NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT KAEMFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM

Tuy có diện tích trồng chè xanh rất lớn, chất lượng vào loại tốt nhất thế giới nhưng nước ta chỉ chú trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ qua Kaempferol, một hoạt chất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh ung thư – căn bệnh nan y của thế giới. Sau khi được học xong bài tách chiết các chất hữu cơ, cùng với các tư liệu mà các thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol là không khó nên chúng em quyết định thực hiện ý tưởng này.Mục đích đề tài của chúng em là chiết tách kaempferol từ lá chè xanh nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có trong nước, góp phần giảm bớt giá thành thuốc chữa ung thư – thường có giá rất cao. Đồng thời nếu thành công và ứng dụng trong thực tế chúng ta còn có thể chủ động nguồn nguyên liệu trong nước mà không phụ thuộc vào nước ngoài

Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ - HÀ ĐÔNG ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015). Đề tài: “ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT KAEMFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM “ Lĩnh vực: HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC HD1: - Th.S.Nguyễn Đức Thanh - Đơn vị công tác: Học viện Quân Y HD2: -Th.S Kim Phương Hà - Đơn vị công tác: Trường THPT chuyên Nguyễn Huệ TÁC GIẢ: 1. Chu Tấn Kiệt Lớp:11 Hóa 1 2. Phạm Ngọc Diệu Anh Lớp:11 Anh 1 Hà Nội, tháng 11 năm 2014 1 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam MỤC LỤC PHẦN 1: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2 2.1. Tổng quan về đề tài 2 2.2. Tính mới của đề tài 2 PHẦN 3: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3 3.1. Hóa chất, thiết bị và nguyên liệu 3 3.1.1. Nguyên liệu 3 3.1.2. Hóa chất nghiên cứu 3 3.3.3. Thiết bị nghiên cứu 3 3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất flavonoid từ lá chè xanh 4 3.3. Phân lập Kaempferol từ flavonoid toàn phần của lá chè xanh 10 3.3.1. Phân tách trên cột silica gel 10 3.3.2. Phân tách trên cột Sephadex 11 3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 13 3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy 13 3.4.2. Sắc ký lớp mỏng 13 3.4.3. Kết quả đo phổ 13 3.4.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS 13 3.4.3.2. Phổ hồng ngoại IR 14 3.4.3.3. Phổ khối lượng ESI MS 14 3.4.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 14 PHẦN 4: KẾT LUẬN 15 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 16 1. Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 16 2. Tiếp tục hoàn thiện báo cáo 16 PHẦN 1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Tuy có diện tích trồng chè xanh rất lớn, chất lượng vào loại tốt nhất thế giới nhưng nước ta chỉ chú trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ qua Kaempferol, một hoạt chất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh ung thư – căn bệnh nan y của thế giới. 2 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Sau khi được học xong bài tách chiết các chất hữu cơ, cùng với các tư liệu mà các thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol là không khó nên chúng em quyết định thực hiện ý tưởng này. Mục đích đề tài của chúng em là chiết tách kaempferol từ lá chè xanh nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có trong nước, góp phần giảm bớt giá thành thuốc chữa ung thư – thường có giá rất cao. Đồng thời nếu thành công và ứng dụng trong thực tế chúng ta còn có thể chủ động nguồn nguyên liệu trong nước mà không phụ thuộc vào nước ngoài. Từ những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài: " NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH KAEMPFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM" PHẦN 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Tổng quan về đề tài Thực trạng bệnh ung thư: Theo thông tin từ Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 -200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử vong vì căn bệnh này. Ung thư hiện nay đang là nguyên nhân thứ hai gây tử 3 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam vong ở Việt Nam và thực sự là mối quan tâm của cả quốc gia. Kaempferol là một trong những dược chất được các nhà nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu trong việc điều trị và phòng tránh nhiều bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư khoang miệng… Qua nhiều nguồn tin điện tử và sách báo, chúng em được biết rằng ở nước ta có nhiều loài cây có chứa Kaempferol như: Bạch quả, Bạch thược, Bát giác liên, Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn, Chàm lá nhỏ, Chè, Cỏ lào, Dầu giun, Đại táo, Đào, Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền…Vì vậy, chúng em mong muốn thực hiện đề tài chiết tách Kaempferol từ các loài cây gần gũi và phổ biến ở Việt Nam. 2.2. Tính mới của đề tài: Ở Việt Nam chưa có đề tài nào nghiên cứu tách chiết Kaempferol từ lá chè xanh. PHẦN 3 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1. Hóa chất, thiết bị, nguyên liệu: 3.1.1. Nguyên liệu: 4 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Lá chè xanh tươi được thu mua tại Hoà Bình, loại tạp, sau đó đem phơi khô. Bảo quản nơi khô ráo 3.3.2. Hóa chất nghiên cứu: TT Tên hóa chất Nguồn gốc 1 Methanol Merck 2 Cloroform Trung Quốc 3 Ethyl acetat Trung Quốc 4 Aceton Merck 5 Silicagel Trung Quốc 6 Sephadex LH20 Singapore 7 Natri clorua Trung Quốc 8 Natri sunphat Trung Quốc 9 Nước cất Viện KNVSATTP quốc gia 3.3.3. Thiết bị nghiên cứu: Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia, Học viện Quân y, Viện Hoá học - Viện hàn lâm khoa học Việt Nam gồm có: Máy móc – Máy cất quay chân không Eyela (Nhật Bản) – Tủ sấy Memmert (Đức). – Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức). – Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ). – Máy cất quay chân không Büchi R-220 (Thụy Sỹ). – Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc). – Máy đo nhiệt độ nóng chảy Memmert (Đức). – Máy UV – VIS (Nhật). – Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer. – Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer. – Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 MS (Mỹ). 5 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam – Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) Dụng cụ – Phễu chiết 500mL và 1000mL ( Đức) – Pipet – Ống đong 100mL ( Đức) – Cột thủy tinh – Bình hút ẩm – Bình cô quay 100mL, 250mL và 500mL – Và các dụng cụ thuỷ tinh khác… 3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất flavonoid từ lá chè xanh Lá chè xanh được đem sấy ở 60 0 C trong 24h, sau đó đem xay thành bột rồi đem chiết xuất theo quy trình như sau: Cân 100g lá chè rồi cho vào bình cầu 2L. Cho thêm 1L MeOH ở các nồng độ khác nhau (60%, 70%,80%). Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã dược liệu trên với 500ml MeOH trong khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ hai. Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn dung môi dưới áp suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn. Thêm một ít nước nóng vào hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn. Kết quả thu được dung dịch có màu xanh lá đậm. Dung dịch được xử lý theo 2 cách: Cách 1 (không acid hoá): Lắc đều 3 lần với CHCl 3 với thể tích của CHCl 3 mỗi lần 50mL. Cả 3 lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống. Cho HCl 10% vào để cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4 sau đó đem chiết tiếp với etylacetat mỗi lần 50mL. Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na 2 SO 4 khô để hút nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn flavonoid toàn phần. Cách 2 (acid hoá): Cho 10mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân trong khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình chiết. Sau đó tiến hành tương tự như phương pháp 1. 6 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Sau khi thực hiện theo các cách đem đi xác định khối lượng cắn flavonoid toàn phần. Mỗi thí nghiệm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình. Bảng1. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ lá chè Dung môi Hàm lượng cắn flavonoid thu được (g) Cách 1 Cách 2 Methanol 60% 2,55 3,55 Methanol 70% 2,99 3,87 Methanol 80% 3,08 4,00 Nhận xét: Ở cả 2 phương pháp chiết, dung môi chiết xuất là methanol 80% đều cho hiệu suất cao nhất và ở các trường hợp dịch chiết được acid hoá cho hiệu quả tốt hơn. Sau khi thu được cắn flavonoid toàn phần, chúng em tiến hành xác định xem trong đó có chứa kaempferol hay không bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) với các điều kiện như sau: Bản mỏng silica gel GF 254 (Merck) được hoạt hóa ở 110 0 C trong 1 giờ. Hệ dung môi triển khai: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 4: 1). Hiện vết bằng hơi ammoniac bão hòa . Kết quả: Trên sắc ký đồ cho thấy các vết đã được tách rõ ràng. Các vết này đậm màu hơn khi hơ trên miệng lọ amoniac đặc, chứng tỏ trong đó có chứa hỗn hợp nhiều flavonoid. Vết trên cùng (có Rf là 0,54) tương ứng với vết Kaempferol chuẩn, chứng tỏ trong hỗn hợp này có chứa kaempferol. 7 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Hình 1. Kết quả sắc ký lớp mỏng cắn flavonoid Như vậy, có thể khẳng định trong cắn flavonoid toàn phần chiết được có chứa kaempferol. Chúng em tiếp tục đem các mẫu cắn đi xác định hàm lượng kaemprefol, nhằm mụch đích tối ưu hoá quá trình lựa chọn dung môi chiết. Tiến hành như sau: Cân một lượng chính xác cắn EtOAc, hòa tan trong methanol, định mức thành 25 ml dung dịch. Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm. Dung dịch này được bơm vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc kí như sau: Cột sắc kí ODS-3 (250mm x 4,6mm x 5μm), nhiệt độ cột 40 0 C, detector DAD, λ = 370 nm, pha động: đệm phosphat 10mM, pH = 2,5: Acetonitril (60 : 40), tốc độ dòng pha động: 1,2 ml/phút, thể tích bơm mẫu là 50μl, thời gian chạy sắc kí 12 phút. Với mỗi cắn EtOAc, tiến hành định lượng 3 mẫu, tính kết quả trung bình. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 mAU 366nm,4nm (1.00) /14.797/8413554 Hình 2. Sắc đồ kaempferol với điều kiện lựa chọn Bảng 2. Hàm lượng kaempferol trong cắn flavonoid Dung môi Hàm lượng kaemferol trung bình trong cắn (%) Cách 1 Cách 2 Methanol 60% 0,14 0,50 Methanol 70% 0,16 0,48 Methanol 80% 0,13 0,78 Kết quả thu được với phương pháp chiết bằng methanol 80% và acid hoá cho hàm lượng kaempferol thu được là cao nhất, vì vậy chúng em quyết 8 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam định lựa chọn phương pháp này để tiến hành thực nghiẹm các bước tiếp theo. Từ các kết quả khảo sát thu được ở trên, nâng khối lượng lá chè nên 500g chúng em đề ra quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá chè như sau: Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè: Cân 500g lá chè rồi cho vào bình cầu 10L. Cho thêm 5L MeOH 80%. Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã dược liệu trên với 2,5L MeOH 80% trong khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ hai. Đuổi bớt dung môi ở các lần chiết, gộp các dịch chiết methanol, cô cạn dung môi dưới áp suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn. Thêm nước nóng vào hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn, thu được dung dịch có màu xanh lá đậm. Cho 50mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân trong khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình gạn. Lắc đều 3 lần với CHCl 3 với thể tích của CHCl 3 mỗi lần là 250mL. Cả 3 lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống. Cho HCl 10% vào để cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4 sau đó đem chiết tiếp với etylacetat mỗi lần 250mL. Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na 2 SO 4 khô để hút nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn flavonoid toàn phần. Hình 3. Cô quay chân không dịch chiết 9 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Hình 4. Bột flavonoid toàn phần Như vậy, quy trình chiết xuất flavonoid được tóm tắt như sau: Sơ đồ 1. Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè xanh 10 [...]...Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam 3.3 Phân lập Kaempferol từ flavonoid toàn phần của lá chè xanh 11 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam 3.3.1 Phân tách trên cột silicagel Chuẩn bị cột: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40... Kaempferol từ là chè Việt nam 17 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 1 Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Chúng em sẽ khảo sát độ tinh khiết của sản phẩm thu được,nếu chưa đạt tiêu chuẩn dược dụng sẽ tiếp tục nghiên cứu để tinh chế cho đạt tiêu chuẩn nguyên liệu dung làm thuốc Nếu thời gian cho phép, chúng em sẽ gửi mẫu chiết tách được đi... cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ 1 chiều cho thấy các hợp chất nghiên cứu có công thức phân tử và cấu trúc hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu phổ đã được công bố cho các hợp chất này Nhận xét chung: Từ các giá trị hằng số vật lý và dữ liệu phổ đo được, có thể khẳng định sản phẩm thu được là kaempferol và có độ tinh khiết cao 16 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam PHẦN 4... được λmax = 266,366 nm, phù hợp với giá trị lý thuyết 15 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam 3.4.3.2 Phổ hồng ngoại IR Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các đỉnh: 3344 cm -1 của nhóm OH, và đỉnh 1611 cm-1 của nhóm C=O 3.4.3.3 Phổ khối lượng ESI MS Tiến hành đo phổ ESI-MS của hợp chất nghiên cứu, trên phổ đồ xuất hiện pic 287,1 ứng với mảnh [M+H]+, tương ứng khối lượng... kaempferol từ flavonoid toàn phần 14 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam 3.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 3.4.1 Nhiệt độ nóng chảy Tiến hành đo điểm chảy của sản phẩm Kaempferol theo phương pháp đo trong mao quản Kết quả đo điểm chảy cho thấy điểm chảy của sản phẩm là 279,1 ± 0,3 So với giá trị lý thuyết là 277 ± 1 Nhận xét: Điểm chảy đo được của các hợp chất nghiên cứu phù hợp... cột (đổ từ từ vào thành cột để tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột), dùng pipet tráng vòng quanh bên trong cột trước khi thêm methanol Rửa giải bằng methanol, bỏ qua dung dịch đầu cho đến khi màu của cắn chạm tới đáy cột Cô cạn dịch rửa giải thu được 0,8g chất Quy trình tách kaempferol từ flavonoid toàn phần được tóm tắt như sau: 13 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Sơ đồ... tác giả đã nghiên cứu tách chiết hợp chất này đều đưa ra phương pháp chiết xuất, phân lập để lấy được hợp chất tinh khiết dùng cho nghiên cứu phổ (qui mô phân lập từ vài milligram đến vài chục milligram) Song, các tài liệu trên các tác giả chỉ quan tâm đếnviệc lấy được hợp chất và nhận dạng đúng chất bằng một số phương pháp phổ màchưa tiến hành khảo sát lựa chọn phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân... rửa giải của phân đoạn 1 và 2, chỉ thu dịch rửa giải của phân đoạn 3 Tiến hành lặp lại cho đến khi hết cắn flavonoid toàn phần Cô cạn dịch rửa giải thu được 1,0g cắn 12 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam Hình 5 Sản phẩm sau khi qua cột silica gel 3.3.2 Phân tách trên cột Sephadex Chuẩn bị cột: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40 cm, lắp thẳng đứng... phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân lập và tinhchế hợp chất Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng em đã khảo sát các phương pháp chiết xuất, phân lập để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất cho mục đích tách được kaempferol, mục đích để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, với các dung môi thong dụng và rẻ tiền Cụ thể với việc chiết xuất Kaempferol: Kaempferol là hợp chất tương đối phân cực do có nhiều nhóm... Kaempferol tan tốt trong methanol, ethanol, diethylether, tan trong dung dịch kiềm, không tan trong cloroform, benzen Xuất phát từ đặc điểm này, chúng em đã lựa chọn methanol là dung môi chiết xuất Khảo sát các nồng độ khác nhau và pH môi trường (có acid hóa và không acid hóa dịch chiết nước trước khi chiết bằng ethyl acetat) Kết quả khảo sátcho thấy, trong tất cả các phương pháp, phương pháp ngâm lạnh bằng