Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol

DANH M ỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng N, N – dimethylethanolammonium octanoate và bis 2-methoxyethylammonium bis trifluoromethysulfonylimide 8 Khố

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-**** -

MEAS PISAL

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ CÂY THANH CAO HOA VÀNG BẰNG DUNG MÔI ISOPROPANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-**** -

MEAS PISAL

DUNG MÔI ISOPROPANOL

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

DS Trần Ngọc Bảo

Người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian qua, giúp

nghiệp

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo bộ môn Công nghiệp dược, các

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học

Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học

tập tại trường

Sinh viên

Meas Pisal

M ỤC LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

DANH M ỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về artemisinin 2

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất 2

1.1.2 Nguồn gốc artemisinin 2

1.1.3 Tác dụng dược lý và chỉ định của artemisinin 2

1.2 Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 3

1.2.1 Cây thanh cao hoa vàng 3

1.2.2 Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng 3

1.2.3 Phân bố 4

1.2.4 Bộ phận dùng và chế biến 4

1.2.5 Thành phần hóa học 5

1.2.6 Công dụng 6

1.3 Một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng 6

1.3.1 Chiết bằng dung môi n-hexan 6

1.3.2 Chiết bằng ethanol 7

1.3.3 Chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn 7

1.3.4 Chiết bằng dung dịch ion lỏng 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên v ật liệu, hóa chất và thiết bị 10

2.1.1 Nguyên liệu 10

2.1.2 Hóa chất 10

2.1.3 Máy móc, thiết bị 10

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Phương pháp định lượng 11

2.2.2 Phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin 12

2.2.2.1 Phương pháp chiết xuất với dung môi IPA 12

2.2.2.2 Phương pháp tinh chế 13

2.3.1 Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết 13

2.3.1.1 Số lần chiết 13

2.3.1.2 Thời gian chiết ở nhiệt độ phòng 14

2.3.1.3 Thời gian chiết khi tăng nhiệt độ 14

2.3.2 So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng dung môi n-hexan……… 14

2.3.2.1 So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan 14

2.3.2.2 So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng 15

2.3.2.3 So sánh hiệu suất chiết khi tăng nhiệt độ 16

2.3.2.4 Tính chọn lọc giữa 2 dung môi 16

2.3.3 Phương pháp tinh chế artemisinin 16

2.3.3.1 Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan 17 2.3.3.2 Phương pháp kết tinh trong dung môi ethyl acetat 17

2.3.3.3 Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng 18

3.2 Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết 18

3.2.1 Khảo sát số lần chiết 18

3.2.2 Khảo sát thời gian chiết xuất ở nhiệt độ phòng 19

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết khi tăng nhiệt độ 20

3.3 So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng

dung môi n-hexan 21

3.3.1 So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan… 21

3.3.2 So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng…… 22

3.3.3 So sánh hiệu suất chiết xuất giữa 2 dung môi IPA và n-hexan ở nhiệt độ

40 ± 5°C 23

3.3.4 Tính chọn lọc giữa 2 dung môi 24

3.4 Xây dựng phương pháp tinh chế 25

3.4.1 Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan 25

3.4.2 Phương pháp tinh chế bằng kết tinh artemisinin trong dung môi ethyl acetat…… 27

3.4.3 Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan 28

3.4.4 So sánh về các phương pháp tinh chế 30

3.4.5 Đề xuất phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin bằng dung môi IPA 31

KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1

Độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng

N, N – dimethylethanolammonium octanoate và bis 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide)

8

Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu

môi ethyl acetat và n-hexan

25

acetat

27

n-hexan

28

Bảng 3.12 So sánh các phương pháp tinh chế theo các tiêu chí 30

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

biệt ở biên giới giữa Campuchia và Thái Lan là nơi tập trung bệnh sốt rét nhiều nhất

là một hoạt chất có tác dụng tốt với thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt

rét, đặc biệt với sốt rét thể não do chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã

cao hoa vàng (Artemisia annua L.) Trên thế giới, đã có nghiên cứu chiết xuất

hạn), HFC-134a (Hydrofluocacbon)… Ở Việt Nam, phương pháp chiết xuất artemisinin được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp ngâm với dung môi n-hexan

có khả năng hòa tan tốt nhiều chất và nguy cơ cháy nổ thấp hơn dung môi n-hexan và

“Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol” với mục đích góp phần tìm ra phương pháp chiết artemisinin có hiệu quả

cao hoa vàng bằng dung môi IPA

lọc, hiệu suất)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về artemisinin

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất

Khối lượng phân tử: 282,33

epoxy – 12H – pyrano [4,3-j] – 1,2 – benzodioxepin – 10(3H) – one [15]

toluen và hầu như không tan trong nước, nó dễ bị thủy phân và phân hủy trong các

dung môi không phân cực [3]

Nhiệt độ nóng chảy: 156 – 157°C

Artemisinin được tìm thấy trong cây thanh cao hoa vàng, hàm lượng cao nhất

artemisinin đến 0,9% nhưng nói chung cây thanh cao hoa vàng mọc ở nơi khác chỉ có hàm lượng artemisinin khoảng 0,1% [7]

1.1.3 Tác dụng dược lý và chỉ định của artemisinin

Đến hiện nay, artemisinin vẫn được dùng để điều trị sốt rét do có khả năng diệt

chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã kháng cloroquin Artemisinin có tác

CH 3

Ngoài việc dùng artemisinin để điều trị sốt rét, artemisinin đang được nghiên

thư rất cần ion sắt để phát triển nên chúng hấp thu lượng ion sắt lớn hơn tế bào thường

hóa mạnh này có tác dụng phá hủy màng tế bào ung thư Đối với tế bào bình thường thì độc tính của artemisinin là tương đối thấp do lượng ion sắt không cao [12]

1.2 Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất

artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng

1.2.1 Cây thanh cao hoa vàng

Thanh cao hoa vàng (tên khoa học là Artemisia annua L.), là cây thuộc họ Cúc

Các thầy thuốc Trung Quốc đã sử dụng nước sắc của cây thanh cao hoa vàng để điều trị sốt Ở Việt Nam, vào thế kỳ XIV, Tuệ Tĩnh cũng đã dùng thanh cao hoa vàng trong điều trị và đến những năm 1990 bắt đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học

và phương pháp chiết xuất

Hình 1.1: Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng

Cây thảo mọc đứng, sống hàng năm, phân nhiều cành Thân hình trụ có rãnh

3 lần lông chim thành những thủy nhỏ và sâu, lá ở giữa ngọn lúc cây sắp ra hoa thường

[4], [7]

Cụm hoa hình đầu, cuống rất ngắn, đường kính 1,5cm, các đầu tụ hợp thành

cái, bên trong là hoa lưỡng tính, tràng của hoa cái có tuyến ở trong ống, ống tràng hơi

Quả bế, hình trái xoan hoặc hình trứng ngược, có vân dọc, dài 0,4 – 0,5mm, có tinh

đới và nhiệt đới Bắc bán cầu, bao gồm một số nước ở Đông Âu, Bắc Mỹ, Tây –Nam Á

và Đông Á [2], [7]

Ở Việt Nam, thanh cao hoa vàng mọc tự nhiên ở bốn tỉnh: Lạng Sơn, Cao Bằng, Quang Ninh và Bắc Giang Do việc phát triển trồng từ năm 1990 đến nay, thanh cao hoa vàng còn được trồng ở các tỉnh trung du và đồng bằng Bắc Bộ như Vĩnh Phúc,

nắng nhẹ hoặc sấy ở nhiệt độ 30 – 40°C đến khô [7] Lá có màu vàng nâu hoặc nâu

1.2.5 Thành phần hóa học

artemisinin (thành phần chính), acid artemisinic, artenuin (qinghaosu I), artenuin B (qinghaosu II), desoxyartemisinin (qinghaosu III), Qinghaosu IV, artenuin E (qinghaosu V), artemisininlacton (artenuin F), artemisiten (dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester [7]

thanh cao hoa vàng đạt từ 0,01% đến 0,9% [7] Ở Việt Nam hiện nay, artemisinin và

O H

Arteannuin C

Hình 1.2: Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng 1.2.6 Công dụng

vàng lâu ngày không có hại mà còn làm cho ăn ngon cơm, chóng tiêu, chữa mệt mỏi

đại tiện ra máu, dùng ngoài da có tính chất sát trùng, chữa mụn nhọt lở ngứa [4], [7] Trong y học hiện đại, thanh cao hoa vàng là nguồn nguyên liệu để chiết xuất artemisinin dùng trong điều trị sốt rét [2], [3], [4], [6]

Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp chiết xuất artemisinin từ

chiết, an toàn, chi phí thấp Các phương pháp chiết artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng :

Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, người ta sử dụng dung môi n-hexan để

phương pháp truyền thống Lá thanh cao hoa vàng được phơi khô, xay thô và nạp vào nồi chiết Tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, chiết ở nhiệt độ 30 – 50°C, thời gian chiết 3

đó gộp dịch chiết lại, cô thu hồi dung môi rồi rút ra để kết tinh ít nhất 24 giờ, artemisinin sẽ kết tinh lẫn với sáp Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng

sáp Artemisinin thô đã loại hết sáp được hòa tan trong cồn sôi, thêm than hoạt và đun

thường tối thiểu 24 giờ Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C [5]

Dung môi n-hexan là dung môi khá chọn lọc, quá trình chiết đơn giản nhưng

1.3.2 Chiết bằng ethanol

- Ethanol: 96%

- Thời gian chiết: 3,5 giờ

đến cắn Hòa tan cắn bằng hỗn hợp dung môi n-hexan – ethyl acetat (85:15), lọc Dịch

[14]

môi trường, có thể áp dụng cho dược chất không bền, khả năng hòa tan tốt một số chất

đắt; điều kiện tối ưu để chiết thành công [14]

artemisinin trong mục đích thay thế dung dịch ion lỏng với các dung môi đang sử

dụng Artemisinin tan tốt trong nhiều dung dịch ion lỏng, đặc biệt độ tan của

(DMEA oct) và bis 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide)

dimethylethanolammonium octanoate và bis 2-methoxyethylammonium bis

(trifluoromethysulfonylimide)

Qua nhiều thực nghiệm, người ta chứng minh được rằng hiệu suất chiết artemisinin

(bảng 1.2)

bảng 1.2:

chiết suất (%)

- Hiệu suất chiết xuất: Là tỷ lệ giữa khối lượng artmisinin thu được so với artemisinin

có trong dược liệu

- Chi phí vận hành: bao gồm các chi phí điện và chi phí cho quá trình chiết khác

- Chi phí đầu tư: bao gồm chi phí trang thiết bị, chi phí chiết xuất, hàng tồn kho và dung môi

Nhận thấy IPA là một alcol có khả năng hòa tan và một số tính chất như ethanol, IPA rẻ hơn ethanol Hơn nữa IPA có loại khan nước nên có thể artemisinin sẽ

ổn định trong IPA hơn trong ethanol 96% Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA với mong muốn tìm được dung môi chiết an toàn và có hiệu suất cao

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Lá thanh cao hoa vàng được trồng ở vùng Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc, lá được thu hái vào tháng 4 năm 2012

- Máy cất quay Buchi B480 (Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Định lượng theo DĐVN IV, sử dụng phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng [1] Cách tiến hành như sau:

- Bản mỏng: silica gel G

bình soxhlet dung tích 50ml trên cách thủy trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi lấy cắn

1ml dịch lọc đầu, lấy khoảng 2ml dịch lọc tiếp theo

ethanol 96% (pha dùng trong ngày)

- Bản silica gel G (20cm×20cm) đã được hoạt hóa ở 110°C trong 2 giờ được chia vạch thành 5 băng, chấm lần lượt mỗi băng 0,1ml các dung dịch thử (băng 1 và 2) và dung

mỏng ra, để khô dung môi ngoài không khí trong 1 giờ Phun nước cất làm ướt bản

được xác định sao cho cách đều hai mép của vết 0,5cm đến 0,7cm Cạo riêng biệt các

kỹ Thêm 9ml dung dich NaOH 0,05N, lắc kỹ, cho vào tủ ấm 50°C trong 30 phút Lấy

ra để nguội 15 phút, lọc lấy dịch lọc trong và đo độ hấp thụ của các dung dịch so với

dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 292nm (phục lục 4.1 DĐVN IV) Kết quả đo của

Lượng artemisinin có trong dược liệu khô kiệt tính theo % bằng:

trong dịch chiết như sau:

- Dung dịch đối chiếu: Chuẩn bị theo DĐVN IV (như mục 2.2.1.a)

được tính toán theo phương trình sau:

Khối lượng sản phẩm = thể tích dịch chiết × hàm lượng

Định lượng theo DĐVN IV, sử dụng phương pháp đo quang ở bước sóng 292nm [1]

sử dụng dung môi n-hexan trong giáo trình [6] Quy trình chiết xuất được chia làm 2 giai đoạn, cụ thể như sau:

- Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu

- Giai đoạn 2: Chiết xuất

+ Dung môi chiết xuất: IPA

xuất thay đổi theo khảo sát cụ thể

kiện khảo sát Dịch chiết được thu vào bình thủy tinh có nút mài Xác định hàm lượng,

- Bước 3: Kết tinh sản phẩm

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng được quy trình chiết xuất arteminsinin sử dụng dung môi IPA, chúng tôi thay đổi 1 số điều kiện và tiến hành định lượng theo mục 2.2.1.b, xác định hiệu suất Cụ thể như sau :

Nhằm tìm số lần chiết cho hiệu suất cao, tốn ít dung môi Tiến hành chiết theo phương pháp chiết bằng dung môi IPA với tỷ lệ DL/DM thích hợp, chiết 4 lần, dựa vào kết quả hàm lượng, hiệu suất quy trình để lựa chọn số lần chiết thích hợp

vừa đủ ngập (40ml) vào các bình nón có chứa dược liệu Chiết 4 lần tại nhiệt độ

phòng, 16 giờ rút dịch chiết một lần Lấy mẫu, pha mẫu như đã trình bày ở mục

Tiến hành chiết theo phương pháp chiết bằng dung môi IPA với thời gian chiết khác nhau, dựa vào kết quả định lượng dịch chiết, đánh giá hiệu suất quá trình chiết để lựa chọn thời gian chiết thích hợp

chiết lần lượt 4h, 8h, 16h Chiết ở nhiệt độ phòng, chiết với lần chiết đã lựa chọn được

2.3.1.3 Thời gian chiết khi tăng nhiệt độ

tại nhiệt độ 40 ± 5°C, chiết với lần chiết đã lựa chọn được, dựa vào kết quả định lượng dịch chiết, đánh giá hiệu suất quá trình chiết để lựa chọn thời gian chiết thích hợp

vừa đủ ngập (40ml) vào các bình nón có chứa dược liệu và chiết theo thứ tự thời gian

(2.2.1.b) Lặp lại thí nghiệm 2 lần lấy kết quả trung bình

dung môi n-hexan

n-hexan

Để so sánh độ tan của artemisinin trong IPA và trong n-hexan Tiến hành xác định hàm lượng artemisinin trong các dung dịch bão hòa với n-hexan và IPA

- Cân một lượng dư Artemisinin chuẩn, đưa vào ống nghiệm chứa 15ml dung môi siêu

màng lọc 0,45µm Tiến hành định lượng dung dịch trên bằng phương pháp HPLC

pha tĩnh, pha động sử dụng hỗn hợp dung môi acetonitril chuẩn - nước (6:4)

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch (A) có nồng độ 1,0mg Artemisinin chuẩn/ml

- Đo diện tích của pic thu được từ dung dịch A và dung dịch thử tính phần trăm khối

Công thức tính:

Trong đó:

- Sthử : Diện tích pic của mẫu thử

nhiệt độ phòng

môi n-hexan cùng một điều kiện tỷ lệ DL/DM, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết,

phương pháp Cụ thể như sau:

- Thời gian chiết: rút lần 1 sau 16 giờ Sau đó, cách 16 tiếng rút dịch chiết 1 lần Tiến

sau các khoảng thời gian

nhiệt độ 40 ± 5°C với các điều kiện giống nhau về thời gian chiết, số lần chiết đã lựa

- Bình 1: Thêm dung môi IPA vừa đủ ngập dược liệu (40ml)

pha mẫu như đã trình bày ở mục (2.2.1.b) Lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình

Để xác định tính chọn lọc của 2 dung môi:

cắn toàn phần

cho artemisin kết tinh trong dung môi n-hexan

Trong phương pháp chiết artemisinin bằng dung môi IPA, chúng tôi tiến hành khảo sát

ethyl acetat : n-hexan, dung môi ethyl acetat và dung môi n-hexan