Nghiên cứu phương pháp chiết xuất syringin từ ngũ gia bì hương acanthopanax gracìlistỵlus w w smith

Nghiên cứu phương pháp chiết xuất syringin từ Ngũ gia bì hương Acanthopanax gracìlistỵlus w w Smith N g uyễn T h ị Bích T hu , Đ ỗ T h ị Hà Viện Dượcliêu SUMMARY: Study on chemical constituents o f stem cortex ofAcanthopanax gracilistylus resulted in extraction and isolation o f one major compound named syringin (1) The structures o f had been elucidated based on the 1D-NMR, MS, uv, IR spectra and physico chemical properties and reported data Từkhóa;Acanthopanaxgracilistylus, syringin, VỎ thân Đặt vấn để sơ đánh giá hàm lượng hợp chất vỏ thân cao vỏ rễ Vì vậy, tiến hành đề Ngũ gia bì hương (NGBH) có tên khoa học Acanthopơnax gracilistylus w w Smith, loài tài nghiên cứu chiết xuất hoạt chất loài NGBH thu hái Việt Nam thuộc họ Ngũ gia bì hay Nhân sâm Trong dân gian, vỏ rễ vỏ thân NGBH sử dụng làm thuốc Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu bổ, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, tăng thể lực, chữa đau lưng, tê chân, trẻ em chậm biết bổi bổ cho Nguyên liệu phụ nữ sau sinh [1 ] Trên giới có số nghiên cứu vể thành phẩn hóa học loài NGBH, nhiên chủ yểu công trình công bố nhóm tác giả Trung Quốc Thành phần hóa học tìm thấy loài A Mẫu nghiên cứu vỏ thân loài ngũ gia bì hương Acanthopanax gracilistylus w w Smith Khoa Tài nguyên - Viện Dược liệu thu hái xác định tên khoa học Mẫu nghiên cứu lưu bảo quản Phòng Tiêu - Khoa Tài nguyên - Viện Dược liệu gracilistylus gổm sỵringin, 4-methoxysalirylaldehyd, alcaloid, saponin [3,4], sesamin, acid kaurenoic, 16-a-hydroxy-kauran-18 oic acid acid stearic [5], Methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc) đểu đạt tiêu chuẩn công nghiệp Syringin biết đến chất có mật chưng cất lại trước dùng Dung môi phân vỏ rễ loài Ngũ gia bì hương, chất tích gồm MeOH, EtOH, Hx, EtOAc, HjO dùng để phân phân lập từ năm 1971 nhóm tác giả người tích sắc ký đểu đạttiêu chuẩn phân tích Chất nội chuẩn Hóa chất Nhật, nhiên sau có nhiều tác giả công bố tetramethỵl silan tinh khiết phân tích Sigma có mặt syringin loài thực vệt khác Aldrich, Mỹ Silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, nhau, Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên Merck), sephadexTM LH-20 (Amersham Bioscience, cứu toàn diện vể thành phẩn hóa học, đặc biệt Uppsala, Thụy Sỹ), Diaion HP-20 (Mishubishi Chem chiết xuất phân lập hoạt chất loài Indo Co Japan) SKLM thực mỏng NGBH thu hái Việt Nam Sơ đánh giá vể thành tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0.25 phần hóa học NGBH cho thấy có mặt mm) mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0.25 chất vỏ thân vỏ rễ NGBH Trong mm) Acid HjSO^ 10 % ethanol Trang thiết bị Máy cất quay Rotavapor R-200, Buchi (Đức) Tủ sấy Binder (Đức) Phát chất đèn tử ngoại UV-VIS (Viện Dược liệu) Điểm chảy đo máy Kofler micro-hotstage (Viện Dược liệu) Phổ tử ngoại khả kiến ghi máy UV-VIS Cary (Viện Dược liệu) Phổ hồng ngoại đo máy impact 410 Kết nghiên cứu Định tính nhóm chất phản ứng hóa học đặc trưng sơ xác định có mặt nhóm chất nhưcoumarin, saponin, alkaloid, acid hữu cơ, tannin, đường khử, chất béo, sterol vỏ thân vỏ rễ NGBH - Nicolet Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spraỵ Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) Phân lập nhận dạng hợp chốt từ vỏ thân NGBH đo máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap Viện phân đoạn tương ứng sửdụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định hướng phân lập hợp Hoá học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo máy JEOL 300 MHz-NMR (Khoa Dược, Đại Học Chosun - Hàn Quốc) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp định tính Dịch chiết toàn phẩn EtOH 96% từ vỏ than NGBH chất Tiến hành SKLM hệ dung mội CHCI3 - MeOH (5:1), màu dung dịch H^so^ 10% ethanol, kết thể Hình 1A Dựa vào sắc ký đổ thấy, chất vỏ thân NGBH nằm chủ yếu pha nước Định tính nhóm chất phản ứng hóa học đặc trưng [2 ], Phương pháp chiết xuất phán lập Vỏ thân Ngũ gia bì hương Acanthopanax graciHstylus w w Smith (10 kg) sau thu hái, rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ chiết nóng với cồn 96% nhiệt độ 80“C hai lẩn lần 3h Gộp dịch chiết, lọc, thu hổi dung môi áp suất giảm thu cao toàn phần (330 g) Thêm nước lắc lẩn lượt với n-Hx, EtOAc, gộp dịch chiết it Hx EtOAc H ,0 TP phân đoạn thu hồi dung môi áp suất giảm thu cặn n-Hx (38,8 g), EtOAc (32,8 g) nước (258,4 g) sắc ký lớp mỏng thăm dò cho p h â n đ o ạn nư ớc Hmh Sổc kỷ đố định hướng phương pháp chiẾ m ăĩ hợp chót từ vỏ thân Ngũ gio bì hương Kỷ hiệu:[A: Hx: phân đoạn n-hexon, EtOAc phân đoạn [tOAc, H f : phân đoợn nưà, TP: Cao toàn phân]: [B: ỉ: cao tễnq;D; Ag-S-D l: Ag-S-D2; Oy Ag-S-D3; Ag-S-ÍXl Phân đoạn nước tiến hành phân lập sắc kí cột, chất nhồi Diaion HP-20, rửa giải hệ dung môi HjO - EtOH (gradient) thu phân đoạn (Ag-S-HjO-D1 -> Ag-S-H2 -D4 ) Từ phân đoạn Ag-S-Hp-DI, tiến hành sắc ký Phân đoạn nước triển khai cột Diaion HP-20 với hệ dung môi H^O-MeOH (100: 0; 75:25; 50:50; 0:100), gradient thu phân đoạn (D1 >D4) Tiến hành khảo sát phân đoạn thấy hàm lượng chất tập trung chủ yếu cột silica gel pha thường với hệ dung môi C H jC lj: MeOH (10:1) thu phân đoạn Ag-S-D2.1 > SKLM, sử dụng hệ dung môi CHjClj-MeOH Ag-S-D2.9 ethanol, kết thể Hình 1B Nhìn vào (5:1), màu dung dịch H^so^ 10% Tinh chế lại phân đoạn Ag-S-D2.6 cột sắc ký sắc ký đồ cho thấy chất NGBH nằm chủ pha đảo YMC C-18, rửa giải hệ dung môi MeOH yếu phân đoạn D2, phân đoạn - HjO ( : ), gộp phân đoạn chất tinh khiết, cất thu tiến hành chạy cột sắc ký để phân lập chất hồi dung môi áp suất giảm, kết tinh lại thu Từ phân đoạn nước dịch chiết cồn 96% chất dạng tinh thể, màu trắng ký hiệu vỏ thân NGBH, hợp chất ký hiệu Ag-S-T, Ag-S-TI (3.2 g) ( ) phân lập xác định cấu trúc Nhận dạng cấu trúc hợp chất Ag-S-TI (1 ) Hợp chất chất kết tinh dạng tinh thể hình kim màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy 195.2-196.2“C Phổ uv đo dung môi methanol quan sát hai đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng Ầ=221 265 lập từ vỏ thân NGBH: Tinh thể hình kim màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 195,2-196,2“C; Phổ u v (MeOH): Ầ 221, 265 nm; Phổ IR (KBr): V 3296 (OH), 2931 (CH3 ), 2853 (CHj), 1468,1064 (C-Ổ)7730,719 em '; ESIMS m/z = 373.37 [M+H]% CTPT: 'H-NMR (400 MHz, pyridin-d^), 3.77 (3H, s, Ì-O C H ), 3.97 nm Phổ IR quan sát thấy có mặt nhóm chất đặc trưng nhóm hydroxyl (OH), liên kếtC-H, (1H, m, H-4'), 4.33 (1H, m, H-5'), 4.34-4.39 (2H, m, c=c, nhóm C-0 Các tín hiệu nhận biết dựa phổ ’H-NMR '^C-NMRcủa cho thấy sựcó mặt phân tử đường gắn với aglycon Phẩn aglycon H-6 'b), 4.62 (1H, d, 2.9, H-9), 5.85 (1H, d, 7.0, H-1 '), 6.65 (1H, dt, 15.8,2.9, H-8 ), 6.90 (1H, d, 15.8, H-7), 6.91 (2H, s, H-2, H-6 ); ’^C-NMR (100 MHz, pyridin-d” ): 57.0 có (3,5-0CH3), 63.1 (C-9), 62.3 (C-6 '), 72.1 (C-4'), 76.6 (C- tín hiệu cacbon có độ chuyển dịch hóa học H-1 H-2'), 4.41 (1H, dd, 4.3,11 , H-6 'a), 4.40 (1H, m’ ^ (105.6-154.4) cho thấy có 2'), 78.9 (C-3'), 79.3 (C-5'), 105.4 (C-1 '), 105.6 (C-2, C-6 ), mặt vòng thơm, liên kết C=C; tín hiệu 129.8 (C-7), 131.7 (C-8 ), 135.7 (C-4), 135.7 (C-1), 154.4 cacbon có độ chuyển dịch hóa học (C-3,C-5) vùng trường thấp (62.3) liên kết CHj-OH mạch hở Trên phổ 'H nhận thấy vòng thơm vị trí có vị trí xuất Bàn luận tín hiệu đơn có độ chuyển dịch hóa học 5^ 6.91 chứng tỏ chúng vị trí meta Trong sổ nhóm vòng thơm xác định dựa tín hiệu phổ có nhóm methoxy vị trí meta có giá trị chuyển dịch hóa học 3.77, nhóm 3-hydroxy-1-propen có giá trị chuyển dịch hóa học tương đương 6.90 (1H, d, 15.8), 6.65 (1H, dt, 15.8,2.9), Kết nghiên cứu chiết xuất phân lập hợp chất từ NGBH thu chất xác định syringin hay có tên khác eleuthrosid B Hợp chất chứng minh sổ tác dụng sinh 4.62 học như: tác dụng chổng viêm chuột chế chúng tác dụng chống viêm [7], tác dụng (1H, d, 2.9) Ngoài ra, phân tử đường xác hạ huyết áp [8 ], tác dụng kích thích tăng giải phóng định đường glucose nhận biết thông qua tín insulin liên quan đến tăng hoạt động giao cảm hiệu phổ cacbon proton đặc trưng [63.3 (C-6 '), 72.1 (C-4'), 76.6 (C-2'), 78.9 (C-3'), 79.3 (C-5'), 105.4 (C- chuột có ý thức [9], tác dụng tăng cường giải phóng acetylcholin, kích thích thụ thể muscarinic M3 1') 3.97 ( H, m, H-4'), 4.33 (1H, m, H-5'), 4.34-4.39 (2H, m, H-1 H-2'), 4.41 (1H, dd, 4.3,11.8 , H-6 'a), 4.40 tế bào tuyến tụy làm tăng trình giải phóng insulin dẫn đến hạ đường huyết [10] Kết thực nghiệm phát có mặt syringin thời vỏ thân vỏ rễ loài NGBH thu hái Việt Nam (1H, m, H-6 'b, 5.85 (1H, d, 7.0, H-1')] Trong đó, giá trị số liên kết J = 7.0 Hz, xác định H-V liên kết H-2',điểu cho biết phân tử đường dạng b-glucose So sánh với liệu phổ chất chuẩn Kết luận sỵringin tài liệu công bố trước nhận thấy syringin (Hình 2) [3,6] Nghiên cứu thành phẩn hóa học dược liệu NGBH xác định thành phần nhóm chất vỏ thân vỏ rễ NGBH, gồm coumarin, saponin, alkaloid, acid hữu cơ, tannin, đường khử, chất béo, sterol Ngoài kết nghiên cứu chiết xuất phân lập hợp chất S y rin g in Hình Cáu trúc hóa học hợp ch& syringin từ vỏ thân NGBH Đây công bố đáu tiên Việt Nam phương pháp chiết xuất hợp chất syringin NGBH thu hái Việt Chi tiết liệu phổ hợp chất syringin phân Nam Đồng thời, nghiên cứu định hướng cho ề công tác kiểm nghiệm dược liệu dược liệu NGBH dựa chất đối chiếu syringin Lời cảm ơn: Nghiên cứu sựtài trợ Để tài cấp Bộ Y tế năm 2011 -2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Viện Dược liệu (2003), Cày thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, II, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 410-415 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ tháo dược, Giáo trình sau đại học, Tập II, NXB Khoa học & kỹ thuật, Hà Nội Liu XQ, Chang SY, Park SY, Nohara T, Yook cs (2002), "Studies on the constituents of the stem barks of Acanthopanơxgracilistylus w w Smith", Nat Prod Sci, 8(1), 23-25 Xian L N., Qian s H., Li z L (2010), "Study on the chemical constituents from the stems of Acanthopanax gracilistylus.", JChin Med Mat, 33(4), 538-542 Yook c S., Liu X Q., Chang s Y., Park s Y„ Nohara T (2002), "Lupane triterpen-glycosides from the leaves of Acanthopanaxgradlistylus", Chem Pharm Bull, 50(10), 1383-1385 Sutarjadi T„ Malingre M., Van Os F.H.S (1978), "Iridoid and phenolic glycosides of Fraxinus grifithii.", Phytochemistry, 17,564-567 Song Y Y., Li Y., Zhang H Q (2010), 'Therapeutic effect of syringin on adjuvant arthritis in rats and its mechanisms", Acta Pharm Sin, 45(8), 1006-1011 Admad M„ Aftab K (1995), "Hypotensive action of syringin from Syringa vulgaris", Phytother Res., 96(6), 452-454 Niu H S., Hsu F L , Uu I M (2008), "Role of sympathetic tone in the loss of syringin-induced plasma glucose lowering action in conscious Wistar rats", Neurosci Lett, 445 (1), 113-116 10 Liu K Y., Wu Y c., Liu I M., Yu w c, Cheng J T (2008), "Release of acetylcholine by syringin, an active principle of Eleutherococcus senticosus, to raise insulin secretion in Wistar rats", NeurosdLett, 434(2):195-9  ... hóa học đặc trưng [2 ], Phương pháp chiết xuất phán lập Vỏ thân Ngũ gia bì hương Acanthopanax graciHstylus w w Smith (10 kg) sau thu hái, rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ chiết nóng với cồn 96%... Ngoài kết nghiên cứu chiết xuất phân lập hợp chất S y rin g in Hình Cáu trúc hóa học hợp ch& syringin từ vỏ thân NGBH Đây công bố đáu tiên Việt Nam phương pháp chiết xuất hợp chất syringin NGBH... Việt Nam Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo máy JEOL 300 MHz-NMR (Khoa Dược, Đại Học Chosun - Hàn Quốc) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp định tính Dịch chiết toàn phẩn EtOH 96% từ vỏ than NGBH chất