nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rơm rạ

Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân.. Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL

NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ

SVTH : TRẦN DIỆU LÝ

MSSV : 60301608 CBHD : PGS.TS PHAN ĐÌNH TUẤN

BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ

TP HỒ CHÍ MINH, 01/2008

- -

Số: / BKĐT

NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP

KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ

1 Đầu đề luận án: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân rơm rạ đã qua tiền xử lý, sử dụng enzyme cellulase

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rơm rạ đã qua tiền xử lý,, sử dụng enzyme

cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae

3 Ngày giao nhiệm vụ luận án: 15/9/2007

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 15/12/2007

5 Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn

PGS TS PHAN ĐÌNH TUẤN Toàn bộ

Nội dung và yêu cầu LATN đã được thông qua Bộ môn

Ngày 15 tháng 9 năm 2007

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên) ( Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:

Người duyệt (chấm sơ bộ):

thành luận văn, sinh viên cần phải áp dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mà mình đã tích luỹ được trong suốt những năm học ở trường Chính vì vậy những kiến thức mà em

đã tiếp thu được trong 5 năm học tại trường Bách Khoa là nền tảng vững chắc giúp em hoàn thành luận văn này Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa KỸ THUẬT HOÁ HỌC nói chung và các thầy cô trong bộ môn KỸ THUẬT HỮU CƠ nói riêng vì đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt những năm vừa qua

Em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Đình Tuấn, thầy là người đã giúp em đến với hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn

Em cũng xin cảm ơn anh Ngô Đình Minh Hiệp vì đã nhiệt tình giúp đỡ em cả về kiến thức chuyên môn lẫn thực nghiệm trong suốt những ngày hoàn thành luận văn tại Tung tâm Lọc Hoá Dầu

Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè và người thân trong gia đình, những người luôn là chỗ dựa vững chắc và luôn ủng hộ em trong mọi việc

Sinh viên thực hiện

Trần Diệu Lý

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM 1

1.2 RƠM RẠ 2

1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 2

1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam 3

1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ 3

1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE 5

2.1.1 Cấu trúc lignocellulose 5

2.1.2 Cellulose 6

2.1.3 Hemicellulose 8

2.1.4 Lignin 10

2.1.5 Các chất trích ly 12

2.1.6 Tro 13

2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ 13

2.2.1 Tổng quát 13

2.2.2 Tiền xử lý 14

2.2.3 Thủy phân 20

2.2.4 Lên men 33

2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời 38

2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU 44

2.3.1 Biofuel 44

2.3.2 Ethanol nhiên liệu 45

Chương 3 THỰC NGHIỆM 48

3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 48

3.1.1 Rơm rạ 48

3.1.2 Enzyme 48

3.1.3 Giống nấm men 49

3.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG 49

3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 52

3.4.2 Quá trình nổ hơi – tiền xử lý rơm rạ 67

3.4.3 Quá trình thủy phân 68

3.4.4 Quá trình thủy phân và lên men đồng thời 69

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71

4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RƠM RẠ 71

4.1.1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi 71

4.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi 72

4.1.3 So sánh rơm rạ trước và sau nổ hơi 72

4.1.4 Thành phần dịch nổ hơi .74

4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 76

4.2.1 Thành phần dịch thủy phân 76

4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn 77

4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào 79

4.2.4 Ảnh hưởng của pH 84

4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 87

4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian 92

4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI 94

4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời 94

4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào 95

4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu 98

4.3.4 Hiệu suất toàn quá trình theo thời gian 101

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 104

5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 104

5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI 104

5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TOÀN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI 105

5.4 ĐỀ NGHỊ 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106

PHỤ LỤC 108

Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp 1

Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 3

Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose 6

Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose 6

Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose 7

Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 7

Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan 9

Hình 2-6 Glucomannan 9

Hình 2-7 Galactoglucomannan 9

Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan 10

Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin 10

Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính 11

Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin (flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo) 13

Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi 17

Hình 2-13 Fufural 18

Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural 18

Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi 19

Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm 19

Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase 21

Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose. .25

Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo Enzyme endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme exoglucanase và sau đó khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt Exoglucanse có thể tấn công từ đầu đường khử và không khử .26

Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân 27

Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ 29

Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH 30

Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men 35

Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae 38

Hình 2-30 Nồng độ glucose (ô vuông không màu) và celllobiose (ô vuông màu đen) theo thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời .41

Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. .42

Hình 3-1 Rơm chưa nổ hơi 48

Hình 3-2 Saccharomyces serevisiae chủng turbo yeast extra nhìn dưới kính hiển vi 49

Hình 3-3 Thiết bị nổ hơi quy mô pilot 50

Hình 3-4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 50

Hình 3-5 Hình dạng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi 51

Hình 3-6 Buồng đếm hồng cầu 51

Hình 3-7 Bộ dụng cụ soxhlet 54

Hình 3-8 Hệ thống phân tích NDS và ADS 54

Hình 3-9 Grooch Crucible 54

Hình 3-10 Đường chuẩn glucose 60

Hình 3-11 Đường chuẩn ethanol 61

Hình 3-12 Đường chuẩn cellobiose 62

Hình 3-13 Bộ dụng cụ thủy phân và lên men đồng thời 70

Hình 4-1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi 71

Hình 4-2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi .72

Hình 4-3 So sánh kết quả các thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi 73

Hình 4-4 Rơm trước nổ hơi 74

Hình 4-5 Rơm sau nổ hơi 74

Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào 78

Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme khác nhau 80

Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme 81

Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme 82

Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào 83

Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác nhau 85

Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch 86

Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác nhau 89

Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ 90

Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ .91

Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian .93

Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ 96

Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào tại 48 giờ 97

Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 24 giờ 99

Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 48 giờ 100

Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời .102

Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8] 2

Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10] 5

Bảng 2-2 Các thông số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời được thực hiện trên nhiều nước[9] 39

Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β-glucosidase 39

Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid loãng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí 40

Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men đồng thời lúc 80 giờ 43

Bảng 3-1 Thành phần dung dịch NDS 52

Bảng 3-2 Kết quả chạy chuẩn 58

Bảng 3-3 Kết quả chuẩn glucose 59

Bảng 3-4 Kết quả cho chuẩn ethanol 60

Bảng 3-5 Kết quả chuẩn cellobiose 62

Bảng 3-6 Thành phần môi trường Hansen dùng cho việc nuôi cấy, bảo quản gống nấm men .64

Bảng 3-7 Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dung dịch thủy phân và lên men đồng thời 69

Bảng 4-1 Thành phần rơm rạ khô trước nổ hơi 71

Bảng 4-2 Thành phần rơm rạ theo Hồ Sĩ Tráng [3] 71

Bảng 4-3 Thành phần rơm rạ khô sau nổ hơi 72

Bảng 4-4 So sánh thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi 72

Bảng 4-5 Thành phần dịch nổ hơi 74

Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân 76

Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn 77

Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau 79

Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau 80

Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau .81

Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme cho vào 82

Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch 86 Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác

enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ 96

Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho

vào 99

Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình

thủy phân và lên men đồng thời 101

Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol Luận văn này nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ và được chia làm hai phần Phần đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố :% bã rắn, % enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình thuỷ phân và phần hai nghiên cứu quá trình thuỷ phân

và lên men đồng thời

Rơm rạ được cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc Sau đó được tiến hành thuỷ phân bằng enzyme cellulase hoặc thuỷ phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra

Kết quả cho thấy rằng, quá trình thuỷ phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã rắn, 5% enzyme, 50oC và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu suất đạt 81%

Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5% enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 50oC và pH 4,8 quá trình này thu được 30,86g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61% Kết quả này cho thấy quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ

In Viet Nam, rice straw composes the main portion in agricultural byproducts Containing above 40% of cellulose, rice straw is such a potential feedstock for ethanol production This thesis does research on producing ethanol form rice straw and can be divided into 2 parts The first part studies the effects of the dry solid concentration, enzyme loading, temperature and pH on the saccharification The second part explores the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process

Rice straw was pretreated by steam explosion method in order to be more accessible

to enzyme Then, the residue was introduced to hydrolyzed step or to SSF step These steps were taken place during 2 to 3 days The former utilized enzyme cellulase to hydrolyze cellulose in rice straw In the latter, both the yeast saccharomyces cerevisiae and emzyme cellulase were employed

The result indicated that the optimized condition for saccharification is 11% of dry solid, 5% of enzyme, 50oC and pH 4,8 With this condition, 55,08 g/l glucose was formed and the yield of 81% was obtained

The experiments in SSF showed that the best condition for this process includes 11% of dry solid; 5% of enzyme; 23,6 million cell/ml; 37oC and pH 4,8 30,86g/l ethanol was formed with the yield of 86,61% This result indicates that SSF is such a suitable process for producing ethanol from rice straw

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM

Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam Hình ảnh đất Việt thường được mô tả như là một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa thóc lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu đựa vào phương thức canh tác thủ công truyền thống

Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7]

Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng Nông-Lâm-Ngư nghiệp

Nông nghiệp

GTSL

Lâm-Ngư (tỉ đồng) Tổng số Lúa Các nguồn

Nông-khác

Lâm nghiệp

Ngư nghiệp

Lâm nghiệp 4%

Ghi chú: Các nguồn khác: % giá trị sản lượng của cây hoa màu lương thực, rau đậu,

cây ăn quả, cây công nghiệp, chăn nuôi và dịch vụ nông nghiệp

Bảng số liệu và đồ thị trên cho ta thấy vai trò quan trọng của cây lúa chiếm 38%

trong tổng giá trị sản lượng nông – lâm - ngư nghiệp cả nước

1.2 RƠM RẠ

Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm và

trấu Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có nhiều tiềm năng ở

Việt Nam

1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam

Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam

Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]

STT Biomass Lượng (triệu tấn) Năng lượng chứa

62.6

máy cưa gỗ đốt rác thải rắn rơm trấu vỏ bắp bã khoai mì Phế phẩm cây mía bã mía vỏ đậu

xơ và lá dừa vỏ hạt cafe

Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000

Bảng số liệu và đồ thị trên cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử dụng làm nguồn nguyên liệu Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm 2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ Rơm hứa hẹn là một nguồn năng lượng lớn cho nước ta

1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam

Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nĩi riêng và từ biomass nĩi chung khơng dược sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam Phần lớn rơm rạ được bĩn trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nơng, làm thức ăn cho gia súc …

Theo [8], biomass chỉ chiếm 3,8% trong tổng năng lượng sử dụng của thành phố Hồ Chí Minh năm 2003, trong khi đĩ, nguồn năng lượng này chiếm 89% trong tổng năng lượng sử dụng ở nơng thơn năm 2001 Ở nơng thơn, biomass chủ yếu được dùng làm chất đốt và hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%

1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ

Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luơn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới Mỹ và Brazil đã thành cơng trong việc sản xuất

ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học

Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới

Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam

Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm

rạ để sản xuất bioethanol là phương pháp sử dụng rơm rạ một cách hiệu quả đồng thời góp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta

1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mục đích chính của đề tài là nghiên cứu khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol Các mục tiêu chính trong đề tài là:

• Nghiên cứu quá trình thủy phân rơm đã qua tiền xử lý nổ hơi bằng enzyme cellulase, tạo ra dịch đường

• Nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời để chuyển hóa cellulose trong nguồn rơm rạ ban đầu thành ethanol

Các nội dung chính cần phải thực hiện để đạt được mục tiêu trên:

¾ Đối với quá trình thủy phân:

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn đối với quá trình thủy phân

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào đối với quá trình thủy phân

• Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đến quá trình thủy phân

• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

• Khảo sát nồng độ đường tạo thành theo thời gian

¾ Đối với quá trình thủy phân và lên men đồng thời

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme đến quá trình

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men cho vào lên quá trình

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE

Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất Lignocellulose có trong phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu ở dạng phế phẩm của các vụ mùa; trong sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; có trong rác thải rắn của thành phố Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất bioethanol Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose

Xylane Mannan Galactan Arabianan Lignin

Chất trích ly

Gỗ dương 49,9 17,4 4,7 1,2 1,8 18,1 - Phế phẩm

Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân [9]

Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose

2.1.2 Cellulose

hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi đó OH tại C4 có tính chất của rượu [2]

Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [9] Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình [10]

Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain

1/ Kiểu Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chìều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình

2/ Kiểu Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại

có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ Các đơn vị

đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [4]

Cellulose được bao bọc bởi hemicellulos và lignin, điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất

2.1.3 Hemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70

đến 200 DP Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose và

đường 5 gồm xylose và arabinose Thành phần cơ bản của hemicellulose là β - D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1,4)

Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên

có một vài điểm chung gồm:

• Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4)

• Xylose là thành phần quan trọng nhất

• Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3

• Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân

Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác nhau:

Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:

O-methyl-D-glucuronic Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ

lệ bằng nhau β-D-glucopyranose và β-D-mannopyranose [9]

Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan

Hình 2-6 Glucomannan

• Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh Loại

hemicellulose này tạo liên kết –O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose,

β-D-galactose hoặc acid β-D-glucoronic [9]

Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:

• Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các

phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ

lệ hai monomer tương ứng là 3:1 Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ[9]

Hình 2-7 Galactoglucomannan

• Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các

monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng L-arabinofuranose [9]

α-Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan Polysaccharide này cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic OH ở vị trí C3 sẽ tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose [9]

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-courmary

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin

Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl Nghiên cứu chỉ

ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin [10]

Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng vô định hình Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl

và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước

Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxy, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm carbonyl Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl

Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết [4] Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)

Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn

200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá trong quá trình nổ hơi Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C.[10]

2.1.5 Các chất trích ly

Có rất nhiều chất thuộc nhóm thành phần này, chủ yếu là các chất dễ hòa tan Theo định nghĩa khái quát trong sách “Kĩ thuật cellulose và giấy” ở trang 64, các chất trích ly là những chất hoặc có khả năng hòa tan trong những dung môi hữu cơ (như dietyl ether, methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa, diclormethene, acetone, ethanol, methanol, hexan, toluen, terahydrofuran) hoặc trong nước Chính vì thế phương pháp thông dụng nhất để tách nhóm chất này trong việc phân tích thành phần sơ xợi lignocellulose là dùng trích ly với dung môi ethanol-benzene tỉ lệ 1:2 Những chất này có thể có cả tính ưa dầu và ưa nước và không được xem là thành phần cấu trúc của gỗ Chất nhựa là những chất ưa dầu,

có lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong chất trích ly, nên thường chất trích ly hay được gọi là nhựa (resin)

tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay côn trùng Terpenoid, steroid, chất béo, và những phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và flavonoid đều là những chất trích ly Các phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh hưởng đến màu của gỗ Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là nhựa dầu Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và côn trùng Một số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng Ví dụ, flavonoid được sử dụng như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus Một số cấu trúc chất trích ly được thể hiện ở những hình sau:

Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin

(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)

2.1.6 Tro

Trong các loại gỗ của xứ ôn đới, các nguyên tố khác so với carbon, hydro, oxy và nito – chiếm khoảng 0,1-0,5% (so với lượng rắn khô trong gỗ) Với loại gỗ xứ nhiệt đới con số này có thể là 5% Hàm lượng chất vô cơ được đo bằng hàm lượng tro của mẫu và

nó trong khoảng 0,3-1,5% cho hai loại gỗ mềm và gỗ cứng Hàm lượng này phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường tăng trưởng của cây và vào vị trí trong cây

Tương tự chất trích ly, thành phần vô cơ của biomass thường thực hiện chức năng trong một vài con đường sinh học ở thực vật Kim loại vết thường tồn tại ở dạng phức hợp như magnesium trong chlorophyll Một số chất vô cơ từ muối kim loại tồn tại trong vách

tế bào thực vật Calcium thường là kim loại phong phú nhất, sau đó là kali và magnesium

2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ

2.2.1 Tổng quát

Sơ đồ quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ

Những yếu tố về cấu trúc và thành phần ảnh hưởng đến khả năng chống lại sự tấn công của enzyme của lignocellulose gồm có:

• Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh thể chống lại được sự tấn công của enzyme Trong một bài báo của mình, Fan et al [9] ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90% Tuy nhiên, không có sự liên quan

• Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu trúc mô vững chắc cực kì Những mô được bền hóa với lignin tương tự như nhựa được gia cố bằng sợi, trong đó lignin đóng vai trò kết dính những sợi cellulose Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của môi trường và khí hậu Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn công của enzyme đến cellulose được công nhận nhiều nhất Theo [9] có nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân của enzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, không

có nghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà không kèm theo sự phân hủy hemicellulose Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở nhiệt độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan Vì vậy, những thí nghiệm trên cũng không hoàn toàn cho thấy ảnh hưởng của việc loại bỏ lignin riêng lẻ

• Bề mặt tiếp xúc tự do của cellulose: liên quan đến bề mặt tiếp xúc của cellulose với enzyme, và thể tích xốp Stone et al [9] giả thiết rằng tốc độ đầu của quá trình thủy phân là hàm của bề mặt tiếp xúc tự do Grethlein et al [9] cho rằng thể tích lỗ xốp chứ không phải độ kết tinh của cellulose mới ảnh hưởng đến tốc độ đầu Tuy nhiên,

bề mặt tiếp xúc tự do này có liên quan đến độ kết tinh và sự bảo vệ của lignin

• Sự hiện diện của hemicellulose: cũng như lignin, hemicellulose tạo thành lớp bảo

vệ xung quanh cellulose Knappert et al [9], trong nghiên cứu xử lý bằng acid sulfuric với gỗ dương cho thấy khả năng thủy phân tăng theo tỉ lệ hemicellulose bị loại bỏ Grohman, thí nghiệm tiền xử lý rơm lúa mì bằng acid, kết quả cho thấy việc loại bỏ hemicellulose sẽ gia tăng đáng kể khả năng thủy phân rơm rạ Họ cho rằng, việc loại bỏ lignin là không cần thiết, tuy rằng nếu đạt được thì rất tốt Trong khi đó, hemicellulose được chứng minh là ngăn cản quá trình tấn công của enzyme vào rơm rạ [9] Tuy nhiên, trong những thí nghiệm này, lignin tuy không bị loại bỏ nhưng lại có thể bị đông hoặc chảy ra một phần, làm giảm khả năng bao bọc cellulose của nó Vì thế những thí nghiệm trên chưa cho thấy được hiệu quả của việc loại bỏ riêng lẻ hemicellulose

• Mức độ acetyl hóa của hemicelluloses: Đây là yếu tố ít được quan tâm, xylan, loại hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ bị acetyl hóa với tỉ lệ rất cao Grohmann et al [9], nghiên cứu với rơm lúa mì và cây dương, cho thấy rằng khi xylan bị deacetyl hóa, tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần Ảnh hưởng này tồn tại đến khoảng 75% hemicellulose bị deacetyl hóa

• Tăng vùng vô định hình của cellulose

• Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass

• Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose

Sau đây là một số công nghệ tiền xử lý phổ biến:

2.2.2.1 Các phương pháp tiền xử lý hóa học:

Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình Gồm có các quá trình chính:

• Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên

vì nó rẻ và hiệu quả Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH

• Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine

có thể còn hiệu quả hơn

• Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2,

NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm

2.2.2.2 Các phương pháp tiền xử lý cơ học

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này

2.2.2.3 Nổ hơi nước (Steam explosion)

Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W H Mason trong sản xuất gỗ

ép[1] Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi nước được giới thiệu từ năm 1980[1] Công ty Iotech Corporation đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh hưởng của

và xylose cũng khác nhau, và xylose thường đạt cực đại trước glucose Tương tự như vậy, sản lượng cực đại của xylose và glucose được tìm thấy lớn nhất ở những áp suất khác nhau Điều kiện phản ứng tối ưu của holocellulose (xylose + glucose) là 500 – 550 psi trong thời gian 40 giây.[1]

Đã có vài nghiên cứu ứng dụng nổ hơi cho các loại nguyên liệu biomass sau khi

báo cáo của Iotech được trình bày Shultz et al [1] so sánh hiệu quả của nổ hơi lên hỗn

hợp các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, rơm bắp, và bã mía Nổ hơi ở 240 – 2500C và 1 phút sẽ làm gia tăng tốc độ thủy phân enzyme của các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, và bã mía lên ngang bằng với tốc độ thủy phân giấy lọc Nghiên cứu cũng tìm thấy không có sự khác nhau về tốc độ thủy phân của mẫu đã trữ trong 8 tháng trước với tốc độ thủy phân của mẫu được trữ trong thời gian ngắn hơn

Martinez et al [1] sử dụng Onopordum nervosum và Cyanara cardunculus làm

nguyên liệu Hiệu quả đường hóa (lượng glucose giải phóng ra sau 48 giờ thủy phân

enzyme/lượng glucose cực đại trên cơ chất) đạt được trên 90% đối với O nervosum ở

2300C, 1 – 2 phút và C cardunculus ở 2100C, 2 – 4 phút

Theo luận văn cao học của thầy Trịnh Hoài Thanh [6], thời gian xử lý và nhiệt độ

xử lý đối với rơm rạ càng tăng thì lượng bã thu hồi được càng giảm Khi xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đối với lượng đường có khả năng lên men, nhiệt độ xử lý ở mức

độ vừa phải sẽ làm tăng khả năng thủy phân, tăng lượng đường và do đó sẽ làm tăng lượng cồn thu được Điều này có thể được giải thích là do sự đề – lignin hóa do tác động của nhiệt độ và sự phân hủy của hemicellulose làm giải phóng và gia tăng kích thước lỗ xốp Tuy nhiên khi nhiệt độ xử lý cao hơn 210oC, lượng đường thu được do thủy phân có

xu hướng giảm xuống vì cellulose bị phân hủy Theo [6], khi thời gian xử lý tăng thì lượng đường có khả năng lên men được tăng do khả năng tấn công vào cellulose đã được cải thiện

Cơ chế quá trình nổ hơi nước

Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi

Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hóa – nhiệt Đó là phá vỡ cấu trúc các hợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do sự giãn nở của ẩm (cơ),

và thủy phân các liên kết glycosidic (hóa)

Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nhập vào cấu trúc lignocellulosic bởi quá trình khuếch tán và làm ẩm nguyên liệu Ẩm trong biomass thủy phân các nhóm acetyl của hemicellulose hình thành nên các acid hữu cơ như acetic và uronic acid Các acid này lần lượt xúc tác quá trình depolymer hóa hemicellulose, giải phóng xylan và một phần glucan Dưới điều kiện khắc nghiệt, vùng vô định hình của cellulose có thể bị thủy phân đến một mức độ nào đó Dưới điều kiện khắc nghiệt hơn, ví

dụ như nhiệt độ cao và áp suất cao, có thể thúc đẩy sự phân hủy xylose thành furfural và glucose thành 5-hydroxymethyl furfural Furfural và 5-hydroxylmethyl furfural kìm hãm

sự phát triển của vi sinh vật, do đó nó không thuận lợi cho quá trình lên men [12]

Hình 2-13 Fufural Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural

Ẩm trong biomass sẽ hóa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thiết bị phản ứng được giải phóng và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống còn áp suất khí trời Hiện tượng này cũng giống như hiện tượng nổ Nguyên liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua một lỗ nhỏ bởi lực ép Một vài hiện tượng xảy ra tại thời điểm này Đầu tiên, ẩm ngưng tụ trong cấu trúc biomass bốc hơi tức thời do giảm áp đột ngột Sự giãn nở của hơi nước gây

ra lực cắt bao quanh cấu trúc nguyên liệu Nếu lực cắt này đủ lớn, hơi nước sẽ gây ra sự phá hủy cơ học lên cấu trúc lignocellulosic Hình 2-14 mô tả cơ chế quá trình nổ hơi Hình 2-15 mô tả sự giải phóng cellulose khỏi vỏ bọc lignin Hình 2-16 mô tả khả năng làm tăng kích thước lỗ xốp trong xơ sợi Sự mô tả quá trình làm nổi bật tầm quan trọng của việc tối ưu hai yếu tố: thời gian lưu và nhiệt độ Thời gian biomass lưu lại trong thiết

bị phản ứng giúp xác định phạm vi thủy phân hemicellulose bởi các acid hữu cơ Việc thủy phân hemicellulose giúp cho quá trình lên men thuận lợi hơn Tuy nhiên, thời gian lưu dài cũng làm gia tăng sự phân hủy sản phẩm

Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi

lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi

Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công

của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm

Nhiệt độ có liên quan đến áp suất hơi trong thiết bị phản ứng Nhiệt độ càng cao thì

áp suất càng cao, do đó càng làm gia tăng sự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản ứng so với áp suất khí quyển Sự chênh lệch về áp suất tỷ lệ với lực cắt của ẩm hóa hơi

Ưu nhược điểm của quá trình nổ hơi nước:

Tóm tắt lại, theo quá trình nổ hơi nước có mấy tác động sau lên cấu trúc nguyên

liệu lignocellulose

1 Tăng sự kết tinh của cellulose bằng cách thúc đẩy sự kết tinh của vùng vô định hình

2 Hemicellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi

3 Sự nổ hơi thúc đẩy việc khử lignin

Cùng với việc gia tăng kích thước lỗ xốp, tác động (2) và (3) là 3 ưu điểm của quá trình nổ hơi Tuy nhiên, tác động (1) lại gây ra khó khăn cho quá trình thủy phân Ngoài

ra những nhược điểm chính của quá trình nổ hơi là:

• Tốn chi phí, năng lượng vận hành

• Đòi hỏi thiết bị chịu được nhiệt độ, áp suất rất cao

• Có thể làm phân hủy cellulose

• Mất đi đường từ hemicellulose

• Làm sinh ra fufural và 5-hydroxymethyl fufural gây ức chế quá trình lên men [12]

2.2.3 Thủy phân

Phương trình phản ứng

6 12 6 2

5 10

Cellulase là một loại enzyme, có thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh

vật đơn bào; có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose Ký hiệu là EC 3.2.1.4

b) Yêu cầu đối với cellulase

Sự phát triển của quá trình chuyển hóa biomass – một nguồn nguyên liệu thô, ít giá trị, thành ethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bước đặc biệt là việc sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy phân cellulose có hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose) Giá của enzyme này khá cao từ 0,3 đến 0,81 dollar/gam [9] Quá trình sản xuất cellulase gặp hai vấn đề chính: sự sinh trưởng và phát triển chậm của nấm mốc và quá trình tách cellulase ra khỏi nấm mốc tốn rất nhiều thời gian Để quá trình sản xuất ethanol

có thể được xây dựng với quy mô lớn, vấn đề được đặt ra là hoạt tính của enzyme cellulase phải cao hơn loại enzyme đang được sản xuất từ nấm mốc Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase phải có giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định cao, chịu được pH và nhiệt độ

c) Nhóm enzyme cellulase

Mặc dù phổ biến trên trái đất, cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose

có độ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau

• “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC

3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan

• “Exo -1,4-β-D-glucanases” bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC

3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D-glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy

phân chậm D-cellobiose; ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucan

cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ

1,4-β-glucan

• “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có

tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của glucose

Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase

Nhóm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, còn glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên được tách thành nhóm riêng Tuy nhiên trong luận văn này, để tiện việc trình bày nên gọi chung nhóm 3 enzyme này là cellulase

β-d) Các nguồn sản xuất cellulase

Người ta thống kê được có hơn 60 loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, gồm có các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot Các loại nấm mốc thuộc nhóm cuối cùng (white-rot) có thể phân hủy cả cellulose và lignin Nhiều nghiên cứu vẫn đang được tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn Gần đây, Coughlan và Ljungdahl trong nghiên cứu của mình [9] đã tìm được 46 loại vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase Các vi khuẩn này có khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí

và kỵ khí Nhóm kỵ khí điển hình bao gồm các giống acetivibrio, bacteroides, clostridium, micromonospora và ruminococcus Nhóm hiếu khí bao gồm các giống Acidothermus, Bacillus, cellulomonas, cellvibrio, cytophaga, Microbispora, Pseudomonas và Thermomonospora

e) Cấu trúc enzyme cellulase

Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hóa sinh và sinh học phân tử, người ta có thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thông qua giống nấm mốc Trichoderma reesi Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme cellulase

Vào cuối những năm 1980, Abuja et al [17,18] đã đề nghị cấu trúc bậc 3 của

Trichoderma reesei CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I – cellobiohydrolase I) và CBH

II Trong đó, enzyme gồm:

• Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn

• Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) có kích

thước nhỏ hơn Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD

có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề mặt cellulose Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và

do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho

vùng có tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose

• Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau Đối với

enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và proline

Serine Threonine Proline Đối với T reesei CBH II, lõi protein có tác dụng phá vỡ cấu trúc vi sợi của cellulose Sản phẩm thủy phân của CHB I giữ nguyên cấu trúc lập thể của C1(C chứa nhóm OH hemiacetal), trong khi đó CBH II tạo sự nghịch đảo cấu hình của C1 thành đồng phân α

Cellulase có nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều có cấu trúc tương tự

2.2.3.2 Cơ chế quá trình thủy phân

Quá trình tác dụng thủy phân của cellulase có thể chia thành những giai đoạn sau

a) Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi

Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha rắn/lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử Những tương tác này thường không mang bản chất cộng hóa trị, nói cách khác, các tương tác này thường tạo thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm kỵ nước Các phân

tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đến sự hấp phụ mới Lực tĩnh điện góp phần vào việc hấp phụ của protein (enzyme) lên bề mặt phân pha, tuy nhiên không phải là yếu tố quyết định quá trình hấp phụ của protein

Protein là một polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này làm cho protein có bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt Phần kỵ nước trong phân tử protein là những nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine

Thông thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các aminoacid mang nhóm kỵ nước sẽ được giấu vào bên trong Tuy nhiên, cũng có một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề mặt ngoài của phân tử protein Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa các phần kỵ nước và liên kết hydro Ái lực của protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh hưởng tới tương tác tĩnh điện Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề mặt kỵ nước là bất thuận nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước Điều này bởi vì phân

tử protein sẽ có một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước

Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro (không còn nhóm phân cực tự do) Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện Trong thực

tế, điện tích bề mặt của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó

Ví dụ các bề mặt tiếp xúc với nước thường mang điện âm Các nghiên cứu về quá trình tiền xử lý – nổ hơi cho thấy sau quá trình này, tính chất kỵ nước của cơ chất (được đo bằng thời gian giọt nước thấm vào vật liệu Water drop penetration time WDPT) tăng Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp phụ mà tương tác điện tích – địên tích hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đóng vai trò quyết định cho quá trình Ví dụ trong một nghiên cứu về enzyme protease, khi thay đổi một nhóm ưa nước mang điện tích dương - lysine bằng một amino acid kỵ nước, không mang điện – phenylalanine, người ta nhận thấy khả năng hấp phụ của enzyme này lên bề mặt ưa nước cũng như kỵ nước đều giảm Điều này cho phép kết luận, trong trường hợp của protease, lực tương tác tĩnh điện

có tác dụng chủ yếu đối với quá trình hấp phụ của enzyme

Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn đến sự hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose Ngoài ra, đối với β-glucosidase không giống các enzyme cellulase khác, không có trung tâm tạo liên kết CBD, enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng

Rất cần thiết hạn chế tối đa việc hấp phụ không chọn lọc của cellulase lên lignin nếu muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế Về mặt lý thuyết, công nghệ protein có thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho enzyme này hấp phụ chọn lọc hơn Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên vùng cellulose kết tinh là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác động lên cấu trúc cần được

b) Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose

Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose

Hình 2-18 mô tả liên kết của CBH với cellulose Trung tâm tạo liên kết của cellulase làm phá hủy một phần cấu trúc chặt chẽ của các mạch cellulose Sau đó, các mạch này sẽ được dẫn vào vùng trung tâm hoạt động của cellulase Quá trình dẫn này xảy ra nhờ sự hiện diện của mạch peptide ưa nước, khu vực này sẽ tạo các liên kết hydro bao bọc sợi cellulose, nhằm tránh sự xâm nhập quá sâu của CBD vào bề mặt cellulose

Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose CBD

và trung tâm hoạt động chính CD Cellulase tạo được liên kết với cellulose là nhờ vào trung tâm tạo liên kết CBD Đối với các chủng T reesi, CBD là trung tâm gồm các phân

tử nhỏ, gồm 36 amino acid Thông thường, trung tâm liên kết có 3 amino acid tyrosine, chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose Trong CBH I, một tyrosine bị thay bằng tryptophane

Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBH I, CBH II, EG …) sẽ dẫn đến ái lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết với cellulose Cụ thể số lượng các amino acid có tính không phân cực cao (tyrosine, phenylalanine, tryptophan) nằm trong trung tâm hoạt động là bằng nhau đối với CBH I và CBH II ( 5 và 6 nhóm) Trong khi đó, số lượng các amino acid không phân cực trong trung tâm hoạt động của CBH II cao hơn Điện tích bề mặt của các enzyme cũng rất khác biệt Ví dụ, đối với trung tâm tạo liên kết CBD, CBH II có thể có tương tác tĩnh điện vì có

aspartic acid ở vị trí 30, trong khi đó CBH I và EGII không có tính chất này vì ở vị trí 30

là proline

Quá trình hấp phụ của CBH I không bị ảnh hưởng của liên kết tĩnh điện giữa bề mặt

cơ chất và enzyme Ngược lại, CBH II có chịu ảnh hưởng của lực tĩnh điện

c) Cơ chế tác động hiệp đồng của các enzyme

Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulose từ các

nguồn nấm mốc khác nhau có thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong quá trình

thủy phân Từ lúc đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mô tả quá trình tác động

hiệp đồng của các enzyme endo, exo cellulase

Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo Enzyme

endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme

Nghiên cứu về tác động hiệp đồng của endo-exo công bố đầu tiên vào năm 1980 Khái niệm endo-exo được mô tả trong hình 2-19 Sự tác động hiệp đồng của endo-exo có thể nói là nhằm mục đích tạo bề mặt tấn công mới cho exoglucanse Enzyme exo thường tấn công vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) có đầu là nhóm khử (C chứa

OH hemiacetal) hoặc không khử Trong khi đó, enzyme endo lại tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp của enzyme exo Exoglucanase có những loại enzyme tấn công đặc trưng tùy theo tính chất khử được hay không khử được của nhóm đầu mạch Thật vậy, theo những nghiên cứu của Teeri và cộng

sự, nhóm khử đầu mạch của cellodextrin sẽ được định hướng vào trung tâm xúc tác của CBH I Trong khi đó, CBH II lại ưu tiên tấn công vào đầu không có nhóm khử của cellodextrin

Ngoài ra, cũng có nhiều nghiên cứu về sự tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn Dựa trên các nghiên cứu này, enzyme celluase

có thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn khác nhau nhằm tạo được một hệ enzyme có tác động mong muốn

TÓM TẮT Quá trình thủy phân có thể được tóm tắt trong hình sau

Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân

• Enzyme endo-cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide

• Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và không khử thông qua tường tác của CBD với cellulose, tạo thành cellobiose, cả glucose

• β-glucosidase tấn công cellobiose và oligosaccharide tan, tạo glucose

2.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân

a) Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu

Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau:

sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enxyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân

Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên tron xơ sợi tạo thành Nếu cellulose không được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp Xử lý loại bỏ hemicelluose (bằng tiền xử lý acid) sẽ làm tăng khả năng thủy phân cellulose (theo nghiên cứu của Grohmann) Grethlein đã giải thích rằng loại bỏ hemicellulose sẽ làm tăng cấu trúc xốp đồng thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật lịêu Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp và vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt Hàm lượng và sự phân

bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đã được loại bỏ gần hết lignin