phospholid được chiết từ hạt đậu nành bằng C02 ở trạng thái siêu tới hạn thực nghiệm được tiến hành theo mô hình thực nghiệm trực giao bậc hai, ba yếu tố. Snả phẩm được phân tích bằng HPLC ELS có so sánh với sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ
Trang 1BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THANH LOAN
NGHIÊN CỨU CHIET XUAT VA TINH CHE
PHOSPHOLIPID TU HAT DAU NANH BANG PHUONG PHAP CO, O TRANG THAI SIEU TOI HAN
KHOA LUAN TOT NGHIEP DƯỢC SĨ KHOÁ 2004- 2009
Người hướng dâu : TS LƯU HOÀNG NGỌC TS NGUYÊN THỊ LẬP Nơi thực hiện :; Phòng Hóa Thực Vật - Viện
Trang 2LOI CAM ON
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lưu Hoàng Ngọc, TS
Nguyễn Thị Lập - những người thây đã tận tình hướng dẫn đìu đắt và truyền đạt những kinh nghiệm cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thấy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Hoá Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi để em có thê hoàn thành khoá luận của mình
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Ngọc Thanh, KS Nguyễn Mai Cương, Cứ nhân Lê Ngọc Thức và các cắn bộ công tác tại trưng tâm Hoá thực vật - Viện Hố học cơng nghiệp - những người đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận
Em xin cảm ơn Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo, các phòng bạn và bộ món
trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập tại trường và thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Cuối cùng em xin phép được dành lời cảm ơn cho bố mẹ, anh em, bạn bè - những người đã luôn động viên khích lệ em trong học tập, trong cuộc sống và hết
lòng giúp đỡ đẻ em thực hiện khoá luận này
Hà Nội, tháng 5 năm 2009 Sinh viên
Trang 3MUC LUC CAC KY HIEU VIET TAT "b;à.` (.: Mu 1 PHÀN I: TÔNG QUAN, 2222222222222222222222222212122221222.cc.cccce 2
1.1 Phương pháp chiết bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn (SCO;) 2
1.1.1 Trang Giới đi (6ê ĐẠP «esoooeooesễseceseseseessooesoosesoooboooeooOSiSUEoSES2662622266,e66 2 1.1.2 Các đặc tính của CO; ở trạng thái siêu tới hạn .- 4
1.1.3 Sử dụng dung mdi phy trg cho SCOQ 4 1.1.4 Một số ứng đụng chính . 2-52 s2 SssEeEEEsevvseerxkrrvsvee 5 1.2 Giới thiệu chung về đậu nành 2 2-22 252S2EE EU Sex e2 6 1.2.1 Đặc điểm thực vật + 2C EEkecExkEExecEEeEEAeEEervxerkssrved 6 L?9 Tinh Ha ROIRRG ————fÐÐEẰSỪ}=—_ 6 149 N2 h====—=——=—=————— 7 L5 Liên HN Hi ccnSŸEÏEeeeeceeeeeeeeeeeeeee======see===se=s==== 7
1.4 Téng quan vé phospholipid .0.0 0 000cc.cssssesssseessssessssuesssnnessneesssseennunsenncens 8
1.4.1 Giới thigu chung vé phospholipid .0 -.c0s-svesssseesssseeeeceeeeesneessneeee § 1.4.2 Vai trò và ứng đụng, 2-22 EV22919EE2211129222112222231 7222131 9
1.5 Công nghệ chiết xuất phospholipid từ hạt đậu nành -55- 10 1.5.1 Chiết xuất phospholipid bằng đung môi 5-5 se 10 1.5.2 Chiết xuất phospholipid bằng phương pháp SCO;, l3
PHÀN H: THỰC NGHIỆM 15
Re 15
2.1.1 Nguyén 1i@u .csecccsssseesssssesesssnesessneeesssneeersssnes = 15 2.1.2 Hóa chất và thiết bị, 2-22 +2 42CE+.EEx4ZCEAgeCxeervkrcrxkrcvveee l§
SE LH HH HH eeeerererrrrnrnnnnneennnnnnsnnnen ló
Trang 4es 16
2.2.3 Chiết phospholipid bằng SCO;;, 5 Hee 17 2.2.4 Chiét phospholipid đối chứng bằng dung môi hữu cơ 20
125 Pháo HN GRG (HN Ỗ luhhhcghhG G2222 n0 k2 A666á+¿esiioe 20
Oh OE CA VA tư abằa ii 21 5X 1 01a th dt Nese ly u.kyƑkƑ_ƑƑ—_Ÿ.Ỷ—ẰREEESn= 21 2.3.2 Chiét phospholipid bing phuong phap SCO, 21 2.3.3 Chiết đối chứng bằng dung môi hữu cơ 2-52 szZ5sz 21 2.3.4 Phân tích sản phẩm -2- %2 ÉEEEeEEEEEEAEEEA.21442344733212 27 2.4.5 Quy trình công nghệ chiét phospholipid bing SCO, 30 A AN CR CNG iiss cies 31 2.4.1 Về lựa chọn nguyên liệu và phương pháp . 2e 31 2.4.2 Vé qua trinh chiét phospholipid .0.s00 sssecsseesssessssneeeoneeesneeeesneneees 31
2.4.3 Về tiềm năng ứng dụng của phospholipid 55-52 33
ET ERIE VAT uy ¿¿ 34
Trang 5CAC KY HIEU VIET TAT
C (Co-solvent): dung môi phụ trợ
Cạ„: hàm lượng dung môi phụ trợ tối ưu
CDHP: chất điện hoạt phổi
EtOH: ethanol GL: glycolipid
Hoge: higu suất tối ưu
HPLC — ELS ( high performent liquid chrogratomaphy - evaporative light scattering ):
sắc ký lỏng hiéu nang cao véi detector tan xa anh sang bay hơi
McOH: Methanol
NL (neutral lipid): lipid trung tinh T: nhiệt độ
P: áp suất
Poe: áp suất tối ưu
PA: acid phosphatidic PL: phospholipid PC: phosphatidyl cholin PI: phosphatidyl inositol PE: phosphatidy! ethanolamine PG: phosphatidyl glycerol PS: phosphatidyl serin SM: sphingomyelin
SCO, (supercritical carbon dioxide) : CO, & trang thai siêu tới hạn SCF (supercritical fluid ) : dung môi siêu tới hạn
Trang 6DAT VAN DE
Công nghệ chiết bằng CO); ở trạng thái siêu tới hạn để sản xuất được chất và hương liệu từ nguồn thiên nhiên là một kỹ thuật đang được phát triển cạnh tranh với các kỹ thuật truyền thống do ưu thể vượt trội, tạo các sản phẩm có độ tỉnh khiết cao giảm thiểu ô nhiễm môi trường và không để lại đư lượng hóa chất có hại cho sức khỏe con người, đây là những tiêu chí quan trọng trong sản xuất các chế phẩm hóa được, mỹ
phẩm, và thực phẩm
Hiện nay, nghiên cứu công nghệ nano ứng dụng trong ngành Y- Dược là một
trong những hướng nghiên cứu mũi nhọn, đang được chính phủ và Bộ Y tế ưu tiên
phát triển Trong đó, việc nghiên cứu chế tạo liposom làm chất mang thuốc, thành phan co ban 1a lớp phospholipid kép, đang góp phần tạo ra một số dạng bào chế hiện đại, có tính sinh khả dung cao Liposom có cấu trúc kiểu màng sinh học của cơ thẻ, có tính tương thích sinh học và độ an toàn cao rất có ý nghĩa trong việc mở ra hướng phát
triển mới cho các thuốc tác dụng tại đích trong một số điều trị đặc biệt như ung thư, các bệnh nắm, bào chế vaccin, điều trị gen
Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu nhằm áp dụng đạng thuốc liposom vào điều trị Một trong các lý đo là giá thành của các thương phẩm liposom và nguyên liệu chủ yếu chế tạo liposom là phospholipid phải nhập ngoại với giá khá cao Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra phương pháp và quy trình công nghệ chiết xuất phospholipid có độ tỉnh khiết cao từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có trong nước, đáp ứng được các tiêu
chuẩn chế tạo liposom là rất cần thiết
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế phospholipid tic hat đậu nành bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn ”
Mục tiêu của để tài là:
Chiết tách phospholipid từ hạt đậu nành bằng phương pháp CO; ở trạng thái siêu tới hạn;
vx Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ đến hiệu suất chiết
phospholipid bing phương pháp CO; ở trạng thái siêu tới hạn, từ đó đưa
ra những thông số tối ưu cho quá trình chiết tách;
“ Phân tích, so sánh chất lượng sản phẩm của phương pháp chiết xuất bằng
Trang 7PHAN I: TONG QUAN
1.1 Phương pháp chiết xuất bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn (SCO;)
1.1.1 Trạng thái siêu tới hạn
Năm 1861, Gore lần đầu tiên giới thiệu về khả năng hòa tan tốt của Naphtalen
và Camphor trong CO; lỏng Vào các năm 1875 - 1876, Andrew, một trong những
người đầu tiên nghiên cứu vẻ trạng thái siêu tới hạn của CO;, đã tiên hành đo vả cung cắp những giá trị áp suất và nhiệt độ tới hạn của CO; khá gần với các số liệu hiện đại Hiện tượng một số muối vô cơ như KI, KBr có thể hòa tan trong dung môi EtOH vả tetrachloromethan ở trạng thái siêu tới hạn được Hannay vả Hogarth công bố lần đầu tiên tại hội nghị khoa học Hội khoa học Hoàng gia London năm 1879 [26,31] Buchner (1906) cũng thông báo về khả năng hòa tan của một số hợp chất hữu cơ kém bay hơi trong SCO, cao hon nhiêu lần so với trong CO; ở dạng khí [19]
Đối vối mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong ba trạng thái rắn, lỏng và khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dẫn nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Vật chất ở
trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí va chất lỏng, chính vì vậy chúng
đều có những trạng thái ưu việt của cả hai pha khí và lỏng Ở trạng thái siêu tới hạn, tỉ
trọng của pha cũng tương đương như tỉ trọng của pha lỏng Nhưng sy linh động của
Trang 8Đối với các chat có phân tử lượng nhỏ như các hydrocacbon có số cacbon tir |
đến 3 thì giá trị áp suất tới hạn của chúng không cao, mà chỉ xắp xi vào khoảng 45 bar,
nhưng giá trị nhiệt độ tới hạn (T,) của chúng phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của chất và độ phân cực trong phan tir [16]
Khi phân tử lượng của chất tăng lên thì có thể kéo theo giá trị T, cũng tăng lên
Tuy nhiên T, cũng không phụ thuộc nhiều vào giá trị phân tử lượng mà nó bị chỉ phối
mạnh bởi độ phân cực trong phân tử Độ phân cực trong phân tử càng lớn thì giá trị T,
càng lớn, điều này được giải thích do độ phân cực trong phân tử tăng lên, giữa các phân tử sẽ xuất hiện một lực cảm ứng giữa các cực do vậy ta sẽ cần phải tốn một năng
lượng rất lớn để phá vỡ trật tự giữa các phân tử khi nó ở pha lỏng Trong trường hợp
giữa các phân tử có lực liên kết hyđro, giá trị T sẽ tăng lên rất lớn
Ở các dung môi siêu tới hạn, ưu điểm nổi bật nhất mà mọi dung môi thông
thường khác không có được đó là khả năng hoà tan rất tốt các chất tan ở cả 3 trạng thái
rắn, lỏng và khí Dung môi ở trạng thái siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất đễ bay hơi và cả các cấu tử không bay hơi của mẫu Do vậy, dung môi ở trạng thái siêu tới hạn sẽ mang cả hai đặc tính: đặc tính phân tách của quá trình trích li và đặc tính
phân tách của quá trình chưng cắt
Do vậy, có thé thấy rằng việc sử dụng dung môi siêu tới hạn đẻ tách chiết các chất sẽ mở ra một phương pháp kỹ thuật mới mà tiểm năng của nó trong tương lai sẽ có sự tác động lớn tới nền cơng nghiệp hố chất, thực phẩm, được phẩm và công nghệ sinh học Bảng 1.1: Các thông số vật lý của một số dụng môi ở điểm tới hạn [28]
Dung môi Nhiệt độ tới hạn ( Áp suất tới hạn ( Tỷ trọng riêng
Trang 91.1.2 Cac đặc tính của CO; ở trạng thái siêu tới hạn
CO; vả một số dung môi khác ở trạng thái siêu tới hạn có tinh chất hóa lý đặc biệt nhu [16, 19, 22, 26, 27]: + + + + Sức căng bẻ mặt thấp; Độ linh động cao, độ nhớt thấp; Tỷ trọng xắp xỉ tỷ trọng của chất lỏng: Có thẻ điều chỉnh khả năng hòa tan các chất khác bằng cách thay đổi nhiệt độ và áp suất
Đề đáp ứng các yêu cầu công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên, SCO; là
dung m6i được ưu tiên lựa chọn áp dụng vì các thuận lợi sau:
+ CO; là một chất để kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành
công nghiệp hóa chất khác;
Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết Khi được đưa lên đến trạng thái siêu tới hạn, CO; không tự kích nẻ, không bắt
lửa và không duy trì sự cháy;
CO; không độc với cơ thẻ, không ăn mòn thiết bị:
Điểm tới hạn của CO; (P, = 73 atm; T, = 30,9°C) là một điểm có giá trị nhiệt độ, áp suất không cao lắm so với các chất khác cho nên sẽ ít tốn năng
lượng hơn để đưa CO; tới vùng siêu tới hạn;
Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồng
thời cũng hòa tan được cả các chất thơm đễ bay hơi, không hòa tan các kim
loại nặng và có thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt
độ để thay đổi độ chọn lọc của đung môi;
Khi sử dụng CO; thương phẩm đẻ chiết tách không có du lượng cặn độc hại trong chế phẩm chiết,
1.1.3 Sử dụng dung môi phụ trợ cho SCO;
Dung môi phụ trợ hay dung môi thứ cấp là một chất hữu cơ được đưa thêm vào dung môi chính của SCO; với một lượng rat nhỏ, thường là 1-5 % mol, nhằm biến đổi đặc tính của dung môi chính theo hướng có lợi cho mục tiêu chiết tách, chẳng hạn như
làm thay đổi tính phân cực, hay các tương tác riêng của dung môi đối với các hoạt chất
Trang 10Ngồi ra dung mơi phụ trợ có thể cải thiện tính chọn lọc của qúa trình tách
chiết bảng sự tương tác ưu tiên với một hay vải cấu tử Methanol là một ví dụ: cho
thêm 3,5 % mol methanol lam ting độ tan của 2 - aminobenzoic acid lên 620% trong SCO, [22]
Dung môi có trộn thêm dung môi phụ trợ sẽ có các giá trị tới hạn (nhiệt độ, áp suất) khác với giá trị của dung môi chính Thông thường với nồng độ dung môi phụ
nhỏ hơn 5 % mol, sự sai khác này không đáng kể và hỗn hợp dung môi thường vẫn ở
trạng thái siêu tới hạn [22]
1.1.4 Một số ứng dụng chính
Hiện nay công nghệ chiết bằng SCO; đã và đang được áp dụng phỏ biến để chiết tách các hoạt chất sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm các hợp chất thiên nhiên, được phẩm và mỹ phẩm
Trên thế giới đã sứ dụng công nghệ SCO; vào việc loại cafein trong quá trình sản xuất các loại đồ uống từ chè, cà phê [19, 32] Trong công nghiệp thuốc lá, công nghệ SCO; được sử dụng để chiết những thành phần dễ bay hơi và tách phần hương tự nhiên từ cây thuốc lá để nâng cao chất lượng sản phẩm Trong ngành thực phẩm, công nghệ SCO; ứng dụng để sản xuất các sản phẩm có hàm lượng chất béo và cholestesrol thấp hoặc các thực phẩm chức năng (giàu axit béo, DHA, EPA vv ) SCO; còn được dùng để chiết các hợp chất của hoa huplon để dùng trong công nghệ bia và dược phẩm: chiết các hoạt chất chống oxy hoá có nguồn gốc tự nhiên Theo đánh giá của
các chuyên gia (Vitzthum và Hubetr; Behr và cộng sự) [ 19, 27] thì việc sử dung SCO,
vào chiết tách các hoạt chất thiên nhiên ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược
phẩm với sản lượng lớn ở quy mô công nghiệp sẽ trở thành phỏ biến trong tương lai
Bang 1.2: Một số sản phẩm sản xuất bằng công nghệ SCO; ở quy mô công nghiệpƒ 19} Nước Công ty Sản phẩm tự nhiên HAG-General Foods Ca phé Đức SKW Chemical Chè, huplon, gia vị Banh Huplon
Australia Carlton & United Huplon Anh English Hops Huplon, gia vị
General Foods Cà phê Mỹ Pfizer Huplon
Phasex Các sản phẩm khác
Trang 11
-Bên cạnh đó, công nghệ SCO; được áp dụng rộng rãi trong chiết tách nhiêu loại tinh dầu từ thực vật như tinh đầu hoa nhải, hoa bưởi Sản phẩm có độ tính khiết cao, mùi đặc trưng vả hiệu suất khá cao Ngồi ra cơng nghệ nảy cũng có nhiễu triển vọng trong việc chiết xuất các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh và tăng cường sức khỏe từ thảo mộc như: chiết vinblastin chữa ung thư máu từ cây dừa can (Catharanthus roseus), chiét các hợp chat triterpenoid (đặc trưng nhất là faradiol) có tác dụng chống
viêm tir hoa cay cic vang (Calendula officialis)
1.2 Giới thiệu chung về đậu nành [5] 1.2.1 Đặc điểm thực vật
Đậu nành (Đậu tương) - Giycine max (L.) Merr, thuộc họ Đậu — Fabaceae
Hạt đậu nành đã chế biến - Semen Sojae Preparatum, thường gọi là Đạm đậu xị
Đâu nành là cây thảo hàng năm, có thân mảnh, cao 50- IŠ50cm, có lông, các cảnh hướng
lên trên Lá mọc so le, c6 3 la chét |
hình trái xoan, gắn nhọn mũi, hơi
không đều ở gốc Hoa trắng hay tím, xếp thành chùm ở nách Quả
thông, hình lưỡi liễm, có nhiều
lông mềm, màu vảng lục hay vàng
nhạt, thắt lại giữa các hạt Mỗi quả
có từ 2 — 5 hạt, gắn hình câu hay hình thận, có màu sắc thay đối tuỳ
theo giống trồng Hoa đâu nành nở vào tháng 6-7, quả được thu hái vào tháng 7-9 1.2.2 Thành phần hóa học Hình 1.2: Hình ảnh cây và hạt đậu nành Toản cây chứa 12% nước, 16% glucid, 14 — 15% protein, 6% mudi khoảng va các chất khác không có nitơ
Trong hạt đâu nành có các thành phân đã biết tính theo tỷ lệ %: Protein 35 -
40%, lipid 12 — 25%, glucid 10 — 15%; cac mudi khoang Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, BI, B2, D, E, F; cac enzym, sap, nhya, cellulose va cac acid amin co ban: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoai ra, dau nanh
được coi là một nguễn cung cấp protein hoản chỉnh vì chứa một lượng đáng kế các acid amin thiết yêu Trong đạm đậu xị ngoài protein, lipid, glucid, cén có xanthin,
Trang 12Lipid chiếm 12 - 25%, là một chất đậu rất rõ (do chất methylnonnyxeton), mùi
vị này lâu dần sẽ thay đổi do hiện tượng oxy hóa vả tạo thành một mảng mỏng trên
mặt dầu Lỏng ở nhiệt độ thường, đông đặc ở -13°C va & -15°C, ty trong 0,924 đến 0,927 (6 15°C), chỉ số khúc xạ 1,4762 - 1.4765 (ở 15°C) Sền sệt & +8°C va +15°C, các acid béo chảy ở 27 ~ 29°C, chỉ số iod 137 - 142, chỉ số xà phòng hóa 192,5 Trong dầu béo đậu nành còn có phospholipid (1 - 2%) bao gồm: PC, PI, PS, PA, PE trong đó chủ yếu là PC PC hoặc nằm trong dầu béo (tách ra bằng aceton lạnh) hoặc nằm trong phần bã (tách ra bằng dung môi bay hơi) [ I 1.21]
1.2.3 Phân bố và chế biến
Đậu nành được trồng phô biến ở Đông Nam Á, Bắc và Nam Mỹ Quê hương của đậu nành là Đông Nam châu Á, nhưng 45% điện tích trồng và 55% sản lượng đậu
nành của thế giới nằm ở Mỹ, sau đó đến Brasil, Argentina, Trung Quốc và Án Độ
Phân lớn sản lượng đậu nành của Mỹ hoặc để nuôi gia súc, hoặc để xuắt khẩu, mặc dù
lượng tiêu thụ ở người trên đất nước này đang tăng lên và dầu đậu nành chiếm tới 80%
lượng đầu ăn ở Mỹ Năm 2000, Mỹ sản xuất 75 triệu tắn đậu nành trong đó hơn một
phần ba được xuất khâu [29]
1.3 Lecithin thương mại
Lecithin thương mại hay lecithin thô là một hỗn hợp của PLs với TGs,
phytoglycolipids sterols, các acid béo và được sản xuất như 1 sản phẩm phụ của quá trình tỉnh chế dầu thô [18] Quá trình này được tiến thành bằng việc khuấy dầu thô với nước, nhờ đó phần lecithin phân cực được chuyển vào pha nước, sau đó lảm sạch vả sấy khô thu được lecithin thô Chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và được phẩm như chất nhũ hóa, chất điện hoạt
Lecithin tỉnh khiết được lấy từ hỗn hợp lipid phân cực và không phân cực từ
động vật và thực vật Lipid phân cực như glycolipid và phospholipid hầu hết không
hòa tan trong aceton, tương phản với lipid không phân cực, chủ yếu là TG hoà tan
trong aceton
Về phương diện thương mại, lecithin tỉnh khiết được sản xuất từ lecithin thô lấy
từ dầu thô của hạt đậu nành, cọ, hạt bông, oliu, hoa hướng đương Về phương diện
khoa hoe, lecithin tinh khiết quy vẻ phosphatidylcholine (PC) Lecithin với hàm lượng PC cao có khả năng nhũ tương hóa tốt hơn hỗn hợp phospholipid, do đó cần tinh chế
làm giàu thêm phân đoạn lipid phân cực từ việc loại đầu của hạtmàm, hoặc từ leeithin
thô
Trang 13Một phần chủ yếu của lecithin hiện nay được sắn xuất như một sản phẩm phụ
của quá trình tỉnh chế dầu đậu nành Dâu đậu nành thô tách chiết bằng hexan chứa 2- 3% lipid phân cực Leeithin đậu nành thương mại hay lecithin đậu nành thô chứa 35%
lipid không phân cực; 64,3% lipid phân cực trong đó bao gồm: 86% PL va 14% GL;
0,7% nước [22]
1.4 Tổng quan về Phospholipid
1.4.1 Giới thiệu chung về phospholipid
Phospholipid là este của rượu đa chức với các acid béo bậc cao và thành phần có thêm gốc phosphat, bao gồm hai phân nhóm tủy thuộc vào thành phẩn alcol trong cấu tạo của lipid: glyeerophospholipid có.alcol là glyeerol và sphingolipid c6 alcol 1a
sphingosin Câu tạo chưng của phospholipid: cại, ww
° „ H
Il ⁄Z HạC——N —Cˆ—CH;OH PL có tên gọi PC
H;C—O—Ô—R, | \
| nls — 5 HạN——C ——-CH;OH : PL có tên gọi PE |
| HN——Š——cH;Oœn PL có tên gọi PS
Ho -o—K Xa < | =
OH HzC——(CH;»›£—~CHOH
ee - HỆ——NH; PL có tên gọi SM
PE: Phosphatidy! ethanolamin MÐ in
PI: Phosphatidyl inositol
PS: Phosphatidy! serin & HO
SM: Sphingomyelin
Tùy thuộc vào cầu trúc của X mà ta phân
ra nhiều loại phospholipid: PC, PS, PI, PE, SM
PL cé 2 phan: phan dau (head) va phan dudi (tail) Phan dudi la hai chudi hydrocarbon, gọi là hydrophobie có tính ky nước Phân đâu có gốc phosphat và gắn các nhóm amino khác
nhau, gọi là hydrophilic có tính ưa nước Sự kết hợp của 2 phần hydrophobic và hydrophilic tạo thành phân tử có một đâu thân nước và một đâu
Trang 141.4.2 Vai trò và ứng dụng * Vai trò tạo màng sinh học
Lớp phospholipid kép của màng: đây là cấu trúc cơ bản của màng tế bào, là một
lớp lipid mỏng liên tục bao quanh tế bào, mềm có thể uốn khúc Thành phần hoá học của lớp kép hầu như hoàn toàn là phospholipid và cholesterol có cấu trúc gồm một đầu thân nước và một đầu ky nước Các đầu ky nước quay vào trong gặp nhau, hút lẫn
nhau, còn đầu ưa nước thi quay về hai phía có nước ở ngoài và trong tế bao [3]
Lớp lipid kép là hàng rào ngăn không cho các chất tan trong nuée nhu glucose,
các ion đi qua Trong khi đó đễ dàng cho các chất tan trong mỡ như O;, rượu, các vitamin tan trong dầu đi qua
¥ Phospholipid véi vai tro lam tién chat của thông tim thứ 2 [1J
Inositol là đồng phân đị lập thể của myoinositol PI 4,5 - điphosphat là thành
phân quan trọng của PL màng tế bào, đưới tác dụng kích thích của một chất hiệp đồng
hormon, nó sẽ được cắt thành điacylglycerol va inositol triphosphat, cả hai chất này
đều hoạt động như là những tín hiệu nội tế bao hay còn gọi là chất truyền tin thứ hai
*_ ai trò tạo chất diện hoạt phổi (CDHP) [3J
CDHP gồm 85% là PL, 10% là lipid trung tính, 5% là apoprotein Trong đó loại PL chiếm nhiều nhất và có hoạt tính nhất là PC Ngoài ra còn có các PL khác như PS, PI, PE, SM CDHP tập trung ở màng ngăn cách giữa không khí và phế nang có vai trò làm giảm sức căng bể mặt do đó làm giảm lực co thắt ở bẻ mặt phổi và việc giãn phối
CDHP chỉ bắt đầu hình thành đầy đủ vào những tháng cuối của thời kỳ mang thai (sau tuần thứ 30) Do vậy, 60-70% trẻ đẻ non đưới 30 tuần thai mắc phải hội
chứng suy hô hắp cắp tính Đây là nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất ở trẻ sơ sinh,
*“ Nguyên liệu chế tạo liposome
Thuật ngữ liposom xuất phát từ tiếng Hy Lạp: lipo có nghĩa là lipid, soma có nghĩa là cấu trúc
Đầu tiên, liposom được các nhà sinh học chế tạo làm mô hình màng sinh học
Sau đó được các nhà bào chế nghiên cứu làm một chất mang thuốc với mục đích bảo vệ được chất, kéo dài tác dụng của thuốc và đưa thuốc tới đích Hiện đang được áp dụng nhiều trong lĩnh vực: hóa trị liệu enzym trị liệu, insulin trị liệu, khử độc kim loại, kích thích hệ thống phòng vệ của cơ thẻ Tuy nhiên, do còn có những hạn chế
nhất định như độ ổn định của chế phẩm, tính đồng nhất giữa các lô mẻ trong điều chế
nên chưa được đưa vào sản xuất và ứng dụng ở quy mô lớn [2]
Trang 15Liposom là dạng đặc biệt của microcapsule và nanocapsule, bao gồm một nhân
nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng trục, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [6]
Nguyên liệu chính đẻ điều chế liposom là PL, bao gồm các loại [4.7]:
e PL tự nhiên phosphaudyl cholin (lecithin của trứng hoặc đậu nành), phosphatidyl serin L, y = phosphatidyl cholin đilauryl
e© PL tổng hợp như: phosphatidyl (inositol, dipalmoyl phosphatidyl cholin, distearoy! phosphatidy! cholin )
e Cac loai PL khac nhu sphingomyelin
Cholesterol va din chat duge thém vao phospholipid dé lam giam độ cứng và tính thắm của liposom, thường phối hợp ở tỷ lệ 20-30% trong thành phần của màng
liposom
Ngoài ra còn dùng các chất tích điện, tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ của
liposom để làm tăng dung tích của khoang nước, đo đó làm tăng khả năng đưa các
dược chất thân nước vào liposom Chất làm cho liposom tích điện âm như: acid
phosphatidic, diethyl phosphat : chất làm cho liposm tích điện dương như: stearylamin
1.5 Công nghệ chiết xuất phospholipid từ hạt đậu nành 1.5.1 Chiết xuất phospholipid bằng dung môi hữu cơ
+ Theo phương pháp của Folch, nguyên liệu được chiết bằng hệ dung môi chloroform/methanol (2/1 v/v) theo tỉ lệ 1/20 (w/w) Quá trình chiết được thực hiện tại nhiệt độ phòng, thời gian 15-20 phút, có khuấy trộn Sau khi chiết, tiến hành lọc, cất loại dung môi Phần địch chiết được rửa bằng nước hoặc nước muối 0,9% theo tỉ lệ 1⁄4 (v/v) Quá trình tách lỏng lỏng được thực hiện trên thiết bị li tâm ở tốc độ 2000
vòng/phút để phân tách thành hai pha Nếu cần có thể rửa bề mặt bằng đung dịch methanol/nước: 1/1 (v/v) một hoặc hai lần không khuấy trộn Sau khi ly tâm và loại bỏ
lớp trên lớp chloroform phía đưới chứa lipid được cô cất chân không hoặc dưới áp
suất của dòng nitơ thu được PL Có thể dùng dichloromethan thay cho chloroform trong phương pháp chiết xuất lipid này { 15]
+ Theo kết quả nghiên cứu khác, Yutaka TAKAGI và Teruyoshi YNAGITA [15,33,34] da tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu suất chiết PL trong đậu nành từ các
hỗn hợp dung môi khác nhau:
Trang 16(1): Chiết nhanh với chlorofom/methanol: 2/1 (v/v) theo phương pháp của
Folch;
(2): Chiét Soxhlet bang diethylether trong 16 gid:
(3): Chiét Soxhlet bang benzen/EtOH : 4/1 (v/v) trong 16 gid;
(4): Hạt được ngâm nước 14 giờ trước khi chiết theo phương pháp của Folch
Dịch chiết lipid được phân tích xác định các thành phần PL, TG, và Sterol Methyl ester của acid béo được tỉnh chế và phân tích bằng sắc ký khí — lỏng Thành
phần PL được xác định bằng phương pháp của Bartlett {12] sau khi ngâm với HCIO;
70% va được phân tách bởi sắc ký lớp mỏng trên silicagel H với hệ dung môi:
chloroform - methanol - acid acetic - nước (25:1 §:4:2) [33]
Kết quả cho thấy, hiệu suất chiết PL theo (1) đạt 14,7 mg/g, tương đương với
(3) — 15,9 mg/g va (4) - 15,0 mg/g, cao hon nhiéu so véi (2) — 2,0 mg/g Thanh phan
của PLs chiết theo (1) và (3) cũng đã được phân tích, không thấy sự khác biệt nhiều
Bang 1.3: Kết quả phân tích PLs khí chiết theo phương pháp (1) và (3) STT | Thành phan PL (1) (%) (3) (%) 1 |LPC 1,0 1,1 2 |SM 0,6 0.6 3 |PC 41.7 41.5 4 |PI+PS 213 22,2 5 | PE 29,5 28.6 6 | PA va cdc chat khác 5,7 6.0
Trang 17C2 1 Tach vo; Chiét bang n-hexan 2.Nghin ——— Ép cơ học 3 Chung say Khô đậu nành Cô Lọc Dầu thô 1 Thủy hóa; 2 Ly tâm Cặn lắng Dau thé
oo 1 Trung hda acid;
Đây khô, 2 Tẩy màu, mùi
Hình 1.4: Quọy trình chiết tach lecithin thô từ hạt đậu nành
Tinh chế lecithin thô: Thông thường quá trình phân ly lipid phân cực (86% PL, 14% GL) và lipid không phân cực ( 35% TG) bao gồm 2 bước: nạp lecithin thô và
aceton lạnh dư vào thùng phân ly, khuấy đều Sau đó tach phan lipid phân cực không hòa tan, đem làm khơ và hồ tan lại trong EtOH lọc tách bỏ phần cặn không tan, cô cất thu hồi dung môi Lecithin tỉnh khiết thu được là chất rắn có màu vàng sáng
Trang 18Trong một quá trình khác, dung dịch của hexan và lecithin thô được chạy qua cột silicagel, trong khi lipid trung tính bị hap phụ trái lại PL chạy qua cột và được tập trung trong hexan (Schneider, 1988) [22]
1.5.2 Chiết xuất phospholippid bằng phương pháp SCO, [3|
+ Chiết dầu đậu nành bằng hexan theo phương pháp truyền thống, PL thu được có lẫn dầu Tuy nhiên, nếu sử dụng SCO; để tách dầu từ đậu nành, sau đó chiết lại phần bã đã loại đầu thu được PL Khi sử dụng công nghệ SCO; có thêm dung môi phụ
trợ (EtOH), PC (lecithin tỉnh khiết) và PE được chiết chọn lọc hơn là PI Lượng PC và PE thu được phụ thuộc vào nông độ EtOH trong SCO, (Montanari et al., 1994) Tiến
trình có thể được mô tả như sau [21,22]:
Hạt đậu nành , Chiết " KỶ Dầu đậu nành (soybean Flakes) (700 bar, 80°C) ca (Soybean oil)
: Chiét bing SCO, + EtOH
See (682 bar, 80°C) (om
Hinh 1.5: So dé quy trinh chiết tách PL từ hạt đậu nành bằng SCO); (22}
+ Theo báo cáo nghiên cứu của G Began, và cộng sự [I3], lecithin thô được
chiết với CO; ở các áp suất 120, 200, 240, 280, 320 bar và nhiệt độ 40°C để thu lecithin đã loại dầu Lượng PL (không tan trong aceton) tăng lên khi tăng áp suất Lecithin sau khi tách đầu được tỉnh chế bằng EtOH, tuỳ thuộc vào áp suất chiết mà hàm lượng PC trong phan PL tan trong EtOH có thẻ lên tới 70.0%, tương ứng với 21,1% trong lecithin thô; hàm lượng PI trong phần không tan trong cồn có thể lên tới
37,1% tương ứng 12,3% trong lecithin thô
*
Trang 19+ Leyla Teberikler và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết chọn lọc PC từ
lecithin đậu nành bằng SCO; sir dung EtOH lam dung môi phụ trợ Nhiệt độ chiết trong khoảng 60 - 80C, áp suất 172 - 207 bar, nồng độ EtOH 10 - 12,5% mol theo
Trang 202.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Thông qua tài liệu tham khảo và các nghiên cứu sơ bộ chúng tôi đã xây dựng
thiết kế nghiên cứu thực hiện nhiệm vụ đẻ tài như sau (hình 2.3): fe, *, * i Hạt đậu nành 1 : Lecithin thô | Nghiên cứu quá " trình tách loại Các = kiện Lipid trung tính €
: Nghiên cứu quá Các thông số :
: trinh chiét PL tối ưu Tinh chế 4 QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ Vv Thi nghiém kiém chirng Hinh 2.3: Thiét ké nghién ciru 2.2.2 Chiét lecithin thé
Trang 21Lượng đầu thô trên được thủy hóa với 2% H;O (v/v) tại 70°C khuay trong
Igiờ Tiến hành lọc vắt ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút, tách bỏ lớp dau, lớp lắng cặn ở đưới được rửa sạch, sấy khô thu được lecithin thô
2.2.3 Chiét phospholipid bing SCO, hé thích 2 ¡ - Van một chiều 3- Mông bo MỈ - m
4- Bing dite khiến
Trang 222.2.3.1 Nguyên lý hoạt động và sự biến đổi trạng thái của CO; trong quá trình chiết Khí CO; lúc ban đầu trong bình chứa ở trạng thái 1 (hình 2.5), thường là áp suất
trong khoảng 45 - 55 bar, nhiệt độ 12 - 20°C Khi được hạ nhiệt độ ở điều kiện đẳng áp
từ trạng thái 1 sang trạng thái 2, CO; lỏng tới nhiệt độ 0 - 1°C và tỷ trọng tăng dân lên, ở điều kiện này CO; lỏng có thể pha trộn với các đung môi phụ trợ để dàng Quan
trọng hơn, khi CO; ở thể lỏng và có tỷ trọng cao, thì để sử dụng bơm cao áp đề nén lên
áp suất cao và điều chỉnh lưu lượng vào bình chiết thuận lợi
Qua bộ phận làm lạnh, CO; lỏng được bơm cao áp nén qua van điều chỉnh lưu lượng vào bộ phận trao đổi nhiệt để điều chỉnh tỷ trọng và độ nhớt phù hợp với yêu cầu công nghệ, CO; đạt tới trạng thái 3 bên trong bình chiết CO; lỏng từ trạng thái 3 được giữ ở điều kiện đẳng áp và tăng nhiệt độ dẫn dẫn để chuyển CO; lỏng sang trạng
thái siêu tới hạn 4 trong bình chiết
Quá trình chiết nguyên liệu thực vật bằng CO; siêu tới hạn có thể thực hiện liên tục hoặc gián đoạn tùy theo yêu cầu công nghệ Van bảo hiểm an toàn áp suất cho hệ thống chiết (màng 3 - Rupture disk - Hình 2.4) được lắp trên đường dẫn CO; vào bình
chiết
Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được dẫn vào bình phân tách Tại đây quá trình tách chất tan ra khỏi CO; Trạng thái từ 4 trở về trạng thái 5 là quá trình giảm áp Khi dịch chiết vào bình phân tach (5 — 1) dé tạo các phân đoạn khác nhau thì có thé
chọn các giá trị áp suất P và nhiệt độ thích hợp
2.2.3.2 Cách tiếu hành
Quá trình chiết tách PL được thực hiện trên thiết bị chiết siêu tới hạn SFT - 250, tại Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam Nạp 50g lecithin thé vào bình chiết 2 L
CO: ở trạng thái lỏng từ trong bình chứa khí với áp suất (50 - 55 bar) được dẫn qua
thiết bị truyền nhiệt làm lạnh xuống khoảng nhiệt độ 0 - 1C để tăng tỷ trọng dòng
dung môi CO; và được bơm cao áp (hỗ trợ bởi đòng khí có áp lực 10 bar) nén vào
bình chiết tới áp suất làm việc đã đặt trước Tiến hành gia nhiệt để đưa CO; về trạng
thái siêu tới hạn, trong quá trình chiết, trong giai đoạn 2 bổ sung dung môi phụ trợ (co-
solvent) là EtOH bằng cách đổ trực tiếp vào bình chiết hay thông qua bơm với tốc độ bơm dung môi phụ trợ 0,8 ml/phút Sau 3 giờ, giảm áp suất vẻ 45 bar bằng van điều áp, tháo dịch chiết vào bình tách có áo gia nhiệt Tại đây, CO; hóa hơi thốt ra ngồi, sản phẩm thu được là lipid trung tính (giai đoạn 1) hoặc PL (giai đoạn 2) Do đây là thiết bị thí nghiệm nhỏ nên không thu hồi CO; quá trình chiết được thực hiện gián
Trang 23Quá trình nghiên cứu các thông số công nghệ ảnh hưởng tới hiệu suất chiết PL từ leeithin thô được thực hiện cụ thể như sau:
Giai đoạn 1: loại lipid trung tính
Dựa vào tài liệu tham khảo và các khảo sát sơ bộ, chúng tôi tiến hành chiết loại lipid trung tính ở điều kiện sau: T : 40°C; P : 360 bar ; Thời gian : 120 phút Giai đoạn 2: Khảo sát các thông số tối ưu chiết phospholipid tại điều kiện: T : 30 - 70C; P : 320 — 420 bar; C : 5-20 % mol; Thời gian : 120 phút 2.2.3.3 Quy hoạch hoá thực nghiệm oie en ti
đổi và cố định các thông số còn lại, mà tất cả các thông số luôn biến thiên Do đó chúng tôi sử dụng mô hình thực nghiệm quy hoạch trực
giao bậc 2, ba yếu tố, khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng tới quá trình thực nghiệm, trong đó tắt cả các thông số khảo sát biến thiên Đó là phương pháp quy hoạch hoá thực nghiệm, gồm các bước sau (hình 2.6):
Các nghiên cứu được thực hiện trên cơ
sở mô hình thực nghiệm quy hoạch trực giao
bậc 2, ba yếu tố Sử dụng phần mềm MODDE 8.0.2 để xây dựng phương trình thực nghiệm mô phỏng kết quả trên đề thị, tối ưu hóa các thông số
Dựa vào hằm mục tiêu
tìm điều kiên tối ưu
Trang 242.2.4 Chiết phospholipid đối chứng bằng đung môi hữu cơ
Đầu tiên lecithin thô được chiết loại TG bằng aceton lạnh ở 4'C trong 2 giờ Ly
tâm tách lấy phần không tan, thêm một lượng vừa đủ EtOH, lọc tách bỏ cặn, sau đó tiến hành cắt thu hồi dung môi thu được PC tỉnh khiết Quá trình trên được mô tả trong sơ đồ đưới đây (hình 2.7): J 1.Loại TG; Sie 2 Ly tim J Cặn không tan “li 1 Hoa tan; 3 Cô 1 Hình 2.7: Sơ đồ chiết PL bằng dưng môi hữu cơ 2.2.5 Phân tích sản phẩm
Sản phẩm được phân tích bằng phương pháp HPLC - ELS có so sánh với chất
chuẩn tại phòng thí nghiệm các hợp chất sinh học, Viện Krict, Hàn Quốc với các điều kiện sau: PL chuẩn của Merk;
Cột : Agilent Prep SIL Scalar Column, 4,6 «150 mm, cỡ hạt 3 ym; Pha d6ng =: n - hexan : isopropanol : nude = 40 : 58 : 2 (v/v/v);
Detector : ELS (Evaporative Light Scattering);
Tốc độ dòng : 1,25 ml/phút;
Trang 252.3 KET QUA VA BAN LUAN 2.3.1 Qua trinh chiét lecithin thé
Từ 10 kg bột đậu nành thu được 188g lecithin thô, tương ứng với hiệu suất
0.0188 %, tương đương với kết quá trong các tài liệu tham khảo
2.3.2 Chiết phospholipid bằng phương pháp SCO;
2.3.2.1 Chiét lipid trung tính ở giai đoạn 1
Chiết loại lipid trung tính ở điều kiện sau: T = 40°C; P = 360 bar ; Thời gian = 120 phút
2.3.2.2 Tối ưu hố các thơng số ở giai đoạn 2
Tiến hành 17 thí nghiệm tại các điều kiện nhiệt độ, áp suất, nồng độ mol dung môi phụ trợ cho trước thu được kết quả được thẻ hiện trong bảng 2.1
Trang 26Trong đó:
X\, Xạ X; là các biến mã hóa của biến thực T, P, C T: nhiệt độ chiết (°C);
P: áp suất chiết (bar);
C: nồng độ đung môi phụ trợ (% mol);
Bảng 2.1 thể hiện kết quả nghiên cứu của quá trình chiết PL từ lecithin thô của đậu nành thực hiện theo phương pháp bố trí ma trận thực nghiệm kế hoạch bậc 2 trực giao 3 yếu tố Trong đó, Xạ Xạ X; lần lượt là các biến mã hóa của T, P C, cụ thể như sau: AT (ma) ap = Fon Faw) ac= Kan S i Tạ m Txv — AT P, =P - AP C, = C,, ~ AC vu touà ¥, wwe AT AP AC
Từ các kết quả thực nghiệm, phương trình hồi quy biểu điển hàm mục tiêu H (hiệu suất thu nhận PL) phụ thuộc T, P, C qua các biến mã hóa Xụ, X;, X; được xác định bằng phần mềm MODDE 8.0.2, sau khi so sánh với chuẩn Student để loại bỏ các
hệ số không có nghĩa của phương trình thu được hàm mục tiêu như sau:
H =36,6119+2,44365X, +3,28§221X, + 4,47389.Y, - 3,8219X -2,97087X} -3,85342X?
Để kiểm tra tính tương thích của phương trình hôi quy, chuẩn số Fisher được
tính toán và có giá trị 12,7 bé hơn giá trj chuan Fisher F (2; 7; 0.95) Như vậy, phương
trình hỏi quy thu được là tương hợp
Kết quả xử lý số liệu cho thấy, giá trị cực đại của hàm mục tiêu trong miền khảo sat: Hoe = 38,46 tương ứng với hiệu suất thu nhận PL cao nhất trong miền khảo
sát là 38,46% Các thông số tối ưu tương ứng là: X, = 029719 tương ứng với T„., = 55.9438°C; X> = 0,13748 tương ứng với P„, = 398,437 bar;
Trang 27Mô hình thực nghiệm quy hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố có độ tin cậy là
95%, mức ý nghĩa œ = 0.05 Để kiểm tra tính chính xác của các thông số tối ưu thu
được ở trên, chúng tôi tiến hành mô phỏng kết quả trên các đồ thị biểu điển bẻ mặt đáp
ứng và đường đồng mức (hình 2.8 - 2.13)
Bè mặt đáp ứng là tập hợp các điểm trong không gian biểu điển các giá trị của hiệu suất tại một thông số giữ cố định
Đường đồng mức là tập hợp các điểm có cùng một giá trị hiệu suất tại một thông số cố định được lựa chọn Đẻ vẽ đường đồng mức với một trong ba thông số tối
ưu, chọn một thông số có định chiếu trên mặt phẳng của hai thông số còn lại
Các giá trị của hiệu suất tại một thông số tối ưu được giữ có định theo thứ tự X; = 0.334267, X> = 0,13748, X, = 0.29719 va thay déi hai biến số còn lại, kết quả tương ứng được biểu điển trên các bề mặt đáp ứng (hình 2.8; 2.10; 2.12)
Lần lượt giữ cố định một thông số tối ưu theo thứ tự X; = 0.334267, X; = 0,13748, X, = 0,29719 chiếu trên mặt phẳng hai biến số còn lại, kết quả tương ứng được biểu diễn trên các đường đồng mức (hình 2.9; 2.11; 2.13)
Trang 28Hem teat F v.= X, = 0,13748 x 18.007 Oe X; = (29719 Hy = 37,7 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Nhiet do
Hinh 2.9: Dudng dong mize tai X; = 0,334267
Trang 29Hinh 2.10: Bé mat ddép tg tai X; = 0,13748
= x3 mm 398.437 CUSTOR `”: X; = 029719 © Xs = 0,334267 H, = 38,7
Hinh 2.11: Dudng dong mite tai X> = 0,13748 và giá trị tỗi ưu của H trén MODDE 8.0.2
Trang 312.3.2.3 Thi nghiệm kiểm chứng tại vùng tối wu
Sử dụng các điều kiện lý thuyết tối ưu tìm được, tiến hành khảo sát đối chứng trở lại với lý thuyết Thực hiện 3 thí nghiệm kiểm chứng với lượng mẫu ban đầu là 50 gam lecithin thô đậu nành tại các điều kiện thực nghiệm:
Giai đoạn 1: T = 40C, P = 360 bar, thời gian chiết 120 phút;
Giai đoạn 2: T = 56°C, P = 398 bar, C = 15 % mol, thời gian chiết 120 phút Bảng 2.2: Kết quả thực nghiệm kiểm chứng lý thuyết Giai đoạn 2 STT Hiệu suất(%) | Trung binh (%) 1 38,32 2 38.43 38, 41 3 38,49
Từ bảng kết quả thực nghiệm cho thấy, ứng với giá trị của các thông số tối ưu 3 thí nghiệm kiểm chứng đều cho kết quả xắp xỉ nhau và tương đương giá trị cực đại của hàm mục tiêu trong miễn khảo sát H,„ Như vậy, mô hình kế hoạch hóa thực
nghiệm đã mô tả sát thực với bức tranh thực nghiệm Hiệu suất trung bình của 3 lằn
chiết đạt 38,41% (~ 0,72% tính theo nguyên liệu ban đầu) 2.3.3 Chiết đối chứng bằng dung môi hữu cơ
Tir 50g lecithin thé, sau khi tỉnh chế bằng các dung môi hữu cơ thu được 12,73 PL tỉnh khiết, đạt hiệu suất 25,46% ( ~ 0,48% tính theo nguyên liệu ban đầu), thắp hơn nhiều so với phương pháp SCO»,
2.3.4 Phân tích sản phẩm
Kết quả phân tich bing HPLC — ELS cho thay (xem hình 2.14 - 2.17):
Đối với sản phẩm chiết ở giai đoạn ! (hình 2.15): Thành phần chính là lipid
trung tính với hàm lượng 94,37% chỉ có 5,63% là PL (PI, PE, PC) Điều này khẳng định tính chọn lọc khi chiết lipid trung tính của dung méi SCO, rat cao, hầu như không
hòa tan các PL phân cực
Trang 32khi đó, sản phẩm chiết đối chứng bằng phương pháp dung môi hữu cơ (hình 2.17) hàm lượng PC chỉ đạt 51,10% và có lẫn cả các thành phần không mong muến như
lipid trung tính 4,69%, PA 3,40%
Như vậy, có thể thấy công nghệ chiết bằng SCO; cho kết quả vượt trội hơn hẳn cả về chất lượng lẫn số lượng PL so với công nghệ chiết bằng dung môi truyền thống Sản phẩm chiết suất bằng phương pháp SCO; có độ tỉnh khiết cao hơn so với phương pháp chiết suất bằng dung môi thông thường Đồng thời phương pháp SCO; khá hiệu
quả trong việc loại bỏ phân lipid trung tính không cần thiết và làm giàu PL lecithin thô
đậu nành sau giai đoạn một
Bảng 2.3: Kết quả phân tích HPLC - ELS của PL Hàm lượng (%) STT Thành phần Á Thời gian lưu (phút)
Trang 34© hp th (V) â ơ 0 2 #4 6 8 0 «12 14 Time (min)
Hinh 2.17: Sdc kp dé HPLC aia sdn phdm chiét bang dung mi 2.3.5 Quy trình công nghệ chiết phospholipid bằng SCO,
Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi để xuất quy trình công nghệ chiết tách PL từ đậu nành bằng phương pháp SCO; như sau:
1) Chiết đầu thô từ đậu nành bằng n - hexan;
2) Thủy hóa dầu thô với 2% H;O (v/v) ở 70°C trong 1 gid thu nhận lecithin thé: 3) Tách loại lipid trung tính từ lecithin thé bang SCO, 6 cac điều kiện sau:
+T :40°C;
+P : 360 bar ; + Thời gian : 120 phút
4) Chiết PL tir lecithin thô (sau khi đã tách loại lipid trung tính) bằng SCO; ở các điều kiện sau:
+T : 560C; +P : 398 bar;
+€ :15% mol (EtOH);
Trang 352.4 BAN LUAN CHUNG
2.4.1 Về lựa chọn nguyên liệu và phương pháp
Chúng tôi tiến hành chiết và tinh chế PL từ hạt đậu nành theo hai phương pháp: chiết và tỉnh chế PL bằng SCO; và đối chứng với phương pháp dung môi
Hạt đậu nành là nguồn nguyên liệu thực vật lớn trên thế giới, có nhiều ứng dụng trong thực tế Đậu nành không những là thực phẩm rất tốt cho con người (sữa đậu
nành, đầu đậu nành) và gia súc, mà hai thành phần chính của đậu nành (dầu và protein) còn có những ứng dụng quan trọng trong công nghiệp hóa chất như: sơn và mực in,
chất kết dính, chất bôi trơn, chất đẻo và composit, hóa chất chuyên đụng (như dung môi, chất hoạt động bề mặt, thuốc bảo vệ thực vật) - chúng có thẻ cạnh tranh một cách
có hiệu quả với những sản phẩm hóa chất làm từ nguyên liệu đầu mỏ Phần lớn chúng
được làm từ dầu đậu nành - một trong những nguồn axit béo phong phú nhất và rẻ nhất Hơn nữa, do có khả năng bị phân hủy sinh học và độc tính thấp nên các sản phẩm
làm từ đầu đậu nành đều rất có lợi cho việc bảo vệ môi trường
Dựa trên thực tế đó, chúng tôi lựa chọn hạt đậu nành là nguyên liệu chiết PL
Mặc dù hàm lượng PL trong đậu nành chiếm tỷ lệ thấp (1 - 2%) [29] nhưng tỷ lệ PL
trong lecithin thô đậu nành khá cao (`~ 55,29%) [22] Trong công nghiệp, lecithin là
sản phẩm phụ của quá trình sản xuất dầu thực vật không chỉ từ hạt đậu nành mà từ nhiều nguồn nguyên liệu khác như: oliu, cọ, bông Hơn nữa, lecithin là nguyên liệu
chiết PL, và là nguyên liệu ứng dụng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm (chất nhũ hóa), ngành công nghiệp được (chất điện hoạt)
Vi vậy, với nguồn nguyên liệu đậu nảnh sẵn có, rẻ tiền trong nước và đồng thời tận dụng được nguồn phế phẩm là sản phẩm phụ trên, chúng tôi lựa chọn quy trình
chiết PL theo như mô tả trong thiết kế nghiên cứu (hình 2.3)
2.4.2 Về quá trình chiết và tỉnh chế phospholipid
Tầm quan trọng về mặt sinh học của PL đã được nhiều tài liệu công bố: như vai
trò tham gia cấu tạo màng sinh học [3], vai trò làm tiền chất của chất truyền tin thứ hai
[I] Trong ngành được, PL được dùng làm nguyên liệu đẻ chế tạo chất mang thuốc
dạng liposom, nhằm tập trung tối đa lượng thuốc tại đích, nâng cao hiệu quả điều trị
đồng thời giảm độc tính và tác dụng phụ
Trang 36dựng mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất, từ đó đưa ra các thông số công nghệ tối ưu của quá trình chiết xuất
Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp cổ điển (có nghĩa là lần lượt thay đổi từng thông số, trong khi giữ nguyên các thông số còn lại với giả thiết các
thông số đó độc lập, không ảnh hưởng đến nhau) có hạn chế là khi các yếu tế ảnh hưởng tăng lên thì khối lượng thí nghiệm cũng tăng lên nhiều lần Do đó cần phải xây dựng chiến lược tiến hành thực nghiệm một cách chủ động trên cơ sở phương pháp xử
lý số liệu hiện đại, đó là phương pháp quy hoạch hoá thực nghiệm Trong phương
pháp quy hoạch hoá thực nghiệm trực giao bậc hai, ba biến, các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện cả ba biến đều biến thiên và tính hiệu suất thu được Xử lý số liệu hiệu suất bảng phần mềm MODDE 8.2.0 xây đựng được một hàm bậc hai mô tả sự phụ thuộc của hiệu suất H vào các biến T, P, C
Chúng tôi đã tiến hành phân tích sản phẩm thu được từ hạt đậu nành bằng SCO;
với mẫu so sánh được chiết bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ thông
thường
Đã có nhiêu tranh luận vẻ việc chiết PL từ hạt đậu nành và các sản phâm của đậu nành bằng phương pháp dung môi, mặc dù một số tiến trình chiết suất của đã được đưa ra như: chiết nhanh với chlorofon/methanol: 2/1 (v/v) theo phương pháp của Folch; chiét Soxhlet bằng điethylether trong 16 giờ; chiết Soxhlet bằng benzen/EtOH : 4/1 (v/v) trong 16 giờ; hạt được ngâm nước 14 giờ trước khi chiết theo phương pháp của Folch, chúng tôi lựa chọn chiết và tinh chế PL từ hạt đậu nành đã qua sơ chế theo tiến
trình chiết đầu đậu nành trong công nghiệp Thực chất là tiến trình chiết và tinh chế PL
tir lecithin thé đậu nành
Nhược điểm chính của phương pháp này là cần một lượng lớn dung môi (n -
hexan, aceton, EtOH), tốn kém vẻ thời gian và kinh phí để loại dung mỗi đó Hơn nữa,
nhiệt độ cao trong suốt quá trình cất thu hồi dung môi ảnh hưởng tới chất luợng sản
phẩm Ngoài ra, dư lượng n - hexan còn trong dịch chiết làm cho sản phẩm có vị đắng nên không phù hợp cho con người sử đụng Vì vậy, SCO; có thẻ là một cách lựa chọn có lợi cho các sản phẩm chiết
Trang 37loại phan lipid trung tính lựa chọn điều kiện chiết tối uu: T = 56°C, P = 398 bar, C =
15% mol EtOH thời gian: 120 phút
EtOH được lựa chọn làm dung môi phụ trợ (co-solvent) bởi vì: EtOH là dung môi được chứng nhận là an toàn; độ tan của PC trong EtOH cao hơn độ tan các PL
khác trong EtOH [22];
Qua thực nghiệm kiểm chứng, chiết PL từ lecithin thô bằng SCO; có những ưu
điểm sau: sản phẩm có độ tỉnh khiết cao: hàm lương PC/PL chiết bằng SCO; (73,49%) cao hơn chiết bằng dung môi (51,10%); hiệu xuất chiết cao: hiệu suất PL/lecithin thô chiết bằng SCO; (36,48%) cao hơn chiết bằng dung môi (25,47%); có tiềm năng triển khai sản xuất theo quy mô công nghiệp
Như vậy sản phẩm PL chiết bằng phương pháp SCO; có độ tỉnh khiết cao hơn so với phương pháp chiết bằng đung môi thông thường Sản phẩm thu được có độ tỉnh khiết cao, đặc biệt SCOzx/EtOH chiết chọn lọc PC Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng của phương pháp SCO; trong chiết xuất PL có hiệu suất và độ tỉnh khiết cao với mục đích sử dụng làm nguyên liệu chế tạo dạng mang thuốc liposom trong tương lai
Với kết quả nghiên cứu đạt được chúng tôi hy vọng góp phần vào việc hồn thiện
cơng nghệ chiết xuất PL từ hạt đậu nành bằng phương pháp SCO)
2.4.3 Về tiềm năng ứng dụng của phospholipid
Trong thực tế, PL được ứng dụng trong nghiên cứu cấu tạo màng tế bào, chất diện hoạt phối Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chế tạo liposom - chất mang thuốc tới đích với nguồn nguyên liệu chính là PL (chủ yếu là PC) Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng của phương pháp SCO; trong chiết xuất PL có hiệu suất và độ tỉnh khiết cao phù hợp với mục đích sử dụng làm nguyên liệu chế tạo dạng
Trang 38KET LUAN
Sau một thời gian thực tập tại trung tâm Hóa thực vật - Viện Hóa học công
nghiệp Việt Nam, chúng tôi thu được các kết quả sau:
1 Đã tiễn hành chiết lecithin thô từ hạt đậu nành khô bằng dung môi hữu cơ đạt hiệu suất 0,0188%:
2 Đã nghiên cứu quá trình tách loại lipid trung tính từ lecithin thô bằng phương pháp SCO; ở các điều kiện: nhiệt độ 40°C, áp suất 360 bar, thời gian 120 phút 3 Đã nghiên cứu quá trình chiết tách PL tir lecithin thô (sau khi đã tách loai lipid)
bằng SCO; Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật như T, P € tới hiệu suất của quá trình chiết xuất, từ đó đưa ra các thông số công nghệ tối ưu
cho giai đoạn chiết PL từ lecithin thô đậu nành đã loại đầu:
Hoo: = 38,46 tương ứng với hiệu suất chiết PL là 38,46% tại các thông số tối ưu: Tope ™ 55,9438°C; Poe ® 398,437 bar; Coy = 15,007 % mol
Các thí nghiệm kiểm chứng cho kết quả ổn định với hiệu suất trung bình thu
được 38,41% (~ 0,72% tính theo nguyên liệu ban đầu)
4 Đã tiến hành chiết mẫu đối chứng bằng dung môi hữu cơ, hiệu suất đạt 25,47% ( ~ 0,48% tính theo nguyên liệu ban đầu), thấp hơn nhiều so với phương pháp SCO)
5 Đã phân tích, xác định thành phần của phospholipids bằng HPLC - ELS Két qua cho thấy, trong sản phẩm chiết bing SCO), thanh phan chủ yếu của PL là PC - chiếm tới 73,49% Trong khi sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ, hàm
lượng PC chỉ đạt 51,10% và có lẫn cả các thành phần không mong muốn như
Trang 39DE XUAT
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chỉ đừng lại ở việc bước đầu xác
định các điều kiện tối ưu chiết xuất phospholipid bằng phương pháp SCO; từ hạt đậu nành khô Trong thời gian tới, chúng tôi dé nghị tiếp tục nghiên cứu những vấn dé sau:
I Chiết PL từ nguyên liệu ban đầu là lecithin thô - sản phẩm phụ trong quá
trình sản xuất dau dau nành trong công nghiệp
2 Xây dựng hệ thống các tiêu chuẩn phospholipid làm nguyên liệu chế tạo
liposome
Trang 40TAI LIEU THAM KHAO Tiếng việt
[1] Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Hóa Sinh, (2005), #oá sinh học, NXB Y học, Tr 39 — 50, 338-377
[2] Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Bào Chế, (2005), Một số chuyên đề vẻ
bào chế hiện đại NXB Y học, Tr 39 — 50
[3] Trường Đại học Dược Hà Nội - Bộ môn Dược Lý, (2005), Giải phẩu sinh by, NXB Y hoc
[4] Nguyén Thj Xuan Lé, Tach chiết phospholipid từ một số tổ chức động vật đề chế tao liposome, Khoa luận tốt nghiệp được sĩ 2001 Đại học Dược Hà Nội
{5} Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Tr 930 — 931
{6} Võ Xuân Minh, Dạng thuốc tác dụng tại đích, Chuyên dé cao học 1996
[7] Nguyễn Xuân Thắng, (1971), Các phương pháp hoá sinh hiện đại - tập 2 NXB KHKT, Tr 174 -187
[8] Bùi Minh Trí, Xác Suất Thống Kẻ Và Quy Hoạch Thực Nghiệm, NXB KHKT
[9] Vũ Đình Vinh, Đặng Hạnh Phức, Đỗ Đình Hỏ, (1974), Kỹ thuật sinh hóa, Đại học quân Y, tr 427 — 429
[10] Nghiên cứu công nghiệp chiết tách một số chế phẩm thiên nhiên có giá trị kinh tế cao bằng CO; lỏng ở trạng thái siêu tới hạn, Viện hóa học công nghiệp Tổng công ty