Nghiên cứu chiết tách azadirachtin từ hạt neem bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC LÊ THỊ ANH KHUYÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TỪ HẠT NEEM BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾT VỚI DUNG MÔI HỮU CƠ ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Đà Nẵng, 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TỪ HẠT NEEM BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾT VỚI DUNG MÔI HỮU CƠ ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HĨA HỌC Khóa học: 2013 - 2017 Sinh viên thực Lớp : Lê Thị Anh Khuyên : 13CHP Giáo viên hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Bá Trung Đà Nẵng, 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐHSP KHOA HÓA CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Thị Anh Khuyên Lớp: 13CHP Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách azadirachtin từ hạt neem phương pháp chiết với dung môi hữu để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị 2.1 Thiết bị Cột sắc ký : Thermo - Acclaim C18 (4,6mm x 150 mm, 3µm) Cân phân tích; Bể siêu âm; Máy cô quay chân không; 2.2 Dụng cụ Một số dụng cụ thủy tinh cốc, đũa, lọ số dụng cụ khác 2.3 Hóa chất, nguyên liệu Hạt neem phơi khô; Azadirachtin chuẩn (95%) Hexan, Metanol Tetraclorua cacbon Sodium chloride Ethyl acetate Acetonitril Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu quy trình tách azadirachtin Xây dựng quy trình xác định hàm lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến độ bền azadirachtin Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Trung Ngày giao đề tài: ngày 01 tháng 07 năm 2016 Ngày hoàn thành: ngày 15 tháng 04 năm 2017 Chủ nhiệm Khoa (Ký ghi rõ họ, tên) Giáo viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa ngày 28 tháng 04 năm 2017 Kết điểm đánh giá: Ngày … tháng … năm … CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Nguyễn Bá Trung - người thầy đầy tâm huyết trực tiếp truyền thụ cho em kiến thức quý báu từ ngày đầu làm quen với đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Thầy Em xin chân thành cảm thầy cô giảng dạy môn thầy cô công tác phịng thí nghiệm khoa Hóa- trường Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng dạy dỗ, tạo điều kiện cho em làm việc tốt phịng thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo chủ nhiệm Đinh Văn Tạc tập thể sinh viên lớp 13CHP tận tình giúp đỡ, động viên em suốt thời gian tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình ủng hộ lớn mặt tinh thần cho em thời gian học tập giảng đường đại học thời gian em làm khóa luận tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày 27 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Anh Khuyên MỤC LỤC Lý chọn đề tài .1 Mục đích nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .3 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu .3 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết .3 Phương pháp thực nghiệm t c n n HƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 THUỐC TRỪ SÂU 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.2 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 1.3 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC CÓ NGUỒN GỐC TỪ NEEM 1.3.1 Neem 1.3.2 Vai trò neem 13 1.3.3 Các ứng ụng khác neem .14 1.3.4 Các thành phần chiết su t từ neem 15 1.3.5 Thuốc trừ sâu sinh học từ ch t azadirachtin chiết xu t từ nhân hạt neem 17 HƯƠNG 19 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 19 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 19 2.1.1 Nguyên liệu .19 2.1.2 Hóa ch t 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 20 2.2.1 Chiết tách azadirachtin .20 2.2.2 Phân tích azadirachtin phương pháp sắc kí lỏng cao áp 21 2.2.3 Định ượng azadirachtin phương pháp phân tích sắc kí lỏng cao áp 28 2.2.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng độ bền azadirachtin 29 2.2.4.4.Đánh giá hoạt tính tiêu diệt sâu azadirachtin 30 HƯƠNG 31 3.1 Â NG U NH PHÂN H I H IN NG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HPLC 31 3.1.1 Tối hóa q t ình 31 3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 32 3.2 CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TRONG NHÂN HẠT NEEM 34 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ BỀN CỦA AZADIRACHTIN .36 3.3.1 Ảnh hưởng ng i 36 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 38 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ 39 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG IỆT SÂU BỌ .41 3.4.1 Sâu lông 41 3.4.2 Đánh giá khả n ng azadirachtin sâu lông 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết lu n 47 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Danh sách hóa chất sử dụng để định lượng Azadirachtin phương pháp HPLC 20 Bảng 2 So sánh sắc ký pha thường pha đảo 24 Bảng Tính chất số pha động 25 Bảng Kết phân tích hàm lượng azadirachtin thực theo quy trình chiết dung môi hữu .35 Bảng Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung mơi theo thời gian nhiệt độ phịng 37 Bảng 3 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian nhiệt độ 38 Bảng Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung mơi methanol theo thời gian nhiệt độ phịng 40 Bảng Thống kê thời gian gây chết 50% 100% mẫu azadirachtin nồng độ thử nghiệm 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cây neem 10 Hình Hạt neem khô hạt neem tách vỏ 11 Hình Hoa neem 11 Hình Sự biến đổi thuốc trừ sâu đất 13 Hình Các thiết bị hệ thống HPLC 22 Hình 2 Thời gian lưu 26 Hình Hình ảnh peak 28 Hình Sắc kí đồ HPLC mẫu azadirachtin chuẩn 100 ppm 32 Hình Đường chuẩn mô tả phụ thuộc nồng độ azadirachtin diện tích peak sắc ký 33 Hình 3 Sắc kí đồ HPLC mẫu azadirachtin 100 ppm chiết tách dung môi hữu hệ dung môi pha động Acetonitrile : H3PO4 0,1% 36 Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi theo thời gian nhiệt độ phòng 37 Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian nhiệt độ khác 39 Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi methanol theo thời gian nhiệt độ phòng 40 Hình Đặc điểm, hình thái sâu lơng 41 Hình Biểu sau say thuốc chết sâu xử lý với azadirachtin 44 Hình Sự phụ thuộc thời gian gây chết 50% 100% vào nồng độ mẫu azadirachtin thử nghiệm 45 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong kinh tế quốc dân vai trò ngành nông nghiệp vô quan Ngành nông nghiệp ngành kinh tế quan trọng phức tạp Nó khơng ngành kinh tế đơn mà hệ thống sinh học – kỹ thuật, mặt sở để phát triển nông nghiệp việc sử dụng tiềm sinh học – trồng, vật ni.Ngành Nơng nghiệp có nhiều vai trị quan trọng như: - Ngành nơng nghiệp cung cấp lương thực thực phẩm cho nhu cầu xã hội - Cung cấp yếu tố đầu vào cho phát triển công nghiệp khu vực đô thị - Làm thị trường tiêu thụ công nghiệp dịch vụ - Nông nghiệp tham gia vào xuất - Nông nghiệp có vai trị quan trọng bảo vệ mơi trường Trong đó, vai trị vai trị chủ yếu quan trọng Vì nơng nghiệp ngày phát triển loại phương thức sản xuất Xã hội phát triển, đời sống người ngày nâng cao nhu cầu người lương thực, thực phẩm ngày tăng số lượng, chất lượng chủng loại.Thực tiễn lịch sử nước giới chứng minh, phát triển kinh tế cách nhanh chóng, chừng quốc gia có an ninh lương thực Trong thời đại ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm vấn đề cần quan tâm Trên phương tiện thông tin đại chúng ngày thấy tin tức bị ngộ độc thực phẩm, ảnh hưởng dư lượng thuốc trừ sâu tích lũy thể thời gian dài… Ảnh hưởng hóa chất BVTV biết tính chất đặc trưng tiêu diệt sâu hại nhanh, nâng cao suất, làm cho thực phẩm nhìn “ngon mắt” nhà vườn, người làm nơng nghiệp ln sử dụng hóa chất BVTV, thuốc kích thích tăng trưởng…Một hậu tất yếu tránh gây ô nhiễm nguồn nước đất, để lại dư lượng nông sản, gây độc cho người nhiều lồi động vật máu nóng, gây cân sinh thái, xuất loài dịch hại mới, tạo tính chống thuốc dịch hại làm đảo lộn mối Hình 3 Sắc kí đồ HPLC mẫu azadirachtin 100 ppm chiết tách dung môi hữu hệ dung môi pha động Acetonitrile : H3PO4 0,1% ứng với tỉ lệ 40 V : 60 V 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN ĐỘ BỀN CỦA AZADIRACHTIN Như biết, azadirachtin không bền nhiệt độ cao, môi trường dung mơi phân cực với có mặt acid base azadirachtin dễ bị thủy phân, làm thay đổi cấu trúc, dẫn đến biến đổi hoạt tính sinh học vốn có Chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nhiệt độ, nồng độ đến độ bền azadirachtin thông qua đánh giá % azadirachtin bị phân hủy, từ xác định điều kiện tối ưu để bảo quản azadirachtin với mục tiêu nhằm trì ổn định hoạt tính sinh học azadirachtin chiết tách 3.3.1 Ảnh hƣởng dung môi Dung môi yếu tố quan trọng định độ bền azadirachtin Trong môi trường nước, azadirachtin dễ bị thủy phân làm thay đổi cấu trúc Chúng tiến hành nghiên cứu loại dung môi cách pha azadirachtin chiết tách dung môi khác nhau: nước, acetone, methanol nồng độ nghiên cứu xấp xỉ 500 ppm Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.3 hình 3.4 Bảng Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung mơi theo thời gian nhiệt độ phịng Sau 24 Sau 72 Sau 168 (1 ngày) (3 ngày) (7 ngày) Methanol 2.111805 11.85278 28.26696 Aceton 5.463098 13.51479 42.49162 Nƣớc 10.74924 11.70753 41.57162 45 % p h â n h ủ y 40 Methanol Acetone Water 35 30 25 20 15 10 -5 ngay ngay Thời gian Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung mơi theo thời gian nhiệt độ phịng Trong môi trường nước acetone, azadirachtin bị phân hủy mạnh theo thời gian Sau ngày lưu giữ nhiệt độ phòng 25oC, hàm lượng azadirachtin bị phân hủy đáng kể, đến khoảng 42% Trong dung môi methanol, azadirachtin bị phân hủy với tốc độ chậm Vì vậy, nghiên cứu tiêp theo, lựa chọn dung môi methanol để bảo quản azadirachtin 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng mạnh đến chất lượng azadirachtin trình bảo quản, đặc biệt bảo quản dung môi nước hay dung môi hữu phân cực khác Nhiệt độ thúc đẩy nhanh trình thủy phân azadirachtin, làm cấu trúc chúng thay đổi Chúng tiến hành pha dung dịch azadirachtin dung môi nước nhiệt độ nghiên cứu Mẫu ủ nhiệt theo nhiệt độ khảo sát Kết thu trình bày bảng 3.4 hình 3.5 cho thấy nhiệt độ thấp, trình thủy phân azadirachtin xảy chậm tăng dần theo tăng lên nhiệt độ Quá trình phân hủy azadirachtin xảy mãnh liệt nâng nhiệt độ lên 35 oC Ở 60oC azadirachtin gần bị phân hủy hết sau 24 giờ, ứng với giá trị 89,09% nhanh chóng phân hủy hồn tồn sau Vì vậy, việc lưu giữ azadirachtin thiết thể rắn, khơng có ẩm nhiệt độ thấp Bảng 3 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian nhiệt độ 5oC 25oC 35oC 60oC ngày 0,656033 4,991472 8,487189 89,09111 ngày 1,053401 20,30327 23,82148 100 ngày 3,675657 42,5784 48,76947 100 100 90 % p h â n h ủ y o 5C o 25 C o 35 C 60 C 80 70 60 50 40 30 20 10 ngay Thời gian Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian nhiệt độ khác 3.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ Chúng tiến hành pha azadirachtin dung mơi methanol để tìm hiểu ảnh hưởng nồng độ azadirachtin đến khả phân hủy chúng nhiệt độ phòng Nghiên cứu thực mẫu azadirachtin điều chế cách pha loãng azadirachtin trong dung mơi methanol để dung dịch có nồng độ thuốc từ 100 ppm đến 1000 ppm Nồng độ azadirachtin đánh giá theo thời gian Kết phân tích trình bày bảng 3.5 hình 3.6 Bảng Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi methanol theo thời gian nhiệt độ phòng Ban đầu Sau 24 Sau 72 Sau 168 (1 ngày) (3 ngày) (7 ngày) 100 ppm 2,761684 4,19689 18,3346 200 ppm 6,336885 18,73817 31,66304 500 ppm 2,111805 11,85278 28,26696 1000 ppm 0,760463 5,54111 9,477605 % ph ân hủ y Nồng độ Hình Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi methanol theo thời gian nhiệt độ phòng Từ kết bảng 3.5 cho thấy tất mẫu nghiên cứu với nồng độ khác nhau, azadirachtin có bị phân hủy theo thời gian Ở nồng độ mẫu lớn, khả phân hủy azadirachtin giảm Điều thấy rõ so sánh % giảm nồng độ azadirachtin sau ngày bảo quản nhiệt độ phòng biểu diễn hình 3.7 Ở mẫu nghiên cứu có nồng độ 1000 ppm, sau ngày, độ hao hụt 9,48%, mẫu nghiên cứu có nồng độ 200 ppm có độ hoa hụt đến 31,66% 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỌ 3.4.1 Sâu lông Tên khoa học: Agrotis ypsilon Họ ngài đêm: Noctuidae Bộ cánh vảy: Lepidoptera Đối tƣợng trồng bị sâu lông hại Sâu lông hại nhiều loại trồng như: Ngô, đậu đỗ, bông, cải xanh, cải bắp, cà rốt, cà tím, đậu xanh, rau diếp, khoai lang, cà chua, củ cải, dưa, bầu, bí Đặc điểm hình thái sâu lông hại hoa màu - Agrotis ypsilon Hình Đặc điểm, hình thái sâu lơng - Vịng đời trung bình 50-60 ngày, giai đoạn sâu non 30-35 ngày: Trứng 4-11 ngày; Sâu non 22-34 ngày; Nhộng 9-13 ngày; Bướm đẻ trứng sau 2-4 ngày - Trưởng thành lồi bướm có thân dài 20-25mm Cánh trước có màu xám đen, gần phía góc mép ngồi có vệt đen nhỏ hình tam giác Cánh sau màu trắng, mép màu nâu xám nhạt Cơ thể có nhiều lơng màu xám - Trứng có hình cầu dẹt, có sọc nổi, đường kính khoảng 0.5mm, lúc đầu có màu nhạt (trắng sữa) sau chuyển sang hồng nhạt, màu đen đến nâu (hoặc tím sẫm) - Sâu non màu đen nâu, có đường xẻ màu nâu nhạt hai sọc hai bên Đầu đen, có hai điểm trắng - Nhộng có màu nâu cánh gián, cuối bụng có đơi gai ngắn - Sâu non màu xám đen nâu màu nâu xám, dọc theo hai bên thân có dãy đen mờ, đầu đen (hoặc nâu sẫm) Trên đốt thân phía có u lơng nhỏ, phía có u lông lớn Đốt cuối mảnh lưng có vệt màu nâu đậm Tập quán sinh sống gây hại sâu lông hại hoa màu - Agrotis ypsilon - Bướm hoạt động giao phối đẻ trứng ban đêm, thích mùi chua Đẻ trứng rời rạc thành mặt đất, bướm đẻ khoảng 800-1000 trứng - Tuổi 2, ban ngày sâu ẩn nấp mặt đất gốc cây, mặt lá, ban đêm chui lên ăn non gặm xung quanh thân non Từ tuổi - trở sâu phá mạnh, cắn đứt ngang thân (làm bị khuyết bị cắn đứt) kéo xuống đất Mỗi đêm, sâu cắn đứt - non Đối với số màu trưởng thành có thân cứng (cây ngơ có - lá) sâu thường đục vào thân gần sát gốc ăn phần non mềm làm thân ngô bị héo chết Ruộng hoa màu bị sâu xám gây hại trông khoảng lỗ chỗ, mật độ giảm, thiệt hại suất - Sâu thường xuất vào giai đoạn gây hại trầm trọng vùng đất nhẹ, đất cát nơi sâu non vùi dễ dàng Sâu non có tính giả chết, bị đụng vào chúng cuộn lại, lăn giả chết Sâu đẫy sức hoá nhộng đất Chúng phát sinh thời tiết lạnh, ẩm độ cao - Ở tỉnh phía Bắc sâu lơng hại nặng hoa màu (đặc biệt ngô) trồng vụ đông xuân vụ xuân Hoa màu đông xuân gieo sớm đầu tháng 10 - tháng 10 bị hại nhẹ so với gieo vào cuối tháng 10 - tháng 11 Biện pháp phịng trừ sâu lơng hại trồng - Biện pháp canh tác, kỹ thuật + Vệ sinh đồng ruộng, làm cỏ dại ruộng quanh bờ để hạn chế nguồn ký chủ phụ sâu + Cày ải phơi đất tuần trước trồng để diệt trứng nhộng cho nước ngập vào ruộng, ngâm khoảng ngày đêm sau tháo cạn, để ruộng trước gieo trồng + Luân canh trồng: Sau vài vụ trồng ngô, rau, đậu luân canh vụ lúa loại rau ưa nước rau muống, rau cần để diệt nhộng sống đất cắt đứt nguồn thức ăn phù hợp cho sâu - Biện pháp thủ công + Đối với ruộng nhỏ, mật độ sâu thấp bắt sâu tay vào buổi sáng sớm hay chiều tối cách bới đất quanh gốc bị sâu cắn để bắt sâu - Biện pháp sinh học + Hạn chế phun thuốc để bảo tồn thiên địch đồng ruộng nhện, bọ rùa, ong ký sinh + Dùng bẫy bả chua để bẫy bướm Cách làm bẫy bả chua ngọt: Trộn hỗn hợp gồm phần đường + phần dấm + phần rượu + phần nước Cho vào bình đậy kín sau - ngày thêm vào 1% thuốc trừ sâu Quấn giẻ hay bùi nhùi rơm rạ vào đầu gậy nhúng vào bả cắm bờ ruộng Bướm trưởng thành bay vào ăn bả chua bị chết Cứ - ngày nhúng bả lại lần - Biện pháp hóa học + Xử lý đất trước gieo trồng số loại thuốc trừ sâu dạng bột như: Basudin 10G, Vibasu 10H, Furadan 3G, Regent 3G… + Dùng cám rang thơm trộn với thuốc Vibasu 10G để bẫy sâu Trộn kg cám với 0,5 kg thuốc, rải cho 1.000 m2 trước trời tối Rải thuốc theo hàng hốc gần gốc + Khi mật độ sâu cao, nên chọn loại thuốc hỗn hợp có nhiều hoạt chất, nhiều tác dụng (tiếp xúc, vị độc, xông hơi, nội hấp, thấm sâu) phối hợp 2-3 loại thuốc trừ sâu có tác dụng khác để diệt trừ sâu lơng cho hiệu cao Có thể dùng thuốc đơn: Basudin 50EC; Shecpain 36EC; Gottoc 250EC phối hợp hai loại thuốc khác nhau: Diptere 80WP + Karate 2,5EC; Sevin 40% + Sherpa 25EC; Ganoi 95SP + Abamectin 36EC, Regent 800WG + Sokupi 0,36AS… Phun vào chiều tối, nên cho thêm 10ml chất bám dính 20-30ml dầu khoáng giọt nước rửa chén vào bình 8-12lít để tăng khả bám thuốc vào thể sâu, sâu chết nhanh, nhiều + Lựa chọn số loại thuốc hoá học đặc hiệu như: Padan 95SP; Regent 800WP vv Sử dụng theo hướng dẫn loại thuốc + Dùng luân phiên thuốc có hoạt chất Emamectin, Lamda-Cypermethrin với hỗn hợp Chlorantraniliprole + Abamectin… 3.4.2 Đánh giá khả n ng azadirachtin sâu lông Chúng tiến hành đánh giá hiệu hoạt chất azadirachtin sâu ăn cách pha loãng azadirachtin nước nồng độ khác (10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm) trước sử dụng phun trực tiếp lên mẫu nghiên cứu Mỗi thử nghiệm thực 20 cá thể sâu Ứng với nồng độ, tiến hành thử nghiệm lần, ghi lại thời gian nửa số sâu bị chết thời gian sâu chết hoàn toàn, lấy giá trị thời gian trung bình Quan sát biểu sâu sau phun nhận thấy sau khoảng phút, sâu có biểu say thuốc, cử động chậm, sau ngừng cử động hồn tồn Những sâu khơng cử động hoàn toàn va chạm xem chết (hình 3.11) Kết khảo sát trình bày bảng 3.6 hình 3.9 Hình Biểu sau say thuốc chết sâu xử lý với azadirachtin Bảng Thống kê thời gian gây chết 50% 100% mẫu azadirachtin nồng độ thử nghiệm Thời gian (min) Gây chết 50% Gây chết 100% 10 656 925 20 478 617 50 282 405 100 174 251 200 105 185 300 52 72 Nồng độ (ppm) 1800 1600 1400 1200 1000 chết hoàn toàn 800 chết 50% 600 400 200 10 20 50 100 200 300 Hình Sự phụ thuộc thời gian gây chết 50% 100% vào nồng độ mẫu azadirachtin thử nghiệm Từ số liệu trình bày bảng 3.6 hình 3.9 cho thấy tăng nồng độ azadirachtin, hoạt tính tiêu diệt sâu thể mạnh với thời gian tiêu diệt 100% cá thể sâu thực nghiệm ngắn Tuy vậy, azadirachtin thể hoạt tính tiêu diệt sâu rõ rệt nồng độ thấp 10 ppm với thời gian diệt 50% cá thể 10.9 hoàn toàn sau 15 xử lý Như vậy, nồng độ 10 ppm thể rõ hoạt tính kháng sâu bọ azadirachtin KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong trình thực đề tài nghiên cứu, thu kết sau:  Đã xây dựng quy trình chiết tách azadirachtin có nhân hạt neem với quy trình sử dụng dung mơi hữu để chiết tách để chiết tách azadirachtin Quy trình chiết tách dung môi hữu cho hiệu chiết tách với phần trăm chiết tách nhận hạt neem 0,23%  Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến việc bảo quản chế phẩm azadirachtin chiết tách từ nhân hạt neem với số nhận xét ban đầu sau: - Azadirachtin không bền dung môi phân cực, đặc biệt nước tượng thủy phân Azadirachtin tương đối bền dung môi methanol so với nước acetone - Azadirachtin không bền nhiệt độ cao, chí nhiệt độ phịng 25 oC dạng hòa tan, bị phân hủy đến 42.5% sau ngày bảo quản Kiểm tra nhiệt độ cao 60oC cho thấy azadirachtin bị phân hủy hoàn toàn sau ngày lưu trữ Vì vậy, để bảo quan azadirachtin dạng lỏng, cần lưu trữ nhiệt độ thấp - Trong dung dịch, khả phân hủy azadirachtin phụ thuộc vào nồng độ chúng Ở nồng độ cao, khả phân hủy chúng bé  Đã bước đầu đánh giá hiệu tiêu diệt sâu sản phẩm azadirachtin chiết tách Ở nồng độ xử lý 10 ppm, sau xấp xỉ 15,42 giờ, toàn sâu bị tiêu diệt; tăng nồng độ đến 200 ppm, toàn sâu bị tiêu diệt sau 3,1 đồng hồ Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu cải thiện quy trình nâng cao hiệu suất chiết tách azadirachtin từ nhân hạt neem - Nghiên cứu biện pháp trì hoạt tính azadirachtin bảo quản điều kiện thường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Lâm Công Định (1985), “Xoan chịu hạn (Azadivachta indica A Juss) Một loài thích ứng với vùng nóng hạn Thuận Hải”, Tạp chí Lâm nghiệp tháng 8/1985 [2] Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Thị Minh (2006), Chiết tách, Tinh khảo sát tác dụng đối kháng vi sinh vật salanin từ nhân hạt xoan Ấn Độ, tr24-31 [3].Nguyễn thị Minh Hà (2002), Chiết xuất khảo sát hoạt tính ức chế sinh ưưởng dịch chiết từ nhân hạt neem (Azadirachta indica) trồng Việt Nam ìên vị nấm Altemaria sp Fusarium oxỵsporum gây bệnh thực vật Khóa luận cử nhân khoa học sinh học, Đại học Khoa hoc Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 56 trang [4] Nguyễn Cữu Thị Hương Giang cộng (1998), Hiệu gây ngán ăn cửa số mọc Việt Nam mọt thóc tạp (Tríbolium castaneum Herbst), Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học 1993 – 1998, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Quốc Gia, Nhà xuất Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, trang 333 - 338 [5] Vũ Đăng Khánh (2003), Khảo sát tính kháng nâ'm gây bệnh nấm sinh độc tô aflatoxin sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn (Azadirachta indica A Juss trồng Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ khoa học sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 97 trang [6] Lê Thị Thanh Phượng (2004), Chiết xuất hoat chết sinh học từ nhân hạt neem (Azadirachta indica A Juss; khảo sát tác động chúng ngài gạo (Corcyra cephalonica St.;, Luận văn Thạc sĩ khoa học Nơng nghiệp, Đại học Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh, 97 trang [7] Hồ Viêt Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định cấc chất dung môi hữu cơ, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 416 trang [8].Trần Kim Qui (2005), Hoàn thiện qui trình trích ly limonoid qui mơ pilot từ neem điều chế phụ gia thích hợp để làm nguyên liệu pha chế thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp thành phố giai đọan [9] Nguyễn Tiến Thắng công (2003), Nghiên cứu sử dung câỵ xoan chịu hạn (.Azadirachta indica A Juss) trồng Việt Nam, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp nhà nước theo nghị định [10] Lê Trường (1967), thuốc trừ sâu cỏ, NXB khoa học Hà Nội [11] Dương Anh Tuấn cộng (2001), Azadirachtin, hoạt chất gẫy ngán ăn mạnh sâu khoang phân lập từ hạt neem (Azadirachia indica) di thực vào Việt Nam, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ hóa hữu tồn qc lân thứ 2, Hà Nội, trang 333 - 337 Tiếng nƣớc [12] Beate Ruch (2001), Quantification of azadirachtin in neem products and different compartments after neem-treatment Proceeding of the 2, Workshop „Neem and Pheromone‟, pp 50-56 [13] Kraus W, Grimminger W, Toonafolin, ein neues Tetranortriterpenoid −B− lacton Toona ciliata MJ Roem Var australis (Meliaceae), Liebigs Ann Chem 1981; 1838-1843 [14] Kumar AN, Murugan K, Madhiyazhagan P, Prabhu K, Spinosad and neem seed kernel extract as bio-controlling agents for malarial vector, Anopheles stephensi and non- biting midge, Chironomus circumdatus, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2011; 614-618 [15] Tsolakis H, Ragusa E, Chiara SR DI, Laboratory and field trials on the effects of neem oil on Bactrocera oleae (Gmelin) (Diptera: Tephridae), Phytophaga (Palermo) 1999; 9:65-75 [16] Schmutterer H, Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica, Annu Rev Entomol 1990; 35:271-297 [17] Umar A, Kela SL, Ogidi SL, Asadabe J, Susceptibility of Aedes aegypti pupae to neem seed kernel extracts, Animal Research International 2006; 3(1):403-406 [18] Weintraub PG, Horowitz AR Systemic Effects of a Neem Insecticide on Liriomyza huidobrensis larvae, Phytoparasitica 1997; 25(4):283-289 [19] Beate Ruch (2001), Quantification of azadirachtin in neem products and different compartments after neem-treatment Proceeding of the 2, Workshop „Neem and Pheromone‟, pp 50-56 [20] Sarojini Sinha, PSN Murthy, CVN Rao, GRamaprasad, S Sitaramaiah, DG Kumar and Suresh Kumar Savant, Simple method for enrichment of Azadirachtin from Neem Seeds, 23 August, 1999 ... loại thuốc trừ sâu sinh học hướng bền vững có tiềm tơi chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết tách azadirachtin từ hạt neem phương pháp chiết với dung môi hữu để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học? ??...ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TỪ HẠT NEEM BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾT VỚI DUNG MÔI HỮU CƠ ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC KHÓA... tên sinh viên: Lê Thị Anh Khuyên Lớp: 13CHP Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách azadirachtin từ hạt neem phương pháp chiết với dung môi hữu để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học Nguyên liệu, dụng