nghiên cứu chiết tách kaempferol từ lá chè xanh việt nam

Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam PHẦN LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Tuy có diện tích trồng chè xanh lớn, chất lượng vào loại tốt giới nước ta trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ qua Kaempferol, hoạt chất quan trọng việc phòng chữa bệnh ung thư – bệnh nan y giới Sau học xong tách chiết chất hữu cơ, với tư liệu mà thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol khơng khó nên chúng em định thực ý tưởng Mục đích đề tài chúng em chiết tách kaempferol từ chè xanh nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có nước, góp phần giảm bớt giá thành thuốc chữa ung thư – thường có giá cao Đồng thời thành công ứng dụng thực tế cịn chủ động nguồn ngun liệu nước mà khơng phụ thuộc vào nước ngồi Từ lý trên, nhóm chúng em chọn đề tài: " NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH KAEMPFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM" Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan đề tài Thực trạng bệnh ung thư: Theo thông tin từ Bộ Y tế Việt Nam Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 -200.000 người mắc bệnh ung thư khoảng 75.000 - 100.000 người tử vong bệnh Ung thư nguyên nhân thứ hai gây tử vong Việt Nam thực mối quan tâm quốc gia Kaempferol dược chất nhà nghiên cứu giới Việt Nam nghiên cứu việc điều trị phòng tránh nhiều bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư khoang miệng… Qua nhiều nguồn tin điện tử sách báo, chúng em biết nước ta có nhiều lồi có chứa Kaempferol như: Bạch quả, Bạch thược, Bát giác liên, Bịng bong, Bóng nước, Bơng, Cây cứt lợn, Chàm nhỏ, Chè, Cỏ lào, Dầu giun, Đại táo, Đào, Đậu tây, Đơn đỏ, Địa liền…Vì vậy, chúng em mong muốn thực đề tài chiết tách Kaempferol từ loài gần gũi phổ biến Việt Nam 2.2 Tính đề tài: Ở Việt Nam chưa có đề tài nghiên cứu tách chiết Kaempferol từ chè xanh Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam PHẦN QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 Hóa chất, thiết bị, nguyên liệu: 3.1.1 Nguyên liệu: Lá chè xanh tươi thu mua Hồ Bình, loại tạp, sau đem phơi khơ Bảo quản nơi khơ 3.3.2 Hóa chất nghiên cứu: TT Tên hóa chất Methanol Cloroform Ethyl acetat Aceton Silicagel Sephadex LH20 Natri clorua Natri sunphat Nước cất 3.3.3 Thiết bị nghiên cứu: Nguồn gốc Merck Trung Quốc Trung Quốc Merck Trung Quốc Singapore Trung Quốc Trung Quốc Viện KNVSATTP quốc gia Các thiết bị dụng cụ Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia, Học viện Quân y, Viện Hoá học - Viện hàn lâm khoa học Việt Nam gồm có: Máy móc – Máy cất quay chân không Eyela (Nhật Bản) – Tủ sấy Memmert (Đức) – Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức) – Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ) – Máy cất quay chân không Büchi R-220 (Thụy Sỹ) – Bếp ơm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc) – Máy đo nhiệt độ nóng chảy Memmert (Đức) Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam – Máy UV – VIS (Nhật) – Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer – Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer – Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 MS (Mỹ) – Máy sắc kí lỏng hiệu cao Shimadzu (Nhật Bản) Dụng cụ – Phễu chiết 500mL 1000mL ( Đức) – Pipet – Ống đong 100mL ( Đức) – Cột thủy tinh – Bình hút ẩm – Bình quay 100mL, 250mL 500mL – Và dụng cụ thuỷ tinh khác… 3.2 Khảo sát trình chiết xuất flavonoid từ chè xanh Lá chè xanh đem sấy 600C 24h, sau đem xay thành bột đem chiết xuất theo quy trình sau: Cân 100g chè cho vào bình cầu 2L Cho thêm 1L MeOH nồng độ khác (60%, 70%,80%) Ngâm khoảng rút dịch chiết lần thứ Thực ngâm bã dược liệu với 500ml MeOH khoảng rút dịch chiết lần thứ hai Gộp dịch chiết methanol, cô cạn dung môi áp suất giảm máy hút chân không thu cắn Thêm nước nóng vào hịa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn Kết thu dung dịch có màu xanh đậm Dung dịch xử lý theo cách: Cách (khơng acid hố): Lắc lần với CHCl3 với thể tích CHCl3 lần 50mL Cả lần lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống Cho HCl 10% vào để cân pH dung dịch khoảng – sau đem chiết tiếp với etylacetat lần 50mL Lọc dịch chiết etylacetat, Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam cho bột Na2SO4 khô để hút nước cô cạn áp suất giảm thu cắn flavonoid toàn phần Cách (acid hoá): Cho 10mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân khoảng tiếng cho dung dịch thu vào bình chiết Sau tiến hành tương tự phương pháp Sau thực theo cách đem xác định khối lượng cắn flavonoid tồn phần Mỗi thí nghiệm lặp lần lấy kết trung bình Bảng1 Kết khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ chè Hàm lượng cắn flavonoid thu (g) Dung môi Cách Cách Methanol 60% 2,55 3,55 Methanol 70% 2,99 3,87 Methanol 80% 3,08 4,00 Nhận xét: Ở phương pháp chiết, dung môi chiết xuất methanol 80% cho hiệu suất cao trường hợp dịch chiết acid hoá cho hiệu tốt Sau thu cắn flavonoid toàn phần, chúng em tiến hành xác định xem có chứa kaempferol hay không phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) với điều kiện sau: Bản mỏng silica gel GF 254 (Merck) hoạt hóa 1100C Hệ dung môi triển khai: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 4: 1) Hiện vết ammoniac bão hòa Kết quả: Trên sắc ký đồ cho thấy vết tách rõ ràng Các vết đậm màu hơ miệng lọ amoniac đặc, chứng tỏ có chứa hỗn hợp nhiều flavonoid Vết (có Rf 0,54) tương ứng với vết Kaempferol chuẩn, chứng tỏ hỗn hợp có chứa kaempferol Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam Hình Kết sắc ký lớp mỏng cắn flavonoid Như vậy, khẳng định cắn flavonoid tồn phần chiết có chứa kaempferol Chúng em tiếp tục đem mẫu cắn xác định hàm lượng kaemprefol, nhằm mụch đích tối ưu hố q trình lựa chọn dung mơi chiết Tiến hành sau: Cân lượng xác cắn EtOAc, hòa tan methanol, định mức thành 25 ml dung dịch Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm Dung dịch bơm vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc kí sau: Cột sắc kí ODS-3 (250mm x 4,6mm x 5μm), nhiệt độ cột 400C, detector DAD, λ = 370 nm, pha động: đệm phosphat 10mM, pH = 2,5: Acetonitril (60 : 40), tốc độ dịng pha động: 1,2 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50μl, thời gian chạy sắc kí 12 phút Với cắn EtOAc, tiến hành định lượng mẫu, tính kết trung bình Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam mAU 1200 366nm,4nm (1.00) 1100 1000 /14.797/8413554 900 800 700 600 500 400 300 200 100 -100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình Sắc đồ kaempferol với điều kiện lựa chọn Bảng Hàm lượng kaempferol cắn flavonoid Hàm lượng kaemferol trung bình cắn (%) Dung mơi Cách Cách Methanol 60% 0,14 0,50 Methanol 70% 0,16 0,48 Methanol 80% 0,13 0,78 Kết thu với phương pháp chiết methanol 80% acid hoá cho hàm lượng kaempferol thu cao nhất, chúng em định lựa chọn phương pháp để tiến hành thực nghiẹm bước Từ kết khảo sát thu trên, nâng khối lượng chè nên 500g chúng em đề quy trình chiết xuất flavonoid tồn phần chè sau: Quy trình chiết xuất flavonoid tồn phần từ chè: Cân 500g chè cho vào bình cầu 10L Cho thêm 5L MeOH 80% Ngâm khoảng rút dịch chiết lần thứ Thực ngâm bã dược liệu với 2,5L MeOH 80% khoảng rút dịch chiết lần thứ hai Đuổi bớt dung môi lần chiết, gộp dịch chiết methanol, cô cạn dung môi áp suất giảm máy hút chân không thu cắn Thêm nước nóng vào hịa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cạn, thu dung dịch có màu xanh đậm Cho 50mL HCl đậm đặc vào dung Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam dịch, thủy phân khoảng tiếng cho dung dịch thu vào bình gạn Lắc lần với CHCl3 với thể tích CHCl3 lần 250mL Cả lần lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống Cho HCl 10% vào để cân pH dung dịch khoảng – sau đem chiết tiếp với etylacetat lần 250mL Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na 2SO4 khô để hút nước cô cạn áp suất giảm thu cắn flavonoid toàn phần Hình Cơ quay chân khơng dịch chiết Hình Bột flavonoid tồn phần Như vậy, quy trình chiết xuất flavonoid tóm tắt sau: Sơ đồ Quy trình chiết xuất flavonoid tồn phần từ chè xanh Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam 3.3 Phân lập Kaempferol từ flavonoid toàn phần chè xanh Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam 3.3.1 Phân tách cột silicagel Chuẩn bị cột: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính cm, chiều dài 40 cm, lắp thẳng đứng giá, phía cột có van để điều chỉnh tốc độ dung mơi Khóa van, cho dung mơi rửa giải vào cột Lót lớp bơng mỏng phía đáy cột, van để chất nhồi sau nhồi vào cột không gây tắc cột Nhồi cột: Cân 20 g chất nhồi cột silica gel 60 , thêm 30 ml cloroform, trộn đều, đổ từ từ lên cột Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ để hạt chất nhồi cột lắng xuống Trong q trình ln bổ sung CHCl lên cột, tránh để khơng khí tiếp xúc với silica gel Ổn định cột khoảng 20 phút, đến khoảng cách từ mặt lớp chất nhồi đến mặt dung mơi rửa giải cịn khoảng cm đóng khóa cột Xử lý mẫu: Hịa tan g flavonoid tồn phần cloroform, g chất nhồi cột silica gel 60 ,trộn đều, cô cạn dung môi thu hỗn hợp bột Chuyển nhẹ nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất nhồi cột, dùng pipet tráng vòng quanh bên cột trước thêm dung môi rửa giải Dùng hệ dung môi giửa rải sau: Lần 1: 80mL CHCl3 Lần 2: 40mL CHCl3 + 0,5mL Aceton + 0,5mL CH3COOC2H5 + 0,5mL CH3OH Lần 3: 40mL CHCl3 + 1mL Aceton + 1mL CH3COOC2H5 + 1mL CH3OH Bỏ qua dịch rửa giải phân đoạn 2, thu dịch rửa giải phân đoạn Tiến hành lặp lại hết cắn flavonoid tồn phần Cơ cạn dịch rửa giải thu 1,0g cắn 10 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam Hình Sản phẩm sau qua cột silica gel 3.3.2 Phân tách cột Sephadex Chuẩn bị cột: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính cm, chiều dài 40 cm, lắp thẳng đứng giá, phía cột có van để điều chỉnh tốc độ dung mơi Khóa van, cho dung mơi rửa giải vào cột Lót lớp bơng mỏng phía đáy cột, van để chất nhồi sau nhồi vào cột không gây tắc cột Nhồi cột: Cân 20 g Sephadex LH-20 ngâm methanol Khuấy để tạo hỗn dịch sau rót liên tục từ từ lên cột (dùng đũa thủy tinh giúp rót hỗn dịch lên thành cột, tránh tạo bọt khí) Mở khóa cột để dung mơi chảy từ từ, hứng dung môi đổ ngược trở lại cột, tránh để khô cột Cho dung môi chảy tiếp tục đến cột ổn định Đến khoảng cách từ mặt lớp chất nhồi đến mặt dung môi rửa giải cịn khoảng cm đóng khóa cột Xử lý mẫu: Hòa 0,2g cắn với 4ml MeOH đổ vào cột (đổ từ từ vào thành cột để tránh xáo động lớp chất nhồi cột), dùng pipet tráng vòng quanh bên cột trước thêm methanol Rửa giải methanol, bỏ qua dung dịch đầu màu cắn chạm tới đáy cột Cô cạn dịch rửa giải thu 0,8g chất Quy trình tách kaempferol từ flavonoid tồn phần tóm tắt sau: 11 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam Sơ đồ 2.Quy trình phân lập kaempferol từ flavonoid toàn phần 12 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam 3.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 3.4.1 Nhiệt độ nóng chảy Tiến hành đo điểm chảy sản phẩm Kaempferol theo phương pháp đo mao quản Kết đo điểm chảy cho thấy điểm chảy sản phẩm 279,1 ± 0,3 So với giá trị lý thuyết 277 ± Nhận xét: Điểm chảy đo hợp chất nghiên cứu phù hợp với điểm chảy lí thuyết hợp chất 3.4.2 Sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu kaempferol viện kiểm nghiệm thuốc trung ương thấy sản phẩm thu có giá trị thời gian lưu phù hợp với chất chuẩn Hình Kết sắc ký lớp mỏng sản phẩm 3.4.3 Kết đo phổ 3.4.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS Mẫu thử hòa tan MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml Đem quét phổ máy thu λmax = 266,366 nm, phù hợp với giá trị lý thuyết 13 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam 3.4.3.2 Phổ hồng ngoại IR Trên phổ hồng ngoại sản phẩm xuất đỉnh: 3344 cm -1 nhóm OH, đỉnh 1611 cm-1 nhóm C=O 3.4.3.3 Phổ khối lượng ESI MS Tiến hành đo phổ ESI-MS hợp chất nghiên cứu, phổ đồ xuất pic 287,1 ứng với mảnh [M+H]+, tương ứng khối lượng phân tử 286,1 (C15H10O6) Kết cho thấy chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử tương ứng 3.4.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ chiều cho thấy hợp chất nghiên cứu có cơng thức phân tử cấu trúc hoàn toàn phù hợp với liệu phổ công bố cho hợp chất Nhận xét chung: Từ giá trị số vật lý liệu phổ đo được, khẳng định sản phẩm thu kaempferol có độ tinh khiết cao 14 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam PHẦN KẾT LUẬN Đa số tác giả nghiên cứu tách chiết hợp chất đưa phương pháp chiết xuất, phân lập để lấy hợp chất tinh khiết dùng cho nghiên cứu phổ (qui mô phân lập từ vài milligram đến vài chục milligram) Song, tài liệu tác giả quan tâm đếnviệc lấy hợp chất nhận dạng chất số phương pháp phổ màchưa tiến hành khảo sát lựa chọn phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân lập tinhchế hợp chất Vì vậy, nghiên cứu chúng em khảo sát phương pháp chiết xuất, phân lập để lựa chọn phương pháp phù hợp cho mục đích tách kaempferol, mục đích để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, với dung môi thong dụng rẻ tiền Cụ thể với việc chiết xuất Kaempferol: Kaempferol hợp chất tương đối phân cực có nhiều nhóm –OH cấu trúc phân tử, Kaempferol tan tốt methanol, ethanol, diethylether, tan dung dịch kiềm, không tan cloroform, benzen Xuất phát từ đặc điểm này, chúng em lựa chọn methanol dung môi chiết xuất Khảo sát nồng độ khác pH mơi trường (có acid hóa khơng acid hóa dịch chiết nước trước chiết ethyl acetat) Kết khảo sátcho thấy, tất phương pháp, phương pháp ngâm lạnh MeOH 80%, acid hóa phương pháp cho hàm lượng Kaempferol cao Với nhiều nhóm –OH cấu trúc phân tử, Kaempferol tan tốt dung môi phân cực, nhiên phương pháp ngâm lạnh methanol 80% cho hiệu suất chiết cao với độ cồn cao methanol làm đơng vón tế bào thực vật tốt hơn, giúp giải phóng chất tế bào tốt Phân lập Kaempferol: Phương pháp phân lập Kaempferol tiến hành qua hai giai đoạn, giai đoạn sử dụng cột silicagel, giai đoạn hai tiếp tục phân lập cột Sephadex LH-20 Như vậy, chúng em thực thành công việc chiết tách Kaempferol từ chè Việt nam 15 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Chúng em khảo sát độ tinh khiết sản phẩm thu được,nếu chưa đạt tiêu chuẩn dược dụng tiếp tục nghiên cứu để tinh chế cho đạt tiêu chuẩn nguyên liệu dung làm thuốc Nếu thời gian cho phép, chúng em gửi mẫu chiết tách thử nghiệm tác dụng lâm sàng động vật Tiếp tục hoàn thiện báo cáo Hoàn chỉnh nội dung, trình bày đầy đủ hình ảnh, bảng biểu kết thực nghiệm Các phụ lục tài liệu tham khảo đầy đủ hoàn thiện 16 ... tài chiết tách Kaempferol từ loài gần gũi phổ biến Việt Nam 2.2 Tính đề tài: Ở Việt Nam chưa có đề tài nghiên cứu tách chiết Kaempferol từ chè xanh Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè. .. em thực thành công việc chiết tách Kaempferol từ chè Việt nam 15 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập,... trình tách kaempferol từ flavonoid tồn phần tóm tắt sau: 11 Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ chè Việt Nam Sơ đồ 2.Quy trình phân lập kaempferol từ flavonoid tồn phần 12 Báo cáo nghiên cứu