lỏng hiệu năng cao H ? (Mỹ)

M áy trắc n sh iệm hòa tan E R W E K A -D T 60

M áy đo lực gây vỡ viên - Á n Độ

M áy đo độ rã - Ấn độ

M áy khuấy ưr - Nhật

Tủ ấm Heraeus T5050

Thiếí bị bào chế:

M áy nhào hạt N C - Trung Quốc

M áy dập viên một chày - Trung Quốc

M áy bao phim tự động TP-25 Việt Nam

Qiiv trình chiết catechin

Qui trình (I): Dùng phư ơ ng pháp ngấm kiệt với dung môi methanol, loại tạp bằng hexan và chiết lại bằng ethyl acetate theo sơ đồ hình 2.1

Thời gian ngâm lạnh

24 giờ Tốc độ rút dịch 20

Q ui trình (II) : D ù n g phư ơng pháp chiết n ó n g v ớ i dung m ôi là nước theo

Bay hơi ở 6O0C; 160 mmHg Còn ‘/2 thể tích

Thời gian làm ẩm 1 giờ

Thời gian ngâm lạnh

2.3.2 PhưoTig pháp xây dụng tiêu chuẩn cơ sở bột catechin:

Kháo sát các chỉ tiêu chất lượng bột catechin như sau;

Tiến hành đo độ ẩm trên m áy PR EC IS A - HA60 M áy hoạt động trên

nguyên tắc là sấy bằng tia hồng ngoại đến khối lượng không đổi, độ ẩm

(% )được m áy báo tự động

d) Đ ịnh tỉnh:

B ằng các phản ứ n g hoá học xác định m ột số tính chất nhóm chức

B ằng phư ơ ng pháp sắc ký lớp m ỏng xác định được bột chế phẩm là bột Catechin và phát hiện sự có m ặt của E G C G căn cứ theo vị trí m àu sắc, số lượng của vết trên sắc ký đồ, có đối chiếu E G C G chuẩn

B ằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, dựa vào thời gian krii của pic trong m ẫu thử tư ơ n g ứng với thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn để xác định có E G C G trong m ẫu thử

e) Định lượng:

Xây dựng phư ơ ng pháp định lượng Catechin trong chế phẩm bột Catechin chiết được bằn g phư ơ ng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Q ua việc xác định hàm lượng thành phần chính trong Catechin là E G C G

N guyên tắc:

H oà tan bột chiết trong duns; môi thích họp, tiến hành chạy sắc ký ơ birớc sóng thích hợp trên m áy sắc ký lỏng hiệu năng cao, so sánh với mẫu chuẩn (E G C G ) về thời gian lưu (định tính) và diện tích píc (định liro’ng)

2.3.3 P h ư o n g pháp khảo sát các chi tiêu đánh giá p h u o n g pháp kiểm nghiêm:

K hào sá t kh o á n g tuyến tỉnh:

Pha các dung dịch E G C G chuẩn ở nhiều nồng độ khác nhau, tiến hành sắc ký theo điều k iện nêu trên Biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch bằng hệ số tương quan (r) N ếu (r) càng gần 1 thì diện tích pic và nồng độ dung dịch càng có liên quan chặt chẽ, Từ đó xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm N ếu diện tích pic và nồng độ dung dịch tuyến tính với nhau thì khi định lượng ta sẽ chọn lượiig m ẫu để có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đó

+ K hoảng tin cậv: ]-i ± e

N ếu độ lệch chuẩn tương đối và sai số tương đối càng nhỏ thì phương

pháp có độ lặp lại càng cao

Khao sát tính đúng:

Xác định bằng phươ ng pháp thêm; cho một lượng chính xác EGCG chuẩn vào dung dịch m ẫu thử đã biết trước hàm lượng EGCG Tiến hành chạy sắc ký xác định diện tích pic E G C G dung dịch vìra tạo thảnh.Từ đó tính lượng

E G C G chuẩn thu hồi dưới dạng (%) theo công thức:

EG C G thu hồi (%) = -

-Trong đó:

ụhh: Lượng E G C G thu được từ vết tạo thành khi cho thêm m ột lượng

E G C G chuẩn (íig)

|.it: L ượng E G C G sẵn có trong dung dịch m ẫu thử (|ig)

Ị.ic; Lượng E G C G chuẩn đưa vào (^Ig)

Tiến hành làm 6 mẫu lấy kết quả tn m g bình

Đánh giá phưcm g pháp:

Căn cứ kết quả thí nghiệm về độ chính xác, độ đúng vừa khảo sát đê

đưa ra kết luận cho phương pháp

2.3.4 P h ư o n g pháp bào chế viên nén bao phim catechin

Phư ơng pháp xát hạt ướt bào chế viên nén

2.3.5 P h ư o n g pháp nghiên cứu độ ổn định của thuốc:

Tiến hành nghiên cứu độ ổn định của mẫu catechin chiết được và mẫu viên catechin ở các điều kiện;

1 Thử nshiệm cấp tốc: ở nhiệt độ 40'^c ± 2“c và độ ẩm tương đối 75%

± 5% Mầu thử được đặt ti'one bình thiiỷ tmh kín, đáy bìnli có dung dịch Natriclorua bảo hoà, bình được đặt trong tủ ấm, thời gian đặt mẫu

là 45 ngày

2 Thử nghiệm độ ổn định trong đều kiện phòng có điều hoả không khí

nhiệt độ từ 20°c - 25*^C, độ ẩm tương đối tìr 60% - 70%, các mẫu thử đựng frong hộp giấy, thời gian đặt mẫu là 90 ngày

Đánh giá các chỉ tiêu về độ ổn định; hìnli thức, cảm quan, địnli tính định lương theo dự thảo tiêu chuẩn cơ sở

2.3.6 P h ư on g pháp phân tích xử lý số liệu thực nghiệm:

C hư ơng trình E X C E L 7.0 được sử dụng để tính toán các đại lượng thống kê Các mẫu thử cho các kết quả tương ứng Xi, X2, X3 , Xn những số liệu này được xử lý thống kê để xác định các giá trị trung bìnli X, độ lệch chuẩn SD

P H Á N 3

KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ BÀN LUẬN

3.1 N G H IÊ N C Ú U P H Ư Ơ N G P H Á P VÀ ĐIÈƯ KIỆN C H IÉ T X U Á T

nsoài Đ óng van xả khí để áp suất trong nồi tăng lên đến 1,1 atm trong 3 phút

N gừng gia nhiệt, để nguội, lấy lá chè ra

Sấy khô lá chè đến độ ẩm 4 - 5% ở nhiệt độ 50°c

Xay lá chè đã sấy khô ở ữên bằng máy xay dược liệu với mắt rây 2,0 mm

Chiết xiiẩt:

Thấm ẩm 100 gam bột lá chè bằng 100 ml methanol, trộn đều và để yên trong 1 giờ Cho bột chè đã thấm ẩm trên vào bình ngấm kiệt dung tích 1 lít đă được lót bông, nén nliẹ bột chè M ở nhỏ van bình ngấm kiệt và cho methanol vào đến klii có vài giọt dịch chiết chảy ra, đóng van và cho tiếp methanol đếii quá mặt bột chè khoảng 2 cm Ngâm lạnh 24 giờ Hết thò’i gian ngâm lạnh mở van bình chiết cho dịch chiết chảy vào bìnlì hímg với tốc độ 20 giọt/ phút Thường xuyên bổ sung Methanol cho ngập mặt dược liệu 2 -3 cm Quá trình chiết dừng lại klii màu xanh của dịch chiết nhạt hẳii, thu được klioảng 400 ml dịch chiết methanol

C'at thu hồi dung môi:

Dịch chiết đem cô ở nhiệt độ 60“c và 160 mmHg đề loại methanol

Loại tạp íựai đoạn ỉ:

Cắn thu được sau khi loại methanol hoà tan trong 100 ml nước cất thu được dịch 1, Lắc dịch 1 với n - hexan 6 -7 lần, mỗi lần 30 ml để loại tạp (cafein, lipid, chất màu, clorophyl) loại bỏ lóp n - hexan, thu được dịch 2, Thêm vào dịcli 2 một lượng là 10 (g) natri clorua, khuấy cho tan hết thấy xuất hiện tủa đông vón, lọc loại bỏ tủa

Loại tạp giai đoạn 2:

Dịch lọc còn lại điều chỉnh đến pH 3,5 bằng acid photphonc thu được dịch (3) Dịch (3) đem lắc với ethyl acetat 5-6 lần, mỗi lần 30 ml thu được dịch chiết ethyl acetat

- Phản ứng tạo phức m àu với Fe'*’^: Cho vào ống nghiệm thứ nliất 2 -3 giọt dung dịch FeCl3, dung dịch thử chuyển màu xanh lục

- Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm thứ hai 2 - 3 giọt dung dịch NaOH 1%, dung dịch thử chuyển màu vàng sáng