Nghiên cứu chiết tách chất azadirachtin từ hạt neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ CẨM AN NGHIÊN CỨU CHIẾT T CH CHẤT AZADIRACHTIN TỪ HẠT NEEM ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Đà Nẵng, Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ CẨM AN NGHIÊN CỨU CHIẾT T CH CHẤT AZADIRACHTIN TỪ HẠT NEEM ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60.44.01.14 N ƣ ƣ d ọc PGS TS NGUYỄN BÁ TRUNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Đà Nẵng, Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Cẩm An MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu .3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .4 Cấu tr c luận văn CHƢƠNG TỔNG QUAN .5 1 THUỐC TRỪ SÂU 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại THUỐC TRỪ S U SINH HỌC .11 1.2.1 Định nghĩa phân loại 11 1.2.2 Ưu nhược điểm thuốc trừ sâu sinh học .11 1.2.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng quản lý thuốc trừ sâu sinh học Việt Nam 12 1.2.4 Một số chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gố từ thực vật 14 1.3 T CT Ừ N ỌC C N N C TỪ N .18 1.3.1 Giới thiệu neem 18 1.3.2 Các thành phần chiết xuất từ neem 21 1.3.3 Thuốc trừ sâu sinh học từ chất azadirachtin chiết xuất từ nhân hạt neem 23 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 26 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26 2.1.1 Nguyên liệu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.2 P Ư N P PN N CỨ 27 2.2.1 Chiết tách azadirachtin 27 2.2.2 Phân tích azadirachtin phương pháp sắc kí lỏng cao áp 30 2.2.3 Định lượng azadirachtin phương pháp phân tích sắc kí lỏng cao áp 31 2.2.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng độ bền azadirachtin 32 2.2.5 Đánh giá hoạt tính tiêu diệt sâu azadirachtin 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 X Y P PP N YT NT C N P NTC Z C TN N P Ư N P C .34 3.1.1 Tối ưu hóa q trình .34 3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 35 3.2 CHIẾT TÁCH AZADIRACHTIN TRONG NHÂN HẠT NEEM 37 3.2.1 Chiết tách phương pháp p học kết hợp với sử dụng dung môi h u 37 3.2.2 Chiết tách dung môi h u 38 3.2.3 Phân tích đặc trưng sản phẩm azadirachtin chiết tách .39 3.3 CÁC YẾU T ẢN ƯỞN ĐẾN ĐỘ BỀN CỦA AZADIRACHTIN 41 3.3.1 Ảnh hưởng dung môi .41 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 43 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ 44 3.4 Đ N K Ả NĂN KẾT LUẬN VÀ ỆT SÂU BỌ 46 IẾN NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AchE enzyme acetylcholinesterase BVTV Bảo vệ thực vật CHC Hydrocacbon clo (từng chất) hydrocacbon có chứa clo DDT 1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane Đ chất hoạt động bề mặt IGR Insect Growth Regulator (chất điều hịa sinh trưởng trùng) LHC Chất độc lân h u NPV nuclear polyhedral virus (virus đa nhân diện) VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng chiết tách azadirachtin 27 2.2 Danh sách hóa chất sử dụng để định lượng Azadirachtin phương pháp P C 27 3.1 Mối quan hệ gi a nồng độ diện tích peak mẫu azadirachtin ứng thời thời gian lưu 6,89 ph t 36 3.2 Kết phân tích hàm lượng azadirachtin thực theo quy trình 39 3.3 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung mơi theo thời gian nhiệt độ phịng 42 3.4 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian nhiệt độ 43 3.5 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi methanol theo thời gian nhiệt độ phòng 45 3.6 Thống kê thời gian gây chết 50% 100% mẫu azadirachtin nồng độ thử nghiệm 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình Trang 1.1 Cây nghể (Polygonum hydropiper) 14 1.2 Cây thuốc (Nicotiana tabacum) 16 1.3 Cây thuốc cá (Derris elliptica Benth) 16 1.4 Cây củ đậu (Pachyrhizus erosus) 17 1.5 Cây xoan (Melia azedarach) 18 1.6 Cây neem trưởng thành 19 1.7 Hạt neem khô nhân sau tách vỏ 20 2.1 Quy trình chiết tách azadirachtin phương pháp p học 29 lấy dầu kết hợp với chiết tách dung mơi h u 2.2 Quy trình chiết tách azadirachtin phương pháp chiết với dung môi h u 30 2.3 Các thiết bị hệ thống HPLC: 31 3.1 Sắc kí đồ HPLC mẫu azadirachtin chuẩn 100 ppm hệ dung môi pha động Acetonitrile : H3PO4 0,1% ứng với tỉ lệ 40 : 60 thể tích 35 3.2 Đường chuẩn mơ tả phụ thuộc nồng độ azadirachtin vào diện tích peak sắc kí 36 3.3 Phổ hồng ngoại IR mẫu azadirachtin chiết tách dung 40 môi h u 3.4 Sắc kí đồ HPLC mẫu azadirachtin 100 ppm chiết tách dung môi h u 41 hệ dung môi pha động Acetonitrile : H3PO4 0,1% ứng với tỉ lệ 40 V : 60 V 3.5 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi theo thời gian nhiệt độ phòng 42 Số hiệu Tên hình Trang Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin theo thời gian 44 hình 3.6 nhiệt độ khác 3.7 Phần trăm hao hụt mẫu azadirachtin dung môi 45 methanol theo thời gian nhiệt độ phòng 3.8 Biểu sau say thuốc chết xử lý với azadirachtin 46 nồng độ 100 ppm sau 1.5 3.9 Sự phụ thuộc thời gian gây chết 50% 100% vào nồng độ mẫu azadirachtin thử nghiệm 47 MỞ ĐẦU Lý chọ đề tài Ngành nơng nghiệp đóng vai trị quan trọng việc trì ổn định an ninh lương thực, hệ thống kinh tế, xã hội môi trường tồn cầu Tuy nhiên, hoạt động nơng nghiệp đối mặt với nhiều thách thức tàn phá nấm, cỏ dại, côn trùng, dẫn đến làm giảm đáng kể suất trồng Từ năm 1960 đến nay, nhiều loại chất hóa học đưa vào sử dụng rộng rãi để diệt trừ sâu bệnh Việc sử dụng loại thuốc hóa học thời kì đầu mang lại lợi ích to lớn tiêu diệt sâu bệnh nhanh có hiệu An toàn vệ sinh thực phẩm vấn đề toàn xã hội quan tâm thời gian gần tình trạng ngộ độc thức ăn, chết bệnh liên quan đến dư lượng hóa chất tồn lưu thực phẩm tích lũy thể thời gian dài Tuy nhiên, để nâng cao suất, nhà vườn sử dụng khơng có kiểm sốt lượng lớn phân bón vơ cơ, chất kích thích tăng trưởng chất bảo vệ thực vật với mục tiêu nâng cao suất tăng độ “bắt mắt” cho nông sản sau thu hoạch, đặc biệt loại rau trồng ngắn ngày cải, mồng tơi, đậu … ậu để lại cho canh tác không bền v ng đất bị thối hóa ngưng trệ nhiều q trình chuyển hóa xảy nước, đất vi sinh vật thực hiện, tiêu diệt động vật có ích (trong có lồi thiên địch), nguy ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng k o dài đến sức khỏe người tiêu dùng Do vậy, nh ng năm gần đây, xu hướng quay trở lại nơng nghiệp h u bền v ng, có việc tăng cường sử dụng phân bón h u thay cho phân bón vơ cơ, sử dụng loại thuốc trừ sâu sinh học (chế phẩm sinh học) canh tác trồng xu hướng chung tồn cầu, có nước ta Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học, vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) chất vi sinh vật tiết (thường chất kháng sinh), chất có cỏ (là chất độc dầu thực vật) Với thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học chia thành hai nhóm là: - Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu vi sinh vật nấm, vi khuẩn, virus ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA HỮU CƠ KHÓA: 30 MÃ SỐ: 60 44 01 14 Thông tin chung: - Tên đề tài: ố sâ s n n n neem để n ụn làm ọ - Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ CẨM AN - Giáo viên hướng dẫn: PGS-TS NGUYỄN BÁ TRUNG - Cơ sở đào tạo: Đại học Sư phạm Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: Tháng 8/2016 đến tháng 3/2017 Mục tiêu: Xây dựng quy trình chiết tách có hiệu azadirachtin từ nhân hạt neem, đánh giá độ bền azadirachtin để từ ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học cho trồng ăn Tính sáng tạo: - Chiết tách chất azadirachtin từ hạt neem hai phương pháp lựa chọn - Xác định hàm lượng chất Azadiractin có dịch chiết phương pháp HPLC - Nghiên cứu số ảnh hưởng đến độ bền hoạt chất azadirachtin - Đánh giá khả diệt sâu bọ hoạt chất azadirachtin phương pháp thống kê Tóm tắt kết nghiên cứu: Trong q trình thực đề tài nghiên cứu, chúng tơi thu kết sau:  Đã xây dựng quy trình chiết tách azadirachtin có nhân hạt neem với quy trình đề xuất: Quy trình 1: Sử dụng phương pháp ép học tách loại dầu kết hợp với dung môi hữu để chiết tách azadirachtin Quy trình 2: Sử dụng dung môi hữu để chiết tách azadirachtin Trong quy trình trên, quy trình chiết tách dung mơi hữu cho hiệu chiết tách cao so với chiết tách phương pháp ép học kết hợp với dung môi hữu cơ, với phần trăm chiết tách xấp xỉ 1,3 7,5%  Đã xác định điều kiện tối ưu cho q trình phân tích định lượng azadirachtin với thơng số hệ dung môi pha động sau: - Cột sắc ký : Thermo - Acclaim C18 (4,6mm x 150 mm, 3µm) - Bước sóng DAD : 210 nm - Tốc độ dịng : ml/phút - Thể tích tiêm : 10 µl - Nhiệt độ cột : 25OC - Pha động : Acetonitrile - H3PO4 0,1% (40V-60V)  Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến việc bảo quản chế phẩm azadirachtin chiết tách từ nhân hạt neem với số nhận xét ban đầu sau: - Azadirachtin không bền dung môi phân cực, đặc biệt nước tượng thủy phân Azadirachtin tương đối bền dung môi methanol so với nước acetone - Azadirachtin không bền nhiệt độ cao, chí nhiệt độ phịng 25oC dạng hòa tan, bị phân hủy đến 42.5% sau ngày bảo quản Kiểm tra nhiệt độ cao 60oC cho thấy azadirachtin bị phân hủy hoàn toàn sau ngày lưu trữ Vì vậy, để bảo quan azadirachtin dạng lỏng, cần lưu trữ nhiệt độ thấp - Trong dung dịch, khả phân hủy azadirachtin phụ thuộc vào nồng độ chúng Ở nồng độ cao, khả phân hủy chúng bé  Đã bước đầu đánh giá hiệu tiêu diệt sâu sản phẩm azadirachtin chiết tách Ở nồng độ xử lý 10 ppm, sau xấp xỉ giờ, toàn sâu bị tiêu diệt; tăng nồng độ đến 200 ppm, toàn sâu bị tiêu diệt sau 30 phút Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng: Đề tài có khả áp dụng thực tiễn lĩnh vực ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, … sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật để sản xuất chế phẩm sinh học dễ phân hủy, độc cho môi trường người, phục vụ cho phát triển nông nghiệp hữu bền vững, tiến tới toàn cầu xanh, an toàn đáng tin cậy Mặt khác, khả áp dụng thực tiễn cao vật liệu rẻ tiền dễ kiếm Hướng nghiên cứu đề tài: - Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình nâng cao hiệu suất chiết tách azadirachtin từ nhân hạt neem - Nghiên cứu biện pháp trì hoạt tính azadirachtin bảo quản điều kiện thường - Azadirachtin bền dung mơi metanol ( độc) để khẳng định vai trị chất azadirachtin kháng sâu hại nên cần loại bỏ dung mơi metanol Từ khóa: neem, dịch chiết neem, azadirachtin, định lượng, Thuốc trừ sâu sinh học Đà Nẵng, ngày 25 tháng 04 năm 2017 Xác nhận giảng viên hướng dẫn Người thực đề tài INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: Research on the extraction of Azadirachtin from neem seeds for use as biological insecticides - Code number: 60 44 01 14 - Name of student: NGUYEN THI CAM AN - Supervisor: Prof Dr NGUYEN BA TRUNG - Implementing institution: The University of Danang - University of Science and Education - Duration: from 8/2016 to 3/2017 Objective: - Construction of an effective Azadirachtin extraction process from the nucleus of neem, evaluate the durability of Azadirachtin, from which it can be used as a biological insecticide for leafy crops Creativeness and innovativeness: - Extraction of Azadirachtin from neem with two alternative methods - Determination of Azadiractin substance contained in extract by HPLC method - Study some effects on the durability of Azadirachtin - Evaluate the ability to kill insect pests of Azadirachtin by statistical method Research results: During the course of research, we have achieved the following results:  The Azadirachtin extraction process which contained in the kernel of neem has been developed with the two proposed processes: Procedure 1: Using the mechanical compression method to separate the oil in combination with the organic solvent to extract Azadirachtin Procedure 2: Use organic solvent to extract Azadirachtin In the two processes above, the organic solvent extraction procedure had a higher extraction efficiency than the mechanical pressing method combined with organic solvent, with the extracted percentage approximately 1.3 and 7.5%  The optimum conditions for the quantitative analysis of Azadirachtin with the parameters and solvent systems of the mobile phase were determined as follows: - Chromatograph : Thermo - Acclaim C18 (4.6mm x 150mm, 3μm) - DAD wavelength : 210 nm - Flow rate : ml / - Volume of injection : 10 μl - Temperature : 25oC - Mobile phase  : Acetonitrile – H3PO4 0.1% (40V-60V) The factors influencing the preservation of Azadirachtin extracted from the neem nucleus were examined with the following initial observations: - Azadirachtin is not stable in polar solvent, especially water due to hydrolysis Azadirachtin is relatively stable in methanol compared with water and acetone - Azadirachtin is not stable at high temperatures, even at room temperature of 25°C when dissolved, decomposed to 42.5% after days of storage Testing at a high temperature of 60°C shows that Azadirachtin decomposes completely after days of storage Therefore, in order to store Azadirachtin in liquid form, it should be stored at low temperature - In solution, the decomposition of Azadirachtin depends on their concentration At higher concentrations, their ability to break down is less  Initially assessed the eradication efficacy of Azadirachtin extract At a treatment concentration of 10 ppm, after approximately hours, the entire is killed; when the concentration increases to 200 ppm, the entire worm is destroyed in just 30 minutes Effects, transfer alternatives of research results and applicability: This topic has the potential to apply the practice in the field of biological pesticide application, because the product originates from plants to produce biodegradable, less toxic to the environment and human, serving for the development of sustainable organic agriculture, towards a green, safe and reliable global On the other hand, practicality is high because material is cheap and easy to find out The future of the research topic - Continuing research on improving the efficiency of Azadirachtin extraction from neem kernel - Research on how to maintain the activity of Azadirachtin when stored under normal conditions - Azadirachtin is stable in methanol (toxic) to confirm the role of Azadirachtin in pest resistance, should remove the methanol solvent Keywords: Neem, neem extract, Azadirachtin, quantitative, biological insecticides Da Nang, 25th April 2017 Supervisor’s confirmation Person in charge (sign, full name) ... bền azadirachtin để từ ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học cho trồng ăn Đố tƣợng phạm vi nghiên cứu Đố tƣợng nghiên cứu Chiết tách azadirachtin có hạt neem 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu, ... gốc từ thực vật, lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết t thuốc trừ sâu sinh học? ?? t z r t n từ hạt neem để ứng dụng làm Mục đíc ê cứu Xây dựng quy trình chiết tách có hiệu azadirachtin từ nhân hạt neem, ... khỏe người yếu tố sinh thái mơi trường, thuốc trừ sâu hóa học cần hạn chế sử dụng, dần thay vào thuốc trừ sâu sinh học o với thuốc trừ sâu hóa học, ưu điểm bật thuốc trừ sâu sinh học độc với người