BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CAP QUAN LY DE TAI: BO Y TẾ
TÊN DE TAI
CHIET XUAT POLYPHENOL TU LA CHE XANH VIET NAM, DANH GIA TAC DUNG CUA BOT POLYPHENOL TREN SU ROI LOAN CHUYEN HOA LIPID 6 THO UONG CHOLESTEROL VA
TRẠNG THAI CHONG OXYHOA 6 THO BI CHIEU XA
CHUYEN NGANH HOA SINH
Chủ nhiém dé tai : TS PHAM THIEN NGOC Cơ quan chủ trì : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Trang 2NỘI DUNG
1 Báo cáo toàn văn đề tài nghiên cứu khoa học
2 Đề cương nghiên cứu khoa học, đơn xin thay đổi đề
cương và sự đồng ý của Vụ KHKT Bộ Y tế
3 Quyết định thành lập hội đồng nghiệm thu đề tài
NCKH cấp bộ
4 Biên bản nghiệm thu đề tài NCKH cấp bộ
Trang 3BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC
CAP QUAN LY DE TAI: BO Y TE
TÊN ĐỀ TÀI
CHIẾT XUẤT POLYPHENOL TỪ LÁ CHÈ XANH VIỆT NAM, ĐÁNH GIÁ TÁC DỰNG CỦA BỘT POLYPHENOL TRÊN SỰ RỐI
LOẠN CHUYEN HOA LIPID 6 THO UONG CHOLESTEROL VA
TRANG THAI CHONG OXYHOA 6 THO BI CHIEU XA Chuyén nghanh Hoa sinh
Chủ nhiệm đề tài : TS Phạm Thiện Ngọc
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin bày tổ lòng cảm ơn tới:
- Lãnh đạo Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo Bộ Y tế đã cung cấp kinh phí để chúng tôi có thể hoàn thành đề tài
- Ban Giám Hiệu, Phòng Nghiên cứu khoa học, Ban chủ nhiệm và toàn thể cắn bộ công chức của Bộ mơn Hố - Hố sinh, Trường đại học Y Hà nội đã góp ý, động viên và tạo điều kiện tối ưu cho chúng tôi thực hiện đề tài
- Phòng Vật tư kỹ thuật, Phòng Sau đại học Trường Đại Học Y Ha Noi đã giúp đỡ mua hoá chất vật tư, thiết bị và tạo điều kiện tốt cho việc thực hiện đề tài
- Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi thực hiện các nghiên cứu khoa học về lĩnh vực mô bệnh học
Chúng tôi xin chân thành cẩm ơn :
- G@S.TSKH Nguyễn Xuân Phách đã đóng góp nhiêu ý kiến quý báu cũng như cung
cấp cho chúng tôi những tài liệu khoa học liên quan đến lĩnh vực phóng xạ Y học
Trang 5MỤC LỤC Lời cảm ơn Các chữ viết tát Đặt vấn đề Tổng quan
1 Chè xanh và tác dụng sinh học của chè xanh 2 Lipid va lipoprotein mau
3 Gốc tự do và các chất chống oxyhoá
4 Bức xạ ion hoá và ảnh hưởng trên cơ thể sống Đối tượng, phương pháp
1 Chất liệu, thỏ thực nghiệm, trang bị và hoá chất
2 Phương pháp chiết xuất và xác định thành phần bột polyphenol chè xanh
3 Mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng của bột polyphenol chè xanh
trên rối loạn chuyển hoá lipid ở thỏ uống cholesterol
4 Mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng của bột polyphenol chè xanh ở thỏ bị chiếu xạ
Kết quả
1 Chiết xuất và xác định thành phần bột polyphenol chè xanh
2 Tác dụng của bột polyphenol chè xanh trên rối loạn chuyển hoá lipid ở thỏ uống cholesterol
2.1 Cân nặng các nhóm thỏ theo thời gian thực nghiệm
2.2 Tác dụng của BPPCX trên một số chỉ số lipid huyết tương thỏ
2.3 Ảnh hưởng của BPPCX đến hàm lượng MDA huyết tương
2.4 Kết quả về giải phẫu bệnh động mạch chủ của các nhóm thỏ thực nghiệm 3 Tác dụng chống oxyhoá của bột polyphenol chè xanh ở thỏ bị chiếu xạ
3.1 Cân nặng của các nhóm thỏ theo thời gian thực nghiệm
3.2 Tác dụng của BPPCX trên một số chỉ số huyết học
3.3 Tác dụng của BPPCX trên nồng độ glucose máu
Trang 63.7 Kết quả giải phẫu bệnh gan, thận, tuỷ xương của các nhóm thỏ chứng
và nhóm chiếu xạ 74
Bàn luận T1
Kết luận ⁄ 98
Phương hướng nghiên cứu tiếp 99
Tài liệu tham khảo 100
Trang 7ACAT Apo BVPX BC CAT CE CETP CM BPPCX DNA FC GPx GR GSH GSSG HDL HDL-C HMG- CoA reductase HC HTCO IDL LCAT LDL LDL-C LP LPL MDA POL SOD TAS TC TG TLPT VLDL VXDM WHO CÁC CHỮ VIẾT TẤT : AcylCoA cholesterol acyl transferase : Apoprotein : Bão vệ phóng xạ : Bạch cầu : Catalase : Cholesterol este : Cholesterol este transfer protein (protein van chuyén cholesterol este) : Chylomicron : Bét polyphenol ché xanh
: Desoxy ribonucleic acid
: Free cholesterol (cholesterol tu do) : Glutathion peroxidase
: Glutathion reductase : Glutathion dang khử : Glutathion dang oxy hoá
: High density lipoprotein (lipoprotein ty trong cao)
: Cholesterol cla lipoprotein ty trong cao
:B hydroxy-B metyl-glutaryl- coenzymA reductase
:Héng cầu
: Hoạt tính chống oxy hoá
: Intermediate density lipoprotein (lipoprotein ty trọng trung gian) : Lecithin cholesterol acyl transferase
: Low density lipoprotein (lipoprotein ty trong thap)
: Cholesterol cua lipoprotein ty trong thap : Lipoprotein : Lipoprotein lipase : Malonyl dialdehyd : Peroxi hoa lipid : Superoxid dismutase
:Total antioxidant status (Trạng thái chống oxy hố tồn phần)
: Total cholesterol (cholesterol toàn phần)
: Triglycerid
:Trong lugng phan tir
: Very low density lipoprotein (lipoprotein ty trọng rất thấp)
: Vữa xơ động mach
Trang 8ĐẶT VẤN DE
Chè xanh là loài cây được trồng rộng rãi và chè xanh được sử dụng làm nước uống giải khát từ
hàng nghìn năm trước đây ở rất nhiễu nước , đặc biệt ở các nước châu Á như Việt Nam, Nhật
Bản, Trung Quốc, Ấn Độ,v.v
Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm nghiên cứu về chè
xanh trên nhiều khía cạnh khác nhau
Chè xanh có nhiều loài, thành phần hoá học của một số loài chè xanh trên thế giới đã được xác định và công bố bao gém : cafein, cdc polyphenol, acid amin, acid béo, carbonhydrat, tanin,
muối khoáng ( Ca, P, Fe, Na, K), Vitamin (A,BI, B2, C,) Các polyphenol là thành phần hoá học
quan trọng của chè xanh vì hàm lượng của chúng tương đối cao và có nhiều tác dụng y sinh học
quý đối với con người [109]
Polyphenol chè xanh có tác dụng chống oxyhoá bảo vệ cơ thể chống lại tác hại của phóng xạ,
chống ung thư, hạ lipid máu, chống xơ vữa động mạch, ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gay bénh,.v.v [ 76, 89,108, 112, 114, 115, 116, 117, 119]
Hội chứng tăng lipid mau 1a mot trong nhiing nguy co cha VXDM Nong do Cholesterol cao
trong máu có liên quan đến tần suất và ty 1é tit vong do VXDM, bénh mạch vành và nhồi máu cơ
tìm [43] Khoa học cũng chứng minh rằng, có sự liên quan giữa hoạt động của gốc tự do với bệnh
nguyên và bệnh sinh của nhiều trạng thái bệnh lý, trong đó có VXĐM [41,46,861]
Do nhiều nguyên nhân khác nhau mà con người có khả năng chịu tác động của bức xạ ion
hoá Phóng xạ có thể là tia œ, B, y nhưng chủ yếu là tia X Chất phóng xạ có liên quan đến nhiều
trạng thái bệnh lý như: bệnh ung thư, bệnh di truyền mà trước đây ít gặp nhưng hiện nay có xu hướng tăng nhanh, ảnh hưởng rất rõ rệt đến khả năng lao động, đến chất lượng cuộc sống và tuổi
thọ :
Ngày nay, nhiều chất có hoạt tính sinh học đã được phát hiện va tách chiết từ các nguồn cây cỏ
tự nhiên Nhiều cây cỏ là những dược liệu quý có tác dụng tốt trong việc nâng cao sức khoẻ, nâng
cao tuổi thọ cho con người như: nhân sâm, tam thất, linh chi,.v.v và gần đây chè xanh cũng được
nhiều nhà khoa học đề cập và nghiên cứu
Trang 91 Nghiên cứu áp dụng qui trình chiết xuất polyphenol từ lá chè xanh và xác định thành
phần bột chiết xuất của một giống chè xanh ở miền Trung du, miền Bắc Việt Nam
2 Đánh giá tác dụng của bột polyphenol chè xanh (BPPCX) Việt Nam trên rối loạn
` chuyển hoá lpid ở thỏ uống Cholesterol, bao gồm :
+Tác dụng trên sự biến đổi các chỉ số lipid huyết tương và mô bệnh học thành động mạch
+Tìm liêu thích hợp của BPPCX có tác dụng cải thiện những chỉ số lipid huyết tương và
hình ảnh tổn thương mô bệnh học thành động mạch 3 Đánh giá tác dụng bảo vệ của BPPCX' trên thỏ bị chiếu xạ
+ Tác dụng của BPPCX đến sự thay đổi một số chỉ số máu (hông cầu, bạch câu, hemoglobin,
Trang 103 Chương 1
TONG QUAN TAI LIEU
1 Chè xanh và tác dụng sinh học của chè xanh:
1.1 Chè xanh và một số đặc tính của chè xanh:
Cây chè xanh, có tên khoa học là Camelia sinensis O Kuntze, có nguồn gốc từ Trung
Quốc, Ấn Độ, Myanmar Cây chè thích hợp với khí hậu nóng ẩm vùng cận nhiệt đới, được trồng rộng rãi từ vùng khí hậu nhiệt đới tới vùng có khí hậu ôn đới ở châu Á [16, 17, 35, 56, 57] Từ
xưa, nhiều nhà y học Trung Quốc nhận thấy nước chè giúp tiêu hoá thức ăn có nhiều chất béo, uống nước chè vào mùa hè tạo nên cảm giác khoan khoái để chịu, nước chè đặc uống vào buổi
sáng làm sạch miệng và minh mẫn tinh thần, nước chè có tác dụng giữ cho vóc dáng thon tha,
giảm béo, giảm viêm, giải độc, lợi tiểu Chè có mặt trong một số bài thuốc đông y của Trung
Quốc dùng để chữa kiết ly, mưng mủ Trong 8 thế kỷ gần đây, chè xanh được chuyển từ Trung
Quốc đến Nhật Bản để dùng làm thuốc chữa bệnh Ngày nay người Nhật gọi chè là thứ nước
uống của thời đại nguyên tử do khả năng hấp thụ và thải chất phóng xạ [27, 99] Như vậy, cây
chè đã trở nên gần gũi với cuộc sống của con người từ thời xa xưa trong lịch sử loài người Đầu tiên con người dùng lá chè để làm thuốc chữa bệnh; sau đó nhờ hương vị đặc trưng riêng, lá chè trở thành thứ đồ uống được ưa chuộng ở rất nhiều nước trên thế giới Hiện nay, cây chè được trồng ở hơn 20 nước thuộc châu Á, châu Phí và Nam Mỹ [55, 67,109] Ở Việt Nam, cây chè xanh
được trồng rộng rãi ở khắp mọi miền, được sử dụng như một thứ đồ uống thông dụng ở nhiều gia đình và đã được xuất khẩu đi nhiều nước trên thế giới [8]
Đo những đặc tính ưu việt trên, cây chè được con người quan tâm nghiên cứu trong nhiều
thế kỷ qua về đặc điểm hình thái, phương thức canh tác, cách chế biến,cũng như về thành phần
hoá học, khả năng hấp thu và các tác đụng dược lý [109]
Chè xanh có 2 loai C assamica va C sinensis [16, 17, 56] + Camellia assamica: 14 to (16-19 cm x 7-9 cm),thân cao
+ Camellia sinensis: 14 nhd (5,5-6,5 cm x 2,2-2,4 cm), thân là loại cây bụi rậm
Các nhà khoa học đã xác định được nhiễm sắc thể của hai loài chè trên là giống nhau
(2n=30) [56, 67, 68] Vì vậy việc lai tao để có nhiều giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt
đã được thực hiện [42, 69} Việt Nam có nhiều giống chè; phù hợp với điều kiện khí hậu, đất đai canh tác của từng vùng [8, 42] Chè xanh thu hái vào buổi sáng được đánh giá là có chất lượng tốt
Trang 11Chè xanh thu hái về thường được chế biến trước khi sử dụng Sự chuyển biến thành tanin trong lá chè không xảy ra dưới tác dụng của vi sinh vật mà được thực hiện với sự có mặt của các enzym polyphenol oxidase có trong lá chè Dựa vào mức độ lên men dưới tác dụng của các
enzym, chè được phân loại thành : Chè không lên men (chè xanh ), chè lên men chưa hoàn toàn (chè 0- long) và chè lên men hỗn tồn (chè đen) [99]
Vì vậy trong trường hợp chế biến chè xanh, lá chè tươi sau khi thu hái được hấp hoặc nấu ngay ở 90°C -100°C để các enzym chứa đựng trong lá chè đặc biệt là polyphenoloxidase mất hoạt
tinh [66, 99]
Lá chè chứa nhiều các thành phần hoá học bao gồm : Polyphenol, cafein, protein, acid amin, carbonhydrate, vitamin và các yếu tố vi lượng trong đó thành phần chiếm tỷ lệ nhiều nhất
là carbonhydrate (bao gồm cả cellulose, amylose) và protein - hầu như không tan trong nước
nóng Các thành phần có trọng lượng tương đối nhỏ hoà tan được trong nước nóng tạo nên hương
vị thơm ngon của nước chè là polyphenol, cafein và một số acid amin, tỷ lệ các thành phần này ảnh hưởng sâu sắc đến hương vị của nước chè [16, 17, 57]
Một thành phần quan trọng của lá chè xanh là polyphenol, chiếm khoảng 6- 16% trọng lượng khô của lá chè, chất này được chiết xuất khi ngâm chè trong nước nóng hoặc chiết xuất với
ethylacetate [99]
Polyphenol chè có vị đắng và hơi chua, hấp thu qua niêm mạc ruột non một cách dễ dàng Trong vòng 60 phút sau khi uống chè xanh, người ta đã có thể âm thấy polyphenol của chè trong máu và nồng độ polyphenol chè trong máu đạt mức cao nhất khoảng 1- 2 giờ sau đó Các công trình nghiên cứu về polyphenol chè chưa phát hiện thấy bất cứ dấu hiệu độc nào của chúng
Polyphenol trong chè xanh gồm có catechin và các dẫn xuất của nó, hàm lượng của các loại catechin này khác nhau ở các loại chè và mùa thu hoạch Thành phần của polyphenol chè như sau: * (+)- Catechin [(+)-C)] * (-)- Epicatechin [(-)-EC] * (+)- Gallocatechin [(+)- GC] *(-)- Epigallocatechin [(-)- EGC] * (-)- Epicatechin gallate [(-)- Ecg] * (-) - Gallocatechine gallate [(-)- GCg] * (-) - Epigallocatechin gallate [(-)- EGCg]
Trang 12Sano và cộng sự nghiên cứu trên chuột cho thấy ở nhóm chuột được uống polyphenol
chè, mức độ peroxi hoá lipid trong huyết thanh và ở tổ chức đều thấp hơn một cách có ý nghĩa so
với nhóm chứng [91, 106] Nhiều nghiên cứu khác chứng minh rằng polyphenol chè hạn chế sự
peroxi hoá lipid ở màng hồng cầu và- huyết thanh của động vật thí nghiệm [53, 60] Polyphenol
được đánh giá là có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn œ- Tocopherol và trong các loại catechin,
EGCp có tác dụng chống oxy hoá mạnh nhất, tiếp theo là ECg, EGC, EC {47, 77]
Một số nghiên cứu trên chất chiết thô hoặc các thành phần của chè xanh và chè đen đã chứng minh được tác dụng ngăn cản sự oxy hoá và đột biến gen [90, 103, 110] EGCg chè xanh
đã ngăn cản sự phát sinh và tiến triển của các ung thư qua các thử nghiệm trên động vật [59, 62, 80, 114, 115] Tác dụng phòng chống bệnh tim mạch của chè xanh cũng được nghiên cứu trên động vật [55, 70] Sự hấp thu chất chiết chè xanh ở chuột đã làm giảm một cách có ý nghĩa nồng
độ cholesterol, giảm tỷ lệ VLDL- C và LDL-.C/HDL- C trong huyết thanh [2, 55, 113] Chè xanh
ngăn cẩn tế bào nội mạc động mạch oxy hoá LDL, [74] Sự tăng mức tiêu thụ chè xanh sẽ làm giảm nồng độ TC, TG, VLDL- C, LDL- C và làm tăng nồng độ HDL- C huyết thanh, tăng mức tiêu thụ chè xanh cũng làm giảm hàm lượng lipid peroxid huyết thanh cả ở người [82] và chuột
1001
Tác dụng thu dọn gốc tự do của polyphenol chè xanh đã được nhiều nhà khoa học đề cập
và quan tâm [97, 119] Cơ chế chống hoạt động của gốc tự do của các catechin chè là cơ chế chống oxy hoá chung của các polyphenol, bởi lẽ khi kết hợp với gốc tự do các catechin chuyển từ
dạng khử sang dạng oxy hoá và đồng thời làm mất hoạt tính của các gốc tự do này [23, 41, 57, 74, 81, 85, 90]
Polyphenol chè xanh được sử dụng rộng rãi như một chất chống oxy hoá tự nhiên để
phòng ngừa sự oxy hoá của dầu ăn hoặc sự mất màu của thức ăn có màu đỏ Người ta cũng tìm
thấy nhiều đặc tính có lợi của polyphenol chè có thể được áp dụng trong y học như ngăn cản sự
đột biến của vi khuẩn, ngăn cản quá trình sao chép ngược của HIV, tác dụng chống sâu răng, hoạt
động chống virus, tác dụng phòng bệnh ung thư [47, 54, 59, 75, 77, 80, 97, 104, 105]
Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về chè xanh và polyphenol chè xanh, Nguyễn Liêm và cộng sự nghiên cứu ín vitro vé tac dung chống oxy hoá của một số cây thuốc Việt Nam thấy tác dụng chống oxy hoá của chè xanh là cao hơn lá chè khô, lá chay, hà thủ ô [27] Nguyễn
Thanh Dương và cộng sự đã xác định được tác dụng chống phóng xạ và làm giảm cholesterol máu của chè xanh ở chuột thực nghiệm [12]
Tuy nhiên, vẫn còn có những kết quả nghiên cứu chưa thống nhất về tác dụng phòng
Trang 13quan giữa mức tiêu thụ chè xanh với nồng độ lipid máu và các tác dụng hữu ích khác của polyphenol chè xanh cần được xác minh rõ ràng hơn
2 Lipid va lipoprotein mau: 2.1 Lipid mau:
Thanh phan lipid trong "máu tuần hoàn (ipid toàn phần của máu) bao gồm cholesterol
toàn phần (TC) (trong đó có cholesterol tự do (FC) và cholesterol este (CE)), triglycerid (TG), phospholipid và acid bếo tự do Các lipid đều không tan trong nước, để được lưu hành trong máu
chúng phải kết hợp với protein đặc hiệu tạo thành phúc hợp gọi là lipoprotein (LP) Nói cách khác, LP là dạng vận chuyển lipid từ nơi này đến nơi khác trong cơ thể nhờ sự chuyển động của dòng máu [19, 107]
2.2 Thành phần và cấu trúc của lipoprotein:
Lipoprotein là những phân tử hình cầu gồm phần nhân và phần vỏ (Hình 1.1) Ong, vn Apoprotein ———» dS = Phospholipid ———>s_ C2 Cholesterol tudo —»%, w On s% 0 ale e() aw ws ay Out aly CE = Cholesterol este TG = Triglycerid
Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc của lipoprotein - Phần nhân ở trung tâm, chứa triglycerid và cholesterol este hoá
- Phần vỏ được cấu tạo bởi các phân tử phospholipid, cholesterol tự đo và các apoprotein
Phần vỏ đảm bảo tính tan của lipoprotein trong huyết tương, có tác dung vận chuyển các lipid
không tan {43, 107]
2.3 Phân loại lipoprotein:
Việc phân loại LP huyết tương có thể dựa trên hai phương pháp : điện di hoặc siêu ly tâm
Bằng phương pháp điện di, LP huyết tương tách thành 4 thành phần là œLP, B LP, tiền B
LP va chylomicron (CM) Tuy nhiên phân loại theo cách này chỉ mang tính lịch sử, không còn
Trang 14- Chylomicron: được tổng hợp từ ruột non, sau đó được vận chuyển trong máu tới các mao
mach ở mô mỡ, tại đây triglycerid được phân giải thành glycerol và acid béo Chylomicron chỉ có
mặt trong thời gian rất ngắn ở huyết tương (gây ra màu đục, trắng như sữa) Chylomicron mất dần triglycerid gọi là chylomicron tàn dư, được thanh thải rất nhanh ở gan
- Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (very low density lipoprotein - VLDL): được tổng hợp ở
gan Triglycerid cha VLDL duoc phân giải ở các tổ chức ngoại vi, làm cho VLDL nhỏ dần Khoảng một nửa VLDL chuyển hoá thành LDL, phần còn lại được thanh thải trực tiếp tại gan
Lipoprotein ty trong trung gian (intermediate density lipoprotein - IDL) : (hay VLDL tan dư) là sản phẩm chuyển hoá của VLDL và là chất tiền thân của LDL, có hàm lượng rất thấp trong
huyết tương
- lipoprotein tỷ trọng thấp (low density lipoprotein - LDL) : là chất chuyên chở 70%
cholesterol trong huyết tương tới các tế bào ngoại biên Xấp xỉ 75% LDL được hấp thu theo
đường thụ thể LDL ở tế bào gan và tế bào ngoài gan Phần còn lại của LDL được thanh thải ở các
đại thực bào và một số tế bào khác Khi LDL bị thay đổi thành phần hoá học và cấu trúc sẽ tạo thành LDL dạng nhỏ và đặc; lúc đó các đại thực bào là nơi thu nạp chúng không giới hạn, tạo
thành những tế bào bọt và là một trong những yếu tố thúc đẩy quá trình gây VXĐM
- Lipoprotein ty trong cao (high density lipoprotein - HDL): gồm có 2 nhóm chính (HDL2, HDL3) và nhóm phụ (HDLI), HDL vận chuyển cholesterol dư thừa từ tế bào tới gan hoặc tới những tế bào cần cholesterol Khoảng 50% HDL được thanh thải tại gan theo con đường
VLDL tàn dư, HDLI được hấp thu trực tiếp bởi thụ thể LDL
2.4 Apoprotein:
Các apoprotein (apo) là thành phần quan trọng trong cấu trúc của LP Sự phát hiện ra apo đã giúp hiểu biết hơn về chuyển hoá của LP và cơ chế bệnh sinh của hội chứng tăng lipid máu
{40] Trong quá trình chuyển hoá lipid, các apo có một số chức năng: (1) Nhận biết các thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào; (2) Điều hoà- nghĩa là các apo có thể hoặc hoạt hoá hoặc ức chế hoạt động của một số enzym; (3) Giúp các LP được vận chuyển trong máu và bạch huyết Cần chú ý
rằng khi tính hoà tan của LP bị rối loạn hoặc sự vận chuyển của chúng bị chậm trễ sẽ dân đến
tình trạng ứ đọng các phân tử có chứa nhiều lipid, gây ra tình trạng ứ đọng mỡ - một trong những
yéu t6 gay VXDM [43, 86, 87]
Apo có nhiều loại và phân bố khác nhau trong các LP khác nhau Những apo tham gia chủ
yếu vào chuyển hoá lipid gồm:
* Apo A: là một thành phần của bề mặt HDL, có chủ yếu trong phân tử HDL mới sinh
(được tổng hợp ở gan)
Trang 15- Apo AI: tham gia cấu trúc HDL.2 (một phân đoạn của HDL, có khả năng bảo vệ động
mạch khỏi các tổn thương xơ vữa)- chức năng chưa được sáng tỏ hoàn toàn
* Apo B: là chất nhận diện các thụ thể màng tế bào đối với LDL và có nhiệm vụ đưa LDL
vào trong tế bào để cung cấp cholesterol cho mọi hoạt động của tế bào
Apo B, cholesterol cùng với VLDL và LDL là những yếu tố gây VXÐĐM Cũng như apo A, apo B cũng có nhiều phân lớp với những tác dụng khác nhau, đáng lưu ý 1a apo B100, Apo B-48
* Apo C: có trong thành phần của VLDL, IDL, HDL Apo C có nhiệm vụ hoạt hoá LCAT
Apo CH hoạt hoá enzym lipoprotein lipase (LPL) để thuy phan triglycerid cha chylomicron và VLDL, Apo CIH ức chế LPL
*Apo E: là thành phần cấu trúc của chylomicron, VLDL, IDL, HDLI Trong chuyển hoá
lipid, apo E có nhiệm vụ gắn với thụ thể LDL ở trên màng tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ LP [46, 45] Bang 1.1: Ty trong va thanh phan cua cac lipoprotein trong máu Ty trong FC CE TG Phospholipid Apo % | % | % ` Loại Tỷ lệ % Chylomicron | <0,960 05-1] 1-3 | 86-94 3-8 A,B,C.E 1-2 VLDL 0,960- 1,006 | 6g | 12-14 | 55-65 12-18 B, C,E 5-10 IDL 1,016-1,019 | 7.9 | 97.33 | 15-27 | 19-23 B,C,E 15-19 LDL 1012-1063 | 519 | 35-40 | 812 | 20-25 B 20- 24 HDL 1063-1210 | 3.5 | 14.18] 3-6 20- 30 A,E 45- 50
2.5 Chuyển hoá lipoprotein:
Chuyển hoá của lipid lưu hành đã được biết rõ, bao gồm 2 con đường: chuyển hoá lipid ngoại sinh và chuyển hoá lipid nội sinh (Hình 1.2)
- Chuyển hoá lipid ngoại sinh:
Con đường này liên quan đến lipid do thức ăn đưa vào Sau khi ăn thức ăn chứa nhiều mỡ, các TG, cholesterol, phospholipid từ thức ăn hấp thu qua niêm mạc ruột non được chuyển thành
chylomicron - ChyÌlomicron theo máu tới mô mỡ và cơ, tại đó các TG được tách ra nhờ enzym
lipoprotein lipase thành glycerol và acid béo Các acid béo được dự trữ hoặc được cơ sử dụng làm
Trang 16trong thành phần chyÏomicron tàn dư Đời sống của chylomicron rất ngắn, chỉ vài phúi Ở gan,
cholesterol được chuyển thành acid mật và đào thải theo đường mật xuống ruột non, một phần
cholesterol và TG tham gia tạo VLDL VLDL này rời gan vào hệ tuần hoàn để bắt đầu con đường
vận chuyển hay chuyển hoá lipid nội sinh (còn gọi là chuyển hoá lipid ở mạch máu)
- Chuyển hoá lipid néi sinh:
Con đường này liên quan đến lipid chủ yếu có nguồn gốc từ gan VLDL giàu TG được tạo
thành ở gan (90%) và một phần ở ruột (10%) vào máu đến các mô ngoại vi và tại đó, TG bị tách ra do tác dụng của enzym lipoprotein lipase, đồng thời apo C cũng được chuyển sang HDL, chỉ
còn lại apo B-100 và apo-E Enzym LCAC từ gan vào huyết tương có tác dụng este hoá phân tử
cholesterol của VLDL thành cholesterol este Như vậy, sau khi giải phóng các TG, nhận thêm cholesterol este và mất đi apo C, VLDL chuyển thành IDL - là tiên chat cha LDL LCAT tao ra
75 — 90% cholesterol este trong huyết tương, phần còn lại của cholesterol este trong huyết tương
là do gan hoặc ruột sản xuất nhờ enzym ACAT của gan hoặc ruột Do vậy, sự thiếu hụt LCAT
gây rối loạn chuyển hoá LP
Các IDL trở lại gan, gắn vào các thụ thể đặc hiệu ( apo B, E ) ở màng tế bào và chịu tác
dụng của enzym lipase gan Các IDL cũng bị chuyển hoá thành LDL (cùng với sự biến mất của apo E ) Các LDL sẽ gắn vào thụ thể apo B, E ở màng tế bào gan ( 70% các thụ thể LDL ở gan ) và ở màng tế bào khác của cơ thể Các LDL được chuyển vào trong tế bào, rồi chịu tác dụng các enzym protease phan huỷ LDL thành các acid amin, cholesterol este , rồi sau đó cholesterol
este chuyển thành cholesterol tự do Cholesterol tự do có 3 tác dụng cơ bản là [43, 107].:
+ Làm giảm hoat déng cha HMG CoA reductase (hydroxy- methyl - glutaryl coenzym A
reductase), tic chế sự tổng hợp cholesterol trong tế bào
+Hoạt hoá enzym ACAT (acyl coenzym A - cholesterol - acyl - transferase) chuyén cholesterol tu do thanh cholesterol este
+ Lầm giảm số lượng thụ thể LDL ở màng tế bào qua con đường feed- back âm tính Những tác dụng trên đã tạo nên quá trình điều hoà giữa sự tổng hợp cholesterol từ các
acetyl CoA trong té bao va su xuyên thấm (hiện tượng nội nhập thực bào) của LDL vào trong tế
bào và bị phân huỷ trong lysosom
Bình thường, LDL được phân huỷ trong tế bào nhờ các thụ thể của nó ở màng tế bào ( thụ
Trang 17Tóm lại, LDL giữ vai trò chính trong sự vận chuyển cholesterol đến các tế bào gan và tế bào mô ngoại VI
ĐƯỜNG NGOẠI SINH ĐƯỜNG NỘI SINH
CholesteroÌ a cig nat on vao + 1 terol Choleste > Đại thực bảo a’ Thy thé LDL | c«* mốt | Le Gan x Thụ thể LDL Thụ “ chốt| dư —Eo¢ B48 E B48 B100 fi Mao mach | Ỉ [em Mao Fj Huyết tương LPL LPL LCAT Ar]
Hinh1.2: Chuyén hod lipoprotein mau
(AI, B48, B100, C, E viết tắt cia ApoAl, ApoB48, ApoB100, ApoC, ApoE)
HDL được tổng hợp tại gan (HDL mới sinh) hoặc từ sự thoái hoá của VLDL và
chylomicron trong tuần hoàn ngoại biên Trong tuần hoàn, các HDL được làm giàu thêm bởi các
apo AI từ chylomicron và cũng được làm giàu thêm bởi cholesterol tự đo từ bề mặt màng các tế bào trong cơ thể Sau khi LCAT biến cholesterol tự do thành cholesterol este, cholesterol este này
thâm nhập vào bên trong HDL và HDL là LP cấu trúc hình cầu bao gồm một nhân giầu
cholesterol este và một lớp vỏ chứa phospholipid có cực và các apoprotein, trong khi đó apo E được vận chuyển cho VLDL (tạo nên HDL- 3 rồi đến HDL- 2) HDL- 2 là chất chống VXĐÐM
quan trọng nhất vì người ta thấy tỷ lệ của chúng tương quan nghịch với tỷ lệ mắc bệnh và tý lệ tử vong của bệnh mạch vành trong nhiều nghiên cứu dịch tễ học
HDL cé vai trd thiết yếu trong chuyển hoá của LP vì :
+ Thanh lọc các LP giầu TGŒ ( chylomicron, VLDL) bằng cách nhường cho chúng các apo CII, apo CII can thiét cho su hoat hod enzym lipoprotein lipase ngoai gan
+ Este hoá cholesterol bởi vì HDL là cơ chất ưa thích của LCATT
Trang 18+ Chuyển hoá cholesterol ở tế bào bằng cách cho phép cholesterol tự do từ các mô ngoại vi trở về gan, nơi gần như độc nhất thoái hoá cholesterol tự do - là quá trình vận chuyển ngược
cholesterol trở về
Như vậy, trong quá trình chuyển hoá LP Mật là hình thức thoái biến cholesterol Mật được tiết ra liên tục tích trữ vào Trong tút mật và được đổ vào ruột non trong bữa ăn, có nhiệm vụ làm nhũ tương hoá lipid và cũng được tái hấp thu qua ruột non (80- 90%), đó là chu kỳ gan ruột
Cholesterol có thể được tổng hợp ở tế bào gan tir acetat, enzym HMG CoA reductase diéu chinh
sự tổng hợp này Nếu cholesterol trong tế bào ft, thu cam LDL cha té bao bat giữ LDL lưu thông Nếu cholesterol dư thừa, HMG CoA reductase bị ức chế hoạt động, sự tổng hợp cholesterol giảm
và hoạt hoá enzym ACAT este hoá cholesterol thành cholesterol este ít độc hại hơn cho tế bào;
mặt khác cholesterol ức chế sự tổng hợp thụ cảm LDL để giới hạn sự bất giữ LDL Nhờ các cơ chế trên, nên ở người bình thường, quá trình tổng hợp và thoái hoá lipid diễn ra cân bằng nhau và phụ thuộc vào như cầu cơ thể, sự ổn định về hàm lượng lipid và LP trong máu được duy trì Khi
cơ thể không có đủ khả năng điều chỉnh trước những biến động về Hpid, các kiểu rối loạn chuyển
hod lipid sé xay ra [43, 107]
2.6 Rối loạn chuyển hoá lipid máu:
* Phân loại của De Gennes theo các thành phần lipid máu [13]24]:
+ Tăng cholesterol đơn thuần:
Cholesterol huyết thanh tăng > 5,2 mmol/l, TG bình thường hoặc tăng nhẹ Tỷ lệ cholesterol / TG > 2,5 Cholesterol tăng > 6,7 mmol/l thường do tang LDL, nhưng HDL tăng cũng có thể làm tăng nhẹ cholesterol
+ Tăng triglycerid:
Cholesterol có thể tăng nhẹ TG tăng rất cao Khi TG máu >1 1,5 mmol/l thi chylomicron luôn có mặt trong huyết tương Các rối loạn tiên phát cũng tăng LP giàu TG như VLDL hoặc chylomicron hoặc cả hai dạng (hai loại này đều chứa cholesterol tự do ở vỏ và cholesterol este ở
lõi), do vậy cholesterol toàn phần có thể hơi tăng (chiếm 8- 25% hàm lượng TG) Tỷ lệ
TG/cholesterol > 2,5 Trên lâm sàng hội chứng này ít gặp
+ Tăng lipid máu hỗn hợp:
Cholesterol tang via phai, TG tang nhiéu hon Ty lé cholesterol/TG < 2,5 Nguyên nhân có thể do tăng VLDL chứa nhiều TG và LDL chứa nhiêu cholesterol, hoặc tăng VLDL tàn dư và chylomicron tàn dư Do đó trong huyết thanh hàm lượng cholesterol và triglycerid gần bằng nhau
*Phan loai cia Fredrickson và phân loại quốc tế theo thành phần LP máu:
Trang 19đó, người ta để nghị tách typ II ra thành typ Ha và typ IIb Bảng phân loại này trở thành bảng
phân loại quốc tế từ năm 1970 [14]
Bang 1.2: Phan loai cac typ réi loan lipoprotein máu (theo Fredrickson) Typ I 1 IIb I _— ‡ 7 + ‘ +1 ‡ BT/ + + Triglycerid hee BT + “ 4 m Lipoprotein LDL |, LDL VLDL VLDL+ CM tom † upu to f f Vv
Chú thích: BT = bình thường +t = tăng trung bình † = tăng nhẹ H+ = tăng cao
Theo Turpin[8]: 99% các hội chứng rối loạn lipoprotein máu nằm trong 3 typ: Ia, Hb va IV 99% các trường hợp rối loạn lipoprotein máu đều gây VXĐM với các typ Ha, Ib, II, IV va
không gặp ở typ L
2.7 Rối loạn chuyển hoá lipoprotein và bệnh vữa xơ động mạch:
Có nhiều yếu tố nguy cơ gây nên VXĐM : rối loạn chuyển hoá lipid, tăng huyết áp, đái tháo đường, béo phì Trong các yếu tố trên thì rối loạn chuyển hoá lipid đóng vai trò chủ yếu,
trong đó cholesterol là thủ phạm chính gây nên VXĐM [21, 25, 48]
VXDM là bệnh của thành mạch VXÐM xuất hiện trên bể mặt động mạch do rối loạn
thâm nhập của lipid, va làm thay đổi cấu trúc của thành động mạch Ở thành động mạch, tất cá những phân tử lớn có một ái lực mạnh với một số thành phần của lipoprotein lưu thông, nhất là
Với este của cholesterol (thành phần có nhiều trong LDL) Các đại thực bào và các tế bào cơ trơn tiếp xúc với LDL, là loại lipoprotein mang nhiều cholesterol, chúng có các thụ cảm tiếp nhận LDL LDL tăng nhiều và tồn tại lâu trong máu có thể bị oxy hoá, các gốc tự do được giải phóng
bởi tế bào nội mạc và lớp đại thực bào không những làm biến đổi LDL, mà còn làm thay đổi tính
chất màng tế bào Các “LDL biến đổi” này khi tiếp xúc với tế bào nội mạc sẽ không được thu nhận nữa, trừ các đại thực bào và các tế bào cơ trơn thành mạch, vì những tế bào này có các thụ thể đặc hiệu cho “LDL biến đổi” nhưng lại không có khả năng tự điểu hoà cholesterol nên thu
nhận tất cả những “ LDL biến đổi” và trở thành các tế bào bọt, tốn thương sớm của VXĐM, và là
Trang 20cộm dày, nham nhở lòng mạch, từ đó làm tăng sự kết tụ tiểu cầu và sự rối loạn huyết động, dẫn đến sự dày lên, xơ cứng gây hẹp lòng mạch là điều không thể tránh khỏi, các hậu quả xa hơn là
nhồi máu cơ tim hoặc tai biến mạch máu não [21, 45, 46, 48,86, 87]
Để đánh giá mức độ tổn thương xơ mỡ động mạch, năm 1972 WHO đã có bảng phân độ
như sau [4, 5]: -
- Độ 0: Các tổn thương xơ mỡ ở giai đoạn đầu, giai đoạn này có sự lắng đọng các hạt mỡ ở lớp áo trong chưa nổi rõ trên bể mặt nội mạc động mạch, không thấy tổn thương bằng mắt
thường
- Độ I: Những tổn thương xơ mỡ bắt đầu hình thành những chấm hoặc những vạch mảnh,
màu vàng đục, hiện rõ trên bề mặt nội mạc động mạch, có thể kết hợp thành từng mảng nhỏ ~ Độ II: Tổn thương hình thành những mảng xơ vữa lớn, nổi cao trên mặt động mạch,
vùng tổn thương có màu trắng đục hay màu trắng vàng
- Độ HI: Gồm những tổn thương phức tạp : loét, chảy máu, hoại tử hoặc huyết khối, có thể kèm theo calci hoá ở vùng trung tâm hoại tử
- Độ IV: Thành động mạch calci hố, đơi khi xương hoá làm vách động mạch rất cứng
2.8 Phòng và điều trị hội chứng tăng lipid máu:
Bình thường lipid là một trong những chất rất cần thiết đối với sự sống con người Tuy
nhiên, sự rối loạn tăng lipid máu xuất hiện, dù chưa có biểu hiện lâm sàng thì vẫn không được
phép coi thường và bỏ qua vì đó là nguy cơ tiểm ấn của VXĐM có thể dẫn đến những tai biến
nguy hiểm Mục tiêu điều trị ở người có rối loạn lipid máu là điều chỉnh các các chỉ số lipid mau,
giảm số phân tử LDL oxy hoá, giảm sự xâm nhập của lipid vào các mảng vữa xơ, hạn chế sự tiến
triển của mảng VXĐÐM, và từ đó giảm các nguy cơ của các tai biến mạch máu phức tạp của nó (25, 45]
Trên cơ sở những hiểu biết về LP và chuyển hoá LP, người ta đã tìm ra nhiều loại thuốc
để điều trị các rối loạn lipid máu Cholesterol và TG là 2 thành phần phổ biến bị rối loạn trong
hội chứng tăng lipid máu, nên xu hướng hiện nay là tìm các thuốc có tác dụng giảm 2 thành phần này, thuốc phải dùng được lâu đài và kèm theo là điều chỉnh chế độ ăn hợp lý, nhằm chống các yếu tố nguy cơ Cơ chế tác dụng của thuốc là : giảm hấp thu cholesterol và acid mật ở ruột non, ức chế HMG CoA Reductase, làm giảm LDL và tăng tổng hợp HDL ở gan, ngoài ra còn có tác
dụng chống quá trình oxy hoá các thành phần của lipid
Các thuốc tổng hợp hoá học hiện nay, tuy có tác dụng điều trị tốt song cũng còn có nhiều
Trang 213 Gốc tự do và các chất chống oxy hoá:
3.1 Các đạng oxy hoạt động trong cơ thể:
Các gốc tự do luôn được sản sinh trong các hoạt động sinh lý của cơ thể sống Nguồn sinh
gốc tự do gắn liền với chuyển hoá tế.bào như : các phản ứng oxy hoá khử của tế bào trong quá trình thực bào, trong các phản ứng khử độc của cơ thể bằng phản ứng oxy hoá, đặc biệt trong quá trình hô hấp tế bào Ngoài ra gốc tự đo còn được hình thành trong cơ thể do các tác nhân của môi
trường Anion superoxid (O, * được tạo nên trong quá trình hô hấp tế bào là gốc tự do đầu tiên, nó sẽ sinh ra hàng loạt chất như hydrogen peroxid (H,O;), gốc hydroxyl (HO*), oxy đơn bội CO;), gốc peroxy (LOO” ) và các gốc tự do khác Chúng được gọi là các dạng oxy hoạt động và
có liên quan đến nhiều quá trình bệnh lý của con người [2, 3, 19, 20, 41, 50, 65]
!O;, H;O;, HO” là những chất độc với tế bào vì chúng sẽ tấn công các acid béo khơng bão hồ có trong lipid màng tế bào, gây nên sự biến đổi của cấu trúc màng và những phân tử DNA
'O;, HO” có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại, chúng là thủ phạm chính gây peroxi hoá
lipid màng, một gốc HO” sẽ oxy hoá hàng trăm phân tử acid béo khơng bão hồ nhiều nối đôi
theo cơ chế dây truyền trước khi bị dập tắt [3, 19, 20]
3.2 Quá trình peroxi hoá lipid [1, 8,9,10,11, 22, 26] :
Quá trình peroxi hoá lipid (POL) xuất hiện theo cơ chế phan ứng gốc tự do xảy ra theo 3 giai đoạn liên tiếp nhưng riêng biệt (khơi mào, lan truyền, dập tất) Điều kiện thích hợp cho POL là phân tử acid béo không bão hoà có nhiều nối đôi được cung cấp nhiều oxy, sự có mặt ion kim
loại chuyển tiếp Cu 2+, Fe 2+
Gốc HO", 'O,, dạng proton của O, "là HO;` và các phức hợp khác nhau của oxy với sắt có khả năng khơi mào quá trình POL, hình thành các gốc peroxyl Gốc peroxyl này có khả năng lấy đi H từ một phân tử acid béo khác và gốc alkyl mới tạo nên có thể tác dụng với O; sinh ra gốc peroxyl khác và như thế phản ứng đây truyền được nhân lên mãi Gốc peroxyl đã được kết hợp
với nguyên tử H có hai số phận : hoặc tạo ra lipidhydroperoxid, hoặc tạo ra endoperoxid
Hydroperoxid hữu cơ (LOOH) có thể bị phân huỷ bởi các ion kim loại chuyển tiếp và
sinh ra các sản phẩm trung gian có hoạt tính thứ cấp cho quá trình peroxi hoá
Sự chia cắt các liên kết trong endoperoxid dẫn đến sự hình thành hoặc là malonyl dialdehyd (MDA), hoặc là pentan Như vậy MDA và pentan là những sản phẩm của quá trình peroxi hoá lipid
Trang 22hydroperoxid cholesterin- một trong những chất cần thiết để tạo thành các hormon steroid Khi quá trình peroxi hoá lipid xảy ra mạnh và kéo dài, ở màng tế bào xuất hiện những đám phân tử
lipoperoxid, đó chính là những đường thân nước qua màng, làm thay đối tính thấm của màng Hiện nay người ta thấy quá trình peroxi hoá lipid là nguyên nhân của nhiều bệnh : bệnh
phóng xạ, nhồi máu cơ tim, vữa xơ động mạch (VXĐM), thiểu năng động mạch vành, bệnh ung thư Sản phẩm của quá trình peroxi hoá liên quan đến sự tích tụ các polyme sinh học không có
hoạt tính và sự hư hại DNA của tế bào Sản phẩm cuối cùng quá trình peroxi hoá lipid là MDA có thể gây ra sự nối chéo DNA trong các nhiễm sắc thể Người ta đã tìm thấy mối liên quan giữa tốc
độ của quá trình peroxi hoá lipid với tốc độ phân chia tế bào - cơ sở để nghiên cứu vẻ những yếu
tố khởi động của quá trình sinh ung thư
3.3 Các phương pháp xác định quá trình peroxi hoá lipid
Tốc độ của quá trình POL nói chung có quan hệ đồng biến với các sản phẩm hình thành ở
từng giai đoạn của quá trình POL tạo ra như : - Lượng các dien liên hợp
- Lượng các gốc tự do (L`, LO’, LOO’ )
- Các sản phẩm như MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric ~ Các khí etan, pentan được giải phóng
Như vậy đo những sản phẩm này người ta có thể đánh giá được quá trình POL, có thể nêu một số phương pháp thường được đề cập khi nghiên cứu quá trình POL như sau:
* Xác định các đien liên hợp:
Các dien liên hợp là những sản phẩm được tạo ra ở giai đoạn đầu của quá trình POL Các
dien này có trong cấu trúc cả của L°, LO”, LOO” và LOOH, chúng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 230- 240 nm Nhưng vì các gốc L°, LO’, LOO’ it bén, nén kết quả của phép đo chủ yếu phụ
thuộc vào LOOH Phương pháp này thực hiện đơn giản, song phép đo không đặc hiệu vì trong dịch chiết lipid còn có nhiều chất có thể bị hấp thụ ở bước sóng này Đó là lý do người ta coi đây
là phép đo thô những sản phẩm đầu tiên của quá trình POL
*Phát hiện gốc tự do tạo ra trong quá trình POL:
Phương pháp kinh điển để phát hiện ra các gốc tự do là phương pháp cộng hưởng từ điện tử Do đặc điểm của thiết bị, người ta chỉ phát hiện trực tiếp được các gốc tự do bền có trong mẫu
đo; còn những gốc có khả năng phân ứng mạnh hơn, thời gian tồn tại ngắn hơn thì phải phát hiện bằng phương pháp đồng trùng hợp chắp nối hay đo phát quang cực yếu Các phương pháp này
cho kết quả đáng tin cậy khi nghiên cứu quá trình POL, nhưng cần phải có thiết bị đo chuyên
dụng, khó kiếm và tốn kém
Trang 23MDA là một trong những sản phẩm cuối cùng của quá trình POL có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức màu hồng bền Độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm Phép đo
này đơn giản dễ thực hiện, kết quả đáng tin cậy với sai số từ 10%- 20%, Tuy nhiên trong mẫu sinh học vẫn có một số chất khác có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric Kết quả chính xác và rất đặc hiệu, nếu dùng thiết bị sắc ký lỏng cao áp, để tách riêng MDA trước khi cho phản
ứng với acid thiobarbituric
*Do hoạt tính chống oxy hoá - một chỉ tiêu đánh giá qua trinh POL:
Quá trình POL xảy ra mạnh hay yếu, ở mức bình thường hay bệnh lý là do sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống oxy hoá trong cơ thể Như vậy, việc
đánh giá mức độ xảy ra mạnh hay yếu của quá trình POL có thể suy ra khả năng chống oxy hoá của cơ thể hay của một chất nào đó cần nghiên cứu
Để biểu thị mức độ ức chế quá trình POL của chất cần nghiên cứu trên in vitro va in vivo,
người ta đưa ra khái niệm hoạt tính chống oxy hoá (HTCO)
HTCO là khả năng ức chế quá trình POL của chất cần đánh giá khi không có mặt chất đó
trong cùng điều kiện Thông thường hiện nay, đo HTCO thường đánh giá qua phép đo lượng các
chất có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric HTCO thường được biểu thị bằng tỷ lệ % lượng các sản phẩm trong quá trình POL tạo ra ( như MDA, LOO”) của mẫu thử các chất chống
oxy khi so sánh với mẫu chứng không có chất chống oxy hoá HTCO được biểu thị thành %
lượng MDA ở mẫu thử khi so sánh với mẫu chứng là 100%
Trước khi đo HTCO, người ta thường tiến hành các kỹ thuật: chế hoá mẫu, tiến hành kích
ứng thêm quá trình POL Để kích ứng thêm quá trình POL, người ta đưa thêm vào mẫu các chất
thân oxy hoá (prooxidant) như Fe”?, acid ascorbic và thổi liên tục oxy ở 37°C để kích ứng thêm
quá trình POL Việc thêm vào mẫu đo những chất thân oxy hoá hay khơng, hồn tồn phụ thuộc
vào mục đích nghiên cứu và điều kiện cụ thể của thí nghiệm tiến hành 3.4 Các chất chống oxy hoá:
Theo định nghĩa, những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc của các dạng oxy hoạt động đều gọi là chất chống oxy hoá Sự tồn tại của các gốc tự do và các peroxid gây tác hại lớn cho cơ thể nên các chất chống oxy hoá (antioxidant) giữ một vai trò quan trọng trong việc bảo»vệ cơ thể chống lại tác hại của gốc tự do Hệ thống bảo vệ, chống oxy hoá
này bao gồm nhiều thành phần Sự thiếu hụt bất kỳ thành phần nào đều có thể gây giảm trạng thái
chống oxy hố tồn phần và có thể là bệnh sinh của một số bệnh lý như ung thư, bệnh VXÐM [19, 20, 30, 40, 41]
Các chất chống oxy hoá gồm 2 loại : Chất chống oxy hoá có bản chất enzym và không
Trang 24Superoxid dismutase (SOD), catalase va hệ thống giutathion peroxidase (glutathion peroxidase (GPx), glutathion reductase (GR), glucose 6 phosphat dehydrogenase (G,DP)) Nhiing
enzym này tồn tại chủ yếu trong tế bào (ở huyết tương hoạt độ các enzym chống oxy hoá rất thấp), và cơ chế chống oxy của chúng trong cơ thể như sau:
+ SOD xúc tác quá trình phân huỷ superoxid - là gốc tự do mà từ đó sẽ sản sinh ra các
đạng oxy hoạt động khác
2O," +2H: SOP» Ho, +0,
+ Catalase xúc tác phản ứng phân huỷ hydrogen peroxid (H;O;) khi H;O; có nồng độ cao H,0, Catalase + 0, + Glutathion peroxidase xúc tác phản ứng loại bd các peroxid hữu cơ, và peroxid vô cơ có nồng độ thấp ROOH + 2GSH —————h GSSG + ROH +H,0 Trong đó: GSH-— Glutathion dạng khử
GSSH - Glutathion dang oxy hoá
ROOH- Peroxid, R có thể là phần gốc hữu cơ hoặc có thể là H trong H;O; *Hệ thống chống oxy hố khơng phải là enzym :
Gồm 3 nhóm chính là nhóm polyphenol; nhóm thiol và nhóm các phối tử của sắt (hay đồng) Chúng có san trong cơ thể hoặc được đưa từ ngoài vào theo dạng thức ăn, thuốc uống
Thuộc nhém polyphenol cé vitaminA, vitaminE, vitaminC, CoenzymQ, bioflavonoid Tác
dụng triệt tiêu gốc tự do của chúng thể hiện ở một số tính chất sau:
+ Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, tạo dạng oxy hoá (quinon) OH O | + 2R° ————* + 2RH | OH O
+ Dạng oxy hoá của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và như vậy chúng lại có
Trang 25+ Đặc biệt là dạng oxy hoá và dạng khử có thể phản ứng với nhau tạo gốc semiquinon một cách thuận nghịch OH Oo O° OR J | 2R" —— + Ẩ—”*;|Ol|-—>z | OH O OH OH Semiquinon
Các gốc semiquinon rất bên, có thể tồn tại lâu và không độc nên chúng là chất trung hoà gốc tự đo rất tốt Các polyphenol có khả năng biến các gốc tự do hoạt động thành các gốc trơ, vì vậy người ta đã gọi “ các gốc tự do bền vững” là “ các tác nhân thư đọn” gốc tự do độc hại để bảo
vệ cơ thể Ngoài tác dụng triệt tiêu gốc tự do, các polyphenol (dạng ortho) còn có khả năng tạo
phức (chelat hoá) với ion sắt (hoặc đồng) và như vậy có thể làm mất khả năng xúc tác của các ion nay trong phan tng Fenton [40]
Hiện nay, nhiều nhà hoá học và sinh học cho rang polyphenol nói chung và các bioflavonoid nói riêng là chất chống oxy hoá lý tưởng đối với con người [71, 72, 73]
Bioflavonoid là những polyphenol có hoạt tính sinh hoc và tồn tại rất phổ biến trong thực
vật Hiện đã có những flavonoid có tác dụng chống oxy hoá được sử dụng nhiều trong y học như Rutin và một số chất khác để điều trị một số bệnh liên quan đến gốc tự do như phóng xạ, viêm
mãn tính, bệnh VXĐM [20,40, 45, 70]
Cho đến nay, có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc trong đó có chứa flavonoid Flavonoid được sử dụng như những chế phẩm thuốc đặc trị một số bệnh và được thế giới công nhận là một trong những hợp chất tự nhiên có tác dụng làm chậm sự lão hoá của cơ thể và chống
sự đột biến ở tế bào Hiện nay, flavonoid nói riêng và hợp chất polyphenol tự nhiên nói chung
đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong đời sống và điều chế thuốc chữa bệnh [ 20, 32, 40, 70]
4 Bức xạ ion hóa và ảnh hưởng trên cơ thể sống [31,33, 34]
4.1 Cơ chế tác dụng của bức xa ion hóa:
Trang 26trúc của các phân tử sinh học, phân hủy chúng và tạo ra các ion, gốc tự do trong các tế bào và mô Các gốc tự đo tiếp tục phản ứng chuỗi tạo thành các gốc tự do thứ cấp tấn công tiếp vào các phân tử sinh học khác Khi các phân tử sinh học bị tổn thương sẽ dẫn đến rối loạn trao đổi chất trong tế
bào Hậu quả là phát sinh các quá trình bệnh lý như ung thư, quái thai, bệnh đột biến gen và giảm
tuổi thọ “
Cơ chế tổn thương do bức xạ ion hóa gồm:
* Cơ chế trực tiếp:
Các đại phân tử sinh học bị tác động trực tiếp của bức xạ do nhận năng lượng của bức xa,
chúng ở trạng thái bị kích thích và ion hoá Do vậy, các phân tử hữu cơ quan trọng bị tổn thương dẫn đến đột biến gen, huỷ diệt tế bào [19]
Cơ chế tác dụng trực tiếp có thể biểu diễn:
Bac x! *
AB ———» AB AB +hv
A‘ +B* A‘+B*
Năng lượng được truyền cho phân tử AB chuyến AB về trạng thái kích thích AB” ở trạng
thái kích thích, phân tử AB” có thể:
- Kết hợp với phân tử hữu cơ khác tạo ra phản ứng hoá học mới hoặc chuyển năng lượng đã tiếp nhận được cho phân tử khác để về trạng thái ổn định ban đầu AB
- BỊ phân ly thành các phân tử nhỏ hơn (A°, B') điều này đễ gây ra các phản ứng hoá học
Cũng có thể, các phân tử bị mất đi một điện tử tạo nên một ion dương (AB?) hoặc nhận thêm một điện tử tạo nên một ion âm (AB), các ion âm và đương kết hợp với nhau tạo thành một
phản ứng hoá học mới * Cơ chế gián tiếp:
Trang 27H,O; rất độc với phân tử hữu cơ Lượng H;O; được sản sinh càng nhiều khi hàm lượng O; trong môi trường càng lớn
HO? + HO”; -> H,O; + O;
Các gốc tự do HỲ, HO” càng đễ dàng phản ứng với các phân tử hữu cơ gây nên những biến
đổi tại đó và tạo thêm những gốc kích thích mới:
RH +H’ > R` +H,
RH +HO*>R°+H,0
Géc R° dé bi kich thich gay ra cdc phan ứng hoá học mới, tạo ra các gốc peroxid rất độc
hại làm cho số lượng các phân tử hữu cơ bị tổn thương tăng lên theo phản ứng dây chuyên
R* +0, RO,
RO,” + RH > ROOH + R’
Như vậy, tác hại của phóng xạ là làm tăng gốc tự do và các dạng oxy hoạt động 4.2 Tác dụng sinh học của bức xạ ion hóa
* Một số biến đối về máu và hệ tạo máu dưới tác dụng của bức xạ ion hóa:
Tác dụng của bức xạ ion hoá đồng thời lên các cơ quan trong cơ thể Những tổn thương cấp
tính trước tiên xảy ra với các tế bào tạo máu tại tủy xương, hệ bạch huyết, các tế bào gan.Máu cũng là nơi chứa đựng và vận chuyển nhiều sản phẩm chuyển hoá độc hại sinh ra do tác động của
các tác nhân Vì vậy, có thể nói máu và cơ quan tạo máu là tổ chức đầu tiên của cơ thể chịu ảnh
hưởng của hoá chất, phóng xạ Khi chiếu xạ, các tế bào gốc trong tủy xương giảm tốc độ phân bào do đó làm giảm số lượng tế bào gốc dẫn tới làm giảm tế bào máu ngoại vi Những tế bào có đời sống ngắn như bạch cầu trung tính, tiểu cầu giảm trước Trong điều trị ghép tủy cho bệnh nhân leucemia người ta áp dụng chiếu xạ để diệt toàn bộ tế bào ung thư và các tế bào gốc trong tủy xương trước khi ghép tủy Lympho là tế bào rất nhạy cảm với tia xạ, chỉ cần liều bức xạ nhỏ cũng đủ bất hoạt chúng, do đó chúng bị ảnh hưởng mạnh nhất Lympho B bị tổn thương nặng hơn
lympho T
Hồng cầu khi bị tác động của tỉa xạ trở nên dễ vỡ hơn do lipid của màng hồng cầu bị peroxi hoá và hồng cầu bị biến dạng, giảm đường kính nhưng lại tăng thể tích trung bình, tăng nồng độ các hợp chất cao phân tử nội bào, gây hút nước và có thể gây ra huyết tán Đồng thời nông độ các
thành phần trong hồng cầu cũng bị thay đổi Số lượng hồng cầu giảm, thay đổi tính thấm màng
hồng cầu, giảm lượng oxy cung cấp cho tế chức; hậu quả dẫn đến rối loạn trao đổi chất, rối loạn
chuyển hóa mà một trong những biểu hiện của nó là tăng hàm lượng glucose máu
Trang 28chiếu xạ lớp tế bào nội mạc mạch máu với liều 5 Gy thấy: sau 24 giờ giảm hàm lượng ADN, tăng
sự lắng đọng tiểu cầu vào thành mạch, gây rối loạn đông máu
Các nghiên cứu cho thấy chiếu xạ ảnh hưởng đến tế bào gan, gây rối loạn trao đổi chất, rối
loạn chuyển hoá dẫn đến giảm tổng hợp enzym xúc tác phân giải glycogen thành glucose, ảnh
hưởng đến sự hấp thu glucose ở ruột non, giảm glycogen ở gan Hậu quả là tăng glucose mau Như vậy, tăng plucose máu là hậu quả của giảm mức tiêu thụ chứ không phải do tăng tổng hợp
glucose [18, 36, 37, 52]
* Tổn thương do bức xạ ion hóa ở mức độ phân tử và tế bào:
ở mức độ phân tử, mặc dù chiếu xạ có thể chỉ làm tổn thương rất nhỏ trong tổng số các
phân tử có trong tế bào nhưng đủ gây những đột biến di truyền
- Bức xạ ion hóa có thể làm giảm hàm lượng của một số hợp chất hữu cơ như các protein enzym, các acid nhân Cấu trúc của phân tử hữu cơ bị phá vỡ dẫn đến giảm hoặc mất hẳn hoạt
tính sinh học
- Bức xạ có thể làm đứt chuỗi polynucleotid gây ra hiện tượng nối mạch, sắp xếp lại thể
nhiễm sắc làm ảnh hưởng đến tính chất di truyền [7, 31]
- Bức xạ có thể làm tăng hàm lượng một số chất có sẵn và xuất hiện chất lạ, độc hại như H;O,, histamin và thay đổi nồng độ glucose trong máu
Ở mức độ tế bào: sau khi bị chiếu xạ, tế bào có thể lâm vào tình trạng sau: - Chết
- Ngừng phân chia do tổn thương chất liệu di truyền
- Xuất hiện những tế bào bất thường có sai lệch nhiễm sắc thể
Tuy nhiên, trong cùng một cơ thể, không phải các loại tế bào đều nhạy cảm như nhau trước
bức xạ ion hoá Bergonic và Tribondcau đã đưa ra định luật “Độ nhạy cảm của tế bào với bức xạ tỉ lệ thuận với khả năng sinh sản của tế bào và tỉ lệ nghịch với mức độ biệt hoá của chúng”, ví dụ:
độ nhạy cảm trước bức xạ giảm đần đối với những tế bào dưới đây: -Té bao Lympho
-Hồng cầu non, bạch cầu hạt
* Tổn thương do bức xạ ion hóa trên các mơ và tồn thân:
Cơ thể toàn vẹn có những tương tác giữa các hệ thống cơ quan qua hệ thần kinh và nội tiết
Cơ thể lại có khả năng tự phục hồi nên có thể đáp ứng với các bức xạ một cách phức tạp hơn
nhiều so với mức tế bào hay tổ chức
Bức xạ ion hoá gây ảnh hưởng đến toàn cơ thể, sự tổn thương tế bào có thể dẫn đến tổn
thương mô Mức độ tổn thương của mô khác nhau vì độ nhạy cảm phóng xạ khác nhau, bao gồm:
Trang 29Vi du: Liéu LD 50/30 (là liều bức xạ gây tử vong 50% số cá thể trong vòng 30 ngày kể từ khi bị chiếu xạ), thay đổi như sau:
- Với chuột lang : 300-500 rad (tia X hay tia Gamma) - Với chuột cống : 450-600 rad
Trang 30Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHAP
1.Chất liệu, Thỏ thực nghiệm, Trang bị và hoá chất
1.1 Chất liệu.Lá chè xanh được thu hái ở nông trường chè thuộc xã Phú Cát, tỉnh Hà Tây, chè
Trung du Giống chè đã được xác định là Camellia sinnensis Chè được trồng và chăm sóc theo
tiêu chuẩn chè xuất khẩu Lá chè (cả lá già và lá non)đuợc thu hoạch vào vụ xuân (tháng 3 năm
2000, 2001, 2002)
1.2 Thỏ thực nghiệm:
Thỏ đực, chủng Orytolagus cuniculus, 12 tuần tuổi, khoẻ mạnh, có trọng lượng 2- 2,5kg/
con, do Trung tam nghiên cứu Dê và Thỏ Ba Vì- Hà Tây cung cấp Thỏ được nuôi tại Bộ mơn
Hố - Hố sinh, đảm bảo tiêu chuẩn về dinh đưỡng, nhiệt độ, ánh sáng,.v.v theo tài liệu hướng
dẫn của Trung tâm nghiên cứu Dê và Thỏ
Dụng cụ thuỷ tỉnh- hãng Pyrex, Jenna (Pháp và Đức)
Pipet tự động các loại - hãng Boehringer Mannheim (CHLB Đức)
1.3.Trang bị và hoá chất
+ Trang bị: - Bộ cất quay Buchi (Thuy sĩ)
- Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (Beckman-Mỹ)
- Máy đông khô ( CHLB Đức)
- May ly tam lạnh Beckman Avanti 30 (Mỹ)
- Quang kế 4010-hãng Bochringer Mannheim (CHLB Đức)
-Quang phé ké Shimadzu UV- 160 (Nhat)
-Tủ ấm (CHLB Đức)
-Cân phân tích chính xác 1/10 mg (CHLB Đức)
- Bình gạn, Bình thuỷ tính Pirex các loại
~- Một số dụng cụ thí nghiệm thông thường khác
+Hoá chất: Acetat Ethyl, Ferrous sulfat, Acetonitrile, Cholesterol (Merk), acid bacbituric (Merk),
v.v và một số dung môi khác dùng cho sắc ký
Các kit định lượng :Cholesterol, triglycerid, LDL-C, HDL-C, do hang Boehringer Mannheim
(CHLBĐ) cung cấp
Trang 312 Phương pháp chiết xuất và xác định thành phần dịch chiết polyphenol chè xanh 2.1 Chiết xuất polyphenol chè xanh
Polyphenol từ lá chè xanh được chiết xuất theo quy trình của Taiyo Kagaku Co., Ltd (Nhật Bản) như sau Lá chè xanh, tươi Nước cất sôi, 45 phút Lọc v Dich chiét ché xanh Bay hơi ở 60°C còn 1/2 thể tích Dịch nước ‹ chè đã cô đặc Ethyl acetate 1/2 thể tích Dich chié¥ethyl acetate ché xanh
Bay hoi 6 a xuat va nhiét độ thấp
v
Bột chiết xuất polyphenol chè xanh 2.2 Xác định thành phần bột polyphenol chè xanh
Thành phần bột polyphenol chè được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp sử dụng hệ
thống sắc ký của hãng Beckman (Mỹ) và cột sắc ký Divelosil ODS-P-5 (4,6 x 150 mm; Nomura
Chemical; Nhật)
Các điều kiện dùng cho sắc ký như sau:
+Dung môi: Acid acetic: Acetonitrile : Dimethylformamid : Nước = 3:1:15:82
+Áp suất cột: 40 kg / cm?
+Tốc độ đồng chảy : 0.5 ml / min
+Bước sóng phát hiện các polyphenol :280 nm
+Thé tich mau : 20 ul
+Sac ky duge thuc hién trong 60 phút
Mẫu chiết xuất chè xanh Việt nam và chè xanh Nhật bản (Sunphenon 1005 ) được chạy sắc ký
trong cùng một điều kiện tại Labo trung tâm, Đại học Y Hà nội
Trang 323 Mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng của BPPCX trên rối loạn chuyển hoá
(RLCH) lipid ở thỏ uống cholesterol
3.1 Mô hình thực nghiệm gây RLCH lipid máu ở thủ:
Áp dụng và cải tiến phương pháp gây tăng cholesterol máu ngoại sinh của Đoàn Thị Nhu và
cộng sự [33] °
Dầu cholesterol 20%: Cân 20 g cholesterol - đun nóng cách thuỷ khoảng 75 ml dau lạc, cho cholesterol vào dầu lạc, khuấy đều cho tan hết cholesterol, để nguội, thêm đầu lạc vừa đủ 100ml, 1 ml
đầu lạc chứa 0,2 g cholesterol
Cho thỏ uống 0,5 g cholesterol/kg thân trọng (tức là 2,5 mỉ dung dịch cholesterol 20%/ kg thân trọng) trong một ngày bằng cách bơm qua sonde vào miệng thỏ Uống liên tục trong 45 ngày
* Chia nhóm:
20 con thỏ đực được chia làm 4 nhóm ([, II, IH, IV), mỗi nhóm 5 con
+ Nhóm I- uống cholesterol đơn thuần
+ Nhóm II, HII, IV: uống cholesterol, sau 2 giờ được uống thêm BPPCX theo liều lượng như sau : nhóm II : 50 mg dịch chiết/ kg /ngày, nhóm III : 100 mg dịch chiết/ kg/ ngày, nhóm IV
: 150 mg dịch chiết/ kg/ngày
* Lấy mâu máu: Các nhóm thỏ được lấy máu vào các thời điểm ngày 0, ngày 15, ngày 30,
ngày 45 để xác định các chỉ số TG, TC, HDL- C, LDL- C, MDA Tại các ngày lấy máu xét nghiệm, không cho thỏ uống cholesterol; và BPPCX
* Lấy mẫu động mạch xác định tổn thương giải phẫu bệnh:
Sau khi lấy máu lần cuối (ngày thứ 45), giết toàn bộ thỏ bằng cách bơm khí vào tĩnh mạch
vành tai thé, phẫu tích tim và toàn bộ ĐMC từ vị trí van ĐMC tới chỗ ĐMC phân đôi thành các động mạch chậu Mẫu bệnh phẩm được đánh giá tình trang VXDM theo phương pháp nhuộm đặc hiệu (có chụp ảnh minh hoa )
Trong nghiên cứu này, ngoài mầu ĐMC của 4 nhóm thỏ nghiên cứu, còn xác định hình ảnh giải phẫu bệnh mẫu ĐMC của nhóm thỏ bình thường (nhóm chứng) (n = 5) Nhóm này được
nuôi trong cùng điều kiện môi trường với 4 nhóm thỏ trên nhưng không cho uống cholesterol và
BPPCX
Người đọc kết quả giải phẫu bệnh không được biết cách chia nhóm thỏ nghiên cứu
Nghiên cứu hình thái mô bệnh học được thực hiện tại bộ môn Giải Phẫu Bệnh-Trường Đại Hoc Y
Trang 333.2 Các kỹ thuật sử dụng:
* Chuẩn bị bệnh phẩẩm: Huyết tương chống đông bằng heparin, không được vỡ hồng cầu
* Dinh luong TG, TC, HDL- C, LDL- C: theo phương pháp đo mầu enzym trên quang kế
4010 của hãng Boehringer Mannheim (CHLB Đức) Kết quả tính dựa vào nồng độ mẫu
+ Định lượng trigiycerid:
Theo phương pháp GPO- PAP (Trin.P.(1969).Amn Clin Biochem.6:24)
Nguyên tắc: Triglycerid có trong huyết tương được chuyển thành dihydroxyaceton- phosphate và H,O, bởi các enzym lipoprotein lipase (LPL), glycerol kinase (GK), glycero-3- phosphate- oxidase (GPO) Sau d6, H,O, dugc két hop véi mot chất hiện màu và nhờ tác dụng
của enzym peroxydase (POD) chuyển thành hợp chất có màu hồng, đỉnh hấp thụ cực đại ở 546 nm LPL Triglycerid + H,O <* siycrol + RCHOOH GK Glycerol + ATP <> glycero-3- phosphate + ADP GPO Glycero-3- phosphate + O; <* dihydroxyaceton- phosphate + H,O; POD
2H,O; + 4- aminophenazone + phenol — 4- (p- benzoquinone- mono- imino)phenazone + 4H,0 + Định lượng cholesterol toàn phần:
Theo phương pháp CHOD — PAP (Trin.P.(1969).Ann Clin Biochem 6:24)
Nguyên tắc: cholesterol có trong huyết tương được chuyển thành cholesterone và H,O; do
các enzym cholesterol esterase và cholesterol oxydase xúc tác Sau đó H;O; kết hợp với chất hiện
Trang 34+ Định lượng HDL- C:
Nguyên tắc: LDL, VLDL và CM bị kết tủa khi thêm vào huyết tương phosphotungstic
acid va ion Mg”* Ly tam dé chi c6 HDL trong dịch nổi Định lượng cholesterol trong dịch nổi
bằng phương pháp CHOD - PAP
+ Định lượng LDL - C:
Nguyên tắc: LDL bị kết tủa khi thêm vào huyết tương Polyvinyl sulphat Ly tâm để loại
bỏ LDL ra khỏi dịch nổi Định lượng cholesterol trong dịch nổi bằng phương pháp CHOD - PAP Tính kết quả:
LDL- C (mmol/l) = Cholesterol ,a„ „a„T— Cholesterol „„ „; * Định lượng MDA huyết tương [63]:
Định lượng MDA huyết tương dựa theo phương pháp Jadwiga Robax
Nguyên tắc: MDA trong huyết tương phản ứng với thiobarbituric acid để tạo phức
Trimethine có màu hồng, đỉnh hấp thụ cực đại ở 532 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ MDA có trong huyết tương Nồng độ MDA là số nmol MDA có trong 1 ml huyết thanh O O HH H O I I H H HN 0 HN C=C-C= H ! I —— O=C — CH,- C=O +2 2H,O 5 OH 5 OH O S | { Ị H H H Malonyl dialdehyd Acid Thiobarbituric Phitc hop Trimethine
Định lượng MDA trên quang phổ kế Shimadzu UV- 160 (Nhật) E x 3,8 x 2,25 Tính kết quả: MDA( nmol/ml) = ———————— =Ex36,54 0,156 x 1,5 Trong đó: E_ : Mật độ quang
Trang 350,156: Độ hấp thụ của dung dịch MDA (Inmol/ml) được đo bằng cuvet có độ dày 1 cm tại bước sóng 532 nm
*Xác định tình trạng VXĐM [4]:
- Đánh giá mức độ tổn thương trên đại thể:
+ Quan sát vị trí tổn thương xơ mỡ và mức độ tổn thương theo cách chia độ của WHO
năm 1972
+ Nhuộm Soudan IV: Phát hiện mảng xơ mỡ trên đại thể, vùng tổn thương xơ mỡ bất màu đỏ, vùng không tổn thương thì không bất màu
- Đánh giá mức độ tổn thương trên vi thé:
+ Làm tiêu bản mô bệnh học, nhuộm theo phương pháp Thường quy Hematoxylin-Eosin (HE) và phương pháp Verhoeff (phất hiện các sợi chun) Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang
học để xác định tổn thương Có chụp ảnh vị thể minh họa
4 Mô hình thực nghiệm đánh giá tác dụng của BPPCX ở thỏ bị chiếu xạ
Thỏ được nuôi 7 ngày trong điều kiện đầy đủ về thức ăn và nước uống tại Phòng thí nghiệm Bộ
mơn Hố Sinh trường Đại học y Hà Nội
Chía nhóm thỏ: Thỏ được chia làm 5 nhóm - 6 con một nhóm
+ Nhóm H: đối chứng sinh học (ĐCSH), không chiếu xạ, không uống BPPCX, thỏ được nuôi trong cùng điều kiện với các nhóm khác
+ Nhóm X: đối chứng chiếu xạ (ĐCCX) được uống dung dịch NaCl 9%o cùng thể tích và số lần với nhóm nghiên cứu (1, II, II)
+ Nhóm [: chiếu xạ kết hợp uống 100 mg BPPCX /kg can nang/ngay + Nhóm H: chiếu xạ kết hợp uống 150 mg BPPCX /kg cân nặng/ ngày + Nhóm III: chiếu xạ kết hợp uống 200mg BPPCX /kg cân nặng/ngày
Thỏ ở các nhóm được uống NaCl 9%o hoặc BPPCX bằng cách bơm qua sonde vào miệng thỏ
trong 5 ngày liên, mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng
4.1 Phương pháp chiếu xạ:
Các nhóm thỏ X, I, IT, II được chiếu xạ bằng tia gamma từ nguồn Cobalt-60 trên máy CHISOBALT-
2- B75A tại bệnh viện K Hà nội Thỏ được đặt trong hộp gỗ hình trụ, kích thước 20 x 25 x 40 cm
Trang 36* Ngày chiếu xạ (ngày thứ 5): + Cân nặng
+ 30 phút sau uống lần cuối cùng NaCl 9%o hoặc BPPCX liều như trên, các nhóm thỏ được
chiếu xạ (liều và thời gian như trên) _
+ Sau chiếu xạ 120 phút, thỏ được lấy máu tĩnh mạch tai để xác định: các chỉ số hồng
cầu, bạch cầu, Hb, nồng độ glucose máu, các thông số SOD, GPx, GR (hồng cầu), MDA và TAS
(huyết tương)
Sau chiếu xạ:
Các nhóm thỏ được nuôi dưỡng theo chế độ ăn quy định
+ Tại ngày thứ 10 (sau xạ 5 ngày) và ngày 25 (sau xạ 20 ngày), tiến hành thí nghiệm như sau: + Cân nặng
+ Lấy máu định lượng các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, Hb, nông độ glucose mau, cac enzym chống oxy hoá: SOD, GPx, GR (hồng cầu), MDA và TAS (huyết tương)
$ Xác định tổn thương Giải phẫu bệnh:
Sau khi lấy máu lần cuối (ngày thứ 20) giết 1/2 số thỏ bằng cách bơm khí vào tĩnh mạch vành tai thỏ, phẫu tích gan và thận, tủy xương đùi thỏ làm tiêu bản giải phẫu bệnh và xác định các tổn thương mô bệnh học Tổn thương vi thể gan thỏ chiếu xạ được chia thành 4 độ:
+ Tển thương độ I : Chỉ có dưới 10% số tế bào gan (quan sát được trong vi trường) bị tổn thương + Tổn thương độ II: Khoảng 10%-20 % số tế bào gan quan sát được bị tổn thương
+ Tổn thương độ IỊI: Khoảng 25 — 50% số tế bào gan quan sát được bị tổn thương
+ Tổn thương độ IV: Trên 50% số tế bào gan quan sát được bị tổn thương
Người đọc kết quả giải phẫu bệnh không được biết cách chia nhóm thỏ nghiên cứu
Nghiên cứu hình thái mô bệnh học được thực hiện tại bộ môn Giải Phẫu Bệnh-Trường Đại Học Y Hà Nội 4.3 Các kỹ thuật sử dụng 4.3.1 Chuẩn bị bệnh phẩm: Huyết tương chống đông bằng heparin, không vỡ hồng cầu 4.3.2 Tạo dịch huyết tán: - Máu tĩnh mạch 500 HÌ (chống đông bằng heparin) cho vào tube nhọn đáy Ly tâm 4000 G/5 phút -Tách bỏ phần huyết tương
-Rửa hồng cầu 3 lần bằng NaCl 9%o để lạnh, mỗi lần 3 ml
- Ly tâm 3500 G/ 5 phút Lần cuối ly tâm 4000G/10 phút để nén chặt phần hồng cầu ở
Trang 37- Bù lại bằng nước cất để lạnh một lượng vừa đủ 500 nl - Trộn đều, cho vào ngăn đá tủ lạnh 15 phút
- Lấy ra lắc bằng máy lắc
Như vậy, ta có dịch huyết tán 100%
4.3.3 Định lượng Glucose mau:
Hàm lượng Glucose máu thỏ được định lượng theo phương pháp Hexokinase dựa theo
nguyên tắc:
Glucose + ATP —“-» Glucose -6 phosphate + ADP
Glucose- 6 phosphate + NAD* —“£"? 5 6 phospho gluconate + NADH + H*
(HK: Hexokinase G ,PD: Glucose 6 phosphate dehydrogenase )
Đo màu ở bước sóng 340 nm Kỹ thuật được tiến hành trên máy phân tích sinh hoá tự động Epress Plus (Mỹ), tại khoa Hoá sinh bệnh viện K Hà Nội
4.3.4 Xác định các chỉ số huyết học:
Xác định số lượng bồng cầu, bạch cầu, Hb máu thỏ trên máy đếm tế bào tự động
Sysmex -K4500 (Nhật) tại Viện Nhi Trung ương So sánh kết quả giữa các nhóm thỏ và các thời điểm trước xạ, sau xạ 2h, sau xạ 5 ngày và sau xạ 20 ngày
4.3.5 Xác định hoạt độ các enzym:
* Hoại độ SOD hồng cầu:
Hoạt độ của SOD được đo dựa trên nguyên tắc sau: phân ứng chuyển xanthin thành acid
uric đưới tác dựng của xanthin oxidase đồng thời cũng sinh ra gốc superoxide (G ) Xanthin oxidase - -
Xanthin —————D—> Acid Uric + OF
Trang 38ROOH: Peroxid hữu cơ
Hoạt độ của GPx được đo bằng sự giảm độ hấp thụ phổ ở bước sóng 340nm do sự oxy hóa
NADPH thành NADP' Kit hóa chất của hãng Randox * Hoạt độ GR hông cầu:
Dựa vào nguyên tắc: -
Glutathion reductase xúc tác cho phản ứng biến Glutathion dạng oxy hóa thành Glutathion dạng khử, đồng thời biến NADPH thành NADP'
GSSG + NADPH + H* _—*> 2GSH + NADP*
Hoạt độ GR được đo bằng sự giảm độ hấp thụ phổ ở ^ = 340nm
4.3.6 Định lượng MDA huyết tương dựa theo phương pháp Ohkawaetal như đã trùth bày ở
phần các kỹ thuật đánh giá tác dụng BPPCX trên RLCH lipid
4.3.7 Xác định TAS huyết tương [65]:
ABTS £ [2,2 - Azino - di 3- ethybenzthialime sulphonate)] được ủ với metmyoglobin và H,O, để tạo gốc cation ABTSZ* Chat này cho màu xanh da trời và đo được ở bước sóng 600nm
Chất chống oxy hoá thêm vào bình thường là nguyên nhân ức chế của sản phẩm màu này và độ ức chế sẽ tỷ lệ với hợp chất màu được tạo ra
Fe” + H,O; —> X-[Fe” = O] +H;O
ABTS5 + X -[Fe” = O]——> ABTSX*+ HX - Fe”
HX - Fe”: Metmyoglobin
X-[Fe* = O]: Ferylmyoglobin
ABTS © [2,2 - Azino - di (3 - ethybenzthiazoline sunphonate)]
Thuốc thử của hãng Randox 5 Xử tý kết quả nghiên cứu: