Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”. rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”. rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”.

MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan neem 1.1.1 Định danh 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 1.1.4 Giá trị công dụng 1.1.4.1 Thuốc bảo vệ thực vật phân bón 1.1.4.2 Dùng làm dược liệu 1.1.4.3 Dùng mỹ phẩm 1.1.4.4 Công dụng khác 1.2 Thành phần hóa học có hạt neem 1.2.1 Diterpenoids 10 1.2.2 Triterpenoid dẫn xuất chúng 10 1.2.2.1 Triterpenoid 11 1.2.2.2 Meliacin 13 1.2.3 Các hoạt chất 16 1.2.3.1 Azadirachtin 16 1.2.3.2 Meliantriol 17 1.2.3.3 Salannin 18 1.2.3.4 Nimbin Nimbidin 18 1.2.3.5 Các chất khác 19 1.3 Tổng quan thuốc bảo vệ thực vật 19 1.4 Phương thức tác động phổ tác động hoạt chất neem 25 1.4.1 Đối với côn trùng 25 1.4.1.1 Phương thức tác động 25 1.4.1.2 Cơ chế tác động 26 i 1.4.1.3 Phổ tác động 29 1.4.2 Đối với vi nấm 30 1.4.3 Đối với tuyến trùng 30 1.5 Cơng trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách phối phẩm 30 1.5.1 Trên giới 30 1.5.1.1 Các sáng chế 30 1.5.1.2 Bài báo khoa học 34 1.5.2 Trong nước 36 CHƯƠNG ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN 39 2.1 Mục tiêu 39 2.2 Phương pháp thực 39 2.2.1 Nguyên liệu 39 2.2.2 Các phương pháp định lượng hàm lượng azadirachtin với limonoid 39 2.2.2.1 Phương pháp so màu UV-Vis 39 2.2.2.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC 41 2.2.3 Khảo sát tối ưu hóa phương pháp chiết 44 2.2.3.1 Qui trình chiết 44 2.2.3.2 Tối ưu qui trình chiết 44 2.2.4 Phối dịch chiết lên chế phẩm thuốc trừ khảo sát khả 45 2.2.4.1 Phối dịch chiết vào chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 45 2.2.4.2 Khảo sát khả kháng sâu chế phẩm 46 2.2.5 Phối trộn hoạt chất neem với chế phẩm sinh học khác Khảo sát hiệu lực trừ sâu chúng 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ SƠ BỘ 48 3.1 Thực nghiệm ban đầu 48 3.1.1 Định lượng phương pháp so màu UV-Vis 48 3.1.1.1 Thử nghiệm phản ứng vanillin dầu neem, dầu dừa dịch chiết bã neem 48 3.1.1.2 Thử nghiệm phản ứng vanillin loại dịch chiết neem 49 3.2 Kết phản ứng màu vanillin dầu neem, dầu dừa 49 ii 3.3 Kết so màu phản ứng vanillin dịch chiết qua UV-Vis 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN 53 4.1 Kết thô bàn luận 53 4.2 Kết luận 53 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 A- nhánh thân neem; B- Lá Neem; C- Hạt neem chín; D- Hạt neem khơ; Hình 1.2 Neem tricyclic diterpene 10 Hình 1.3 Neem tricyclic diterpene 11 Hình 1.4 Neem tricyclic diterpene 12 Hình 1.5 Limonoid với hệ thống vịng đóng 13 Hình 1.6 Các limomoid mở vịng 14 Hình 1.7 Neem limonoid biến đổi hệ thống vịng C D 15 Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo azadirachtin A B 16 Hinh 1.9 Công thức cấu tạo meliantriol 17 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo salannin 18 Hình 1.11 Cơng thức cấu tạo nimbin nimbidin 19 Hình1.12 Quá trình phát triển sâu bọ 27 Hình 1.13 Các đường tác động dự kiến Azadirachtin thông qua trung gian ecdysone 28 Hình 2.1 Phương pháp chiết có loại béo đơn giản 41 Hình 2.2 Qui trình chiết loại béo phức tạp 42 Hình Qui trình chiết không loại béo đơn giản 44 Hình 3.1 Phản ứng vanillin dầu neem dầu dừa 50 Hình UV- Vis bã neem phản ứng mà vanillin sử dụng dm dichloromethane ethanol 50 Hình 3 UV- Vis bã neem phản ứng mà vanillin sử dụng dm ethanol 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính dược liệu chất neem Bảng 1.2 Mơ hình kích thước chiều phân tử azadirachtin ecdysone 29 Bảng 2.1 Công thức thuốc trừ sâu đơn giản 45 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AZ: Azadirachtin AZRL: Azadirachtin related limonoid BVTV: Bảo vệ thực vật FAO: Tổ chức nông nghiệp lương thực Liên Hiệp Quốc HPLC-PDA: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, đầu dò PDA PTTH: Hormone prothoracotropic JH: Hormone Juvenile UV: Tia tử ngoại VSV: Vi sinh vật WHO: Tổ chức y tế giới vi MỞ ĐẦU Nông nghiệp ngành chiếm tỷ trọng lớn kinh tế nước ta Nền sản xuất nông nghiệp nước ta đối đầu với thách thức áp lực từ bên lẫn bên ngồi Nơng nghiệp Việt Nam muốn phát triển bền vững, cần phải có thay đổi tư lẫn hành động Hiện nay, nông nghiệp phát triển theo chiều rộng chính, suất thấp, hiệu Nguyên nhân lạc hậu, thiếu chun mơn hóa q trình canh tác sản xuất dẫn đến sản phẩm chất lượng, làm giảm cạnh tranh thị trường quốc tế Trên thực tế, nông nghiệp nước ta phải đối mặt với nhiều loài sâu, bọ hại trồng nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tránh khỏi Theo thống kê tổ chức lương thực giới (FAO) cho thấy: loại trồng đồng ruộng phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng 600 loài virus gây bệnh Lượng lương thực bị vấn nạn ngày tăng lên Để khắc phục tình trạng trên, người tích cực tìm kiếm biện pháp phòng chống tác nhân gây hại, nhiều biện pháp khác sử dụng, thuốc trừ sâu hóa học sử dụng nhiều Chúng đóng vai trị quan trọng hệ thống canh tác nông nghiệp thời gian dài mang lại hiệu cao với phạm vi sử dụng rộng lớn Có thể nói, khơng biện pháp bảo vệ mùa màng tốt thuốc trừ sâu hóa học mặt qui mô lẫn hiệu Tuy nhiên, biện pháp hóa học ngày bộc lộ khuyết điểm Do dư lượng thải mơi trường ngày lớn nên gây vấn nạn đến môi trường, đầu độc người, gây cân hệ sinh thái Điều nghiêm trọng tình trạng sử dụng liều lượng, không thời gian sử dụng thuốc thời gian thu hoạch tạo nên dư lượng thuốc không cho phép hoa màu nông sản Những thông tin bị ép giá, bị trả lại hàng, không loạt qua khâu kiểm định nghiêm ngặt nhập vào nước tiên tiến quen thuộc mặt báo Đây nguyên nhân gây nhiễm độc cho khoảng 1,5 triệu người năm tồn giới, có 25 nghìn người bị tử vong (WHO-1998) Trước thực trạng này, nhà nông học nghiên cứu đưa phương pháp phòng trừ tiêu diệt loài sâu bọ hại trồng Một hướng nghiên cứu triển vọng kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học quan tâm, chúng làm ảnh hưởng đến sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm dễ sử dụng Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ sử dụng nghiên cứu nước ta nhiều nước khác Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa việc sử dụng neem q trình phịng trừ tiêu diệt sâu bọ nên em thực đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin với limonoid bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan neem 1.1.1 Định danh Tên khoa học: Azadirachta indica A.Juss Được nhà khoa học Andriew Henri Laurent de Jussieu tìm thấy năm 1830 Tên thường gọi: xoan Ấn Độ, sầu đâu, neem (tiếng anh), nim (tiếng La-tinh), xoan trắng, xoan chịu hạn Bộ: Rutales Bộ phụ: Rutineae Họ: Meliaceae (Mahogany Family) Chi: Melieae Giống: Azadirachtia Loài: Indica 1.1.2 Đặc điểm hình thái Hình 1.1 A- nhánh thân neem; B- Lá Neem; C- Hạt neem chín; D- Hạt neem khơ; E- nhân hạt neem Neem xanh quanh năm, tán rộng, cao trung bình từ 13-20 m, trưởng thành cao đến 30 m, đường kính 2,5 m, nhánh to vươn dài đến 10 m Lá xanh vào mùa ngoại trừ bị rụng vào mùa thu Tuổi thọ trung bình neem khoảng 200 năm [1] Đặc điểm lá: có dạng xẻ, kép lơng chim lẻ dài 20 đến 38 cm, mọc so le, dạng mác, xẻ cưa sâu sắc cạnh, nhẵn hai bề mặt, cân đối hai bên, nhọn, cuống ngắn Kiểu phát hoa: hoa mọc thành chùm nách lá, hoa nhỏ có cánh, lưỡng tính, màu trắng Đài hoa có phủ lớp lơng mịn bên ngồi, có thùy, thùy xếp dạng 2.2.3 Khảo sát tối ưu hóa phương pháp chiết 2.2.3.1 Qui trình chiết Ngun liệu Dung mơi Chiết Lọc Dịch chiết Bay dung mơi Chất rắn chứa AZRLvà béo Hình Qui trình chiết khơng loại béo đơn giản 2.2.3.2 Tối ưu qui trình chiết Đây phương pháp đơn giản nhất, chiết hoạt chất azadirachtin limonoid với dầu neem Tuy hàm lượng azadirachtin với limonoid không cao hiệu mặt kinh tế Nên chon phương pháp để chiết hoạt chất Các yếu tố cần khảo sát để tối ưu hóa q trình chiết: - Kích thước ngun liệu: cần đồng 44 - Dung môi: khảo sát hệ dung mơi rẻ, an tồn phổ biến ethanol nước - Tỷ lệ rắn lỏng: khảo sát tỷ lệ 1: , 1: 5, 1:6, 1:7, 1:8 - Nhiệt độ từ 30oC -90oC - Thời gian chiết: 30, 45, 60 phút 2.2.4 Phối dịch chiết lên chế phẩm thuốc trừ khảo sát khả 2.2.4.1 Phối dịch chiết vào chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Xây dựng công thức thuốc trừ sâu đơn giản: STT Thành phần Chất Hàm lượng Dung môi Nước : ethanol = 100-70 : 70% -100% 0-30 (v/v) Chất hoạt động bề Tween 20, Dịch chiết bồ mặt, Chất nhũ hóa kết, bồ hòn, Chất bảo quản 0,2% - 30% 1,2-benzissothiazalin-3-one 0,03- 0,06% (BIT) Chất chống nắng para-amino benzoic acid 1- 2,5% (PABA) Bảng 2.1 Công thức thuốc trừ sâu đơn giản Yêu cầu: - Khảo sát độ bền thuốc trừ sâu sinh học - Phối hoạt chất AZRL vào sản phẩm đánh giá độ bền hoạt chất 45 2.2.4.2 Khảo sát khả kháng sâu chế phẩm Tiến hành ni sâu Vì điều kiện nghiên cứu hẹp, tiến hành trồng rau thùng xốp để nuôi sâu Rau trồng rau cải xanh, rau lớn khoảng tuần kể từ ngày gieo tiến hành cho sâu vào ni Sâu thử nghiệm: xin từ Khoa Kỹ thuật nông nghiệp- Trường Đại học Nơng Lâm Hồ Chí Minh Sâu thuộc loại sâu ăn rau Dùng lồng chụp để kiểm sốt lượng sâu suốt q trình thử nghiệm Khảo sát khả gây ngán ăn cho sâu Phương pháp tiến hành theo phương pháp “chọn” Caasi T.M.(1983) “không chọn” Mendel M.J (1991) Chuẩn bị thí nghiệm miếng cải có diện tích cố định Dùng micropipette hút dung dịch có chứa AZRL nồng độ khác nhau, nhỏ miếng chuẩn bị Mẫu đối chứng mẫu rau tương tự (số lượng mẫu) nhỏ dung môi không chứa AZRL Các miếng xử lý dung môi bay hết trước cho vào hộp petri Đặt mẩu thí nghiệm có tẩm AZRL với đối chứng không tẩm AZRL xen kẽ hộp petri, đáy hộp có đặt miếng giấy lọc có thấm nước (độ ẩm 100%) để giữ mẫu rau không bị khô.Thả sâu vào hộp chuẩn bị, sâu tự tìm lấy thức ăn Tiến hành theo dõi thí nghiệm sau 2, 4, 6, 8, 12, 16, 24 sau 24 kết thúc thí nghiệm 46 Các tiêu cần theo dõi: - Trọng lượng miếng (cân điện tử độ xác 1.10-4) trước xử lý thuốc sau thả sâu 24 𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑙á 𝑠𝑎𝑢 𝑡ℎí 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 24ℎ (𝐴) - Tính % số ngán ăn = - Chỉ số ngán ăn (CSNA) = 100 − 𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑙á đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑢 24ℎ (𝐵) 𝐴 𝐵 x 100 x 100 Khảo sát khả diệt trừ sâu hại Khảo sát khả diệt trừ sâu hại nồng độ AZRL khác Tiến hành phun thuốc trừ sâu lên rau (có sâu) ngày - Ở nồng độ, nghi nhận tình trạng, số lượng sâu qua ngày - Từ đó, chọn nồng độ thời gian tương ứng đảm bảo diệt sâu hại rau hoàn toàn - Đề xuất nồng độ hợp lý để có thời gian diệt sâu hại rau tốt 2.2.5 Phối trộn hoạt chất neem với chế phẩm sinh học khác Khảo sát hiệu lực trừ sâu chúng Để tăng cường đẩy nhanh trình diệt trừ sâu hại, phối dịch chiết neem với dịch chiết có hoạt lực trừ sâu như: thuốc cá, ớt, tỏi,bồ kết,… Sau tiến hành thử nghiệm mục 2.2.4.2 để xem khả diệt sâu chế phẩm 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ SƠ BỘ Thực nghiệm ban đầu 3.1 3.1.1 Định lượng phương pháp so màu UV-Vis 3.1.1.1 Thử nghiệm phản ứng vanillin dầu neem, dầu dừa dịch chiết bã neem Thử nghiệm phản ứng vanillin - Pha dung dịch vanillin EtOH tuyệt đối, nồng độ 0,02 mg/mL - Cho dầu neem, dầu dừa vào becher nhỏ Cho vào bình 2,1 mL EtOH tuyệt đối để hịa tan hịa tồn chất Cho 0,6 mL dd vanillin chuẩn bị vào becher, lắc để nhiệt độ phòng phút - Thêm 0,6 mL H2SO4 đậm đặc 98% vào bình phản ứng, chia lần thêm, lắc 10s sau lần Phản ứng giai đoạn thử bể đá, tất chất làm lạnh trước cho vào phản ứng - Cho 10,5 mL EtOH vào bình, nhận thấy:  Bình chứa dầu neem: dung dịch chuyển từ màu tím đậm sang màu xanh  Bình chứa dầu dừa: dung dịch chuyển từ màu tím đậm sang màu vàng cam - Mẫu Blank chuẩn bị tương tự khơng có chất cần thử nghiệm 48 3.1.1.2 Thử nghiệm phản ứng vanillin loại dịch chiết neem Chiết bã neem chưa khử béo - Cho 50 g bã neem đồng kích thước chiết với dung mơi ethanol tuyệt đối Tỷ lệ rắn: lỏng 1:3, thực chiết lần - Dịch chiết gôm lại để cô vay đuổi dung môi, thu cao ethanol dạng sệt, dẻo, màu nâu sậmvà nặng mùi dầu neem - Cao (1) thu được lưu trữ tủ đá -5oC để dùng cho phản ứng thử nghiệm sau Chiết bã neem có khử béo - Cho 100g bã neem chuẩn bị chiết Petroleum ether, tỷ lệ rắn lỏng 1:2, tiến hành chiết lần, lần chiết khuấy 30 phút - Lọc để lấy dịch chiết Petroleum ether, tiến hành cô vay đuổi dung môi, thu cao Petroleum ether (2) dạng sệt màu vàng (có chứa lượng béo cao) - Bã neem khử béo chiết tiếp EtOH tuyệt đối, tỷ lệ rắn lỏng 1:3, chiết lần, lần 30 phút Dịch chiết EtOH tập hợp lại Tiến hành cô vay đuổi dung môi, thu cao EtOH khử béo (3), có màu nâu sậm - Các cao thu được, bảo quản -5oC để thực phản ứng sau Thực phản ứng vanillin theo Phương pháp Vanillin với Dichloromethane ethanol ; Phương pháp Vanillin với ethanol cho cao neem (1), (2), (3), sau tiến hành quét phổ UV-Vis, bước sóng 350- 700 nm 3.2 Kết phản ứng màu vanillin dầu neem, dầu dừa Qua kết thí nghiệm cho thấy, dầu neem có chất đặc biệt có phản ứng màu với vanillin, AZRL Nên dùng phương pháp để định lượng hàm lượng AZRL có dầu neem bã neem 49 Hình 3.1 Phản ứng vanillin dầu neem dầu dừa 3.3 Kết so màu phản ứng vanillin dịch chiết qua UV-Vis Phổ UV- Vis bã neem dùng phương pháp Vanillin với Dichloromethane ethanol: Hình UV- Vis bã neem phản ứng mà vanillin sử dụng dm dichloromethane ethanol 50 Kết đo UV: Bã 1(cao EtOH): Max 365 nm- 0,815 A; 525 nm- 0,277A ; 625 nm- 0,246 A Min 460 nm- 0,090 A; 585 nm- 0,235 A Bã 2(cao EtOH): Max 375 nm- 1,088 A; 525 nm- 0,451A ; 645 nm- 0,453 A Min 460 nm- 0,292 A; 585 nm- 0,385 A Bã 3(cao EtOH tách béo): Max 375 nm- 1,075 A; 510 nm- 0,116A ; 650 nm- 0,096 A Min 465 nm- 0,036 A; 590 nm- 0,058 A Phổ UV- Vis phương pháp Vanillin với ethanol: Hình 3 UV- Vis bã neem phản ứng mà vanillin sử dụng dm ethanol 51 Kết đo UV: 0104 (cao EtOH): Max 390 nm- 1,890 A; 605 nm- 0,644 A Min 575 nm- 0,630 A 0204 (cao EtOH): Max 395 nm- 2,028 A; 605 nm- 0,740 A Min 575 nm- 0,725A 0304 (cao Petroleum ether): Max 385 nm- 1,532 A 0604 (cao EtOH khử béo): Max 400 nm- 2,137 A; 615 nm- 1,006 A Min 555 nm- 0,861 A 0704 (dầu neem): Max 370 nm- 1,109 A; 625 nm- 0,223 A Min 560 nm- 0,198 A Nhận xét: Các phổ cho mũi hấp thu cực đại khoảng 380 nm 625 nm chất nhóm terpenoid, cho mũi hấp thu cực đại khoảng 500 nm peak hấp thu chất nhóm phenolics Không xuất mũi hấp thu cực đại vùng khoảng 570 nm AZRL [77] 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN Kết thô bàn luận 4.1 - AZRL có phản ứng màu với vanillin mơi trường axit H2SO4 - Phương pháp so màu Vanillin sử dụng dichloromethane & ethanol phương pháp so màu vanillin sử dụng ethanol chưa thể xác định hàm lượng AZRL dịch chiết neem - Nên cần tiền hành thử phản ứng vanillin theo Dai et al.,1999 theo phương pháp HPLC 4.2 Kết luận Tiếp tục tìm phương pháp để định lượng hiệu AZ AZRL dịch chiết neem để phối vào chế phẩm phẩm thuốc trừ sâu Tiến hành nghiên cứu theo mục tiêu đề cương đề Đây đề tài có ý nghĩa mặt khoa học thực tiễn, cần triển khai nghiên cứu sâu rộng để phục vụ ngành nông nghiệp nước ta 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] N R Council, Neem: a tree for solving global problems The Minerva Group, Inc., 2002 S Pankaj, T Lokeshwar, B Mukesh, and B Vishnu, "Review on neem (Azadirachta indica): thousand problems one solution," Int Res J Pharm, vol 2, no 12, pp 97-102, 2011 L C Định, "Giới thiệu cấy xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) nhập nội vào vùng cát nóng hạn Phan Thiết- Tuy Phong " Sở Nơng nghiệp Thuận Hải, 1991 V S Kumar and V Navaratnam, "Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind," Asian Pacific journal of tropical biomedicine, vol 3, no 7, pp 505514, 2013 B Hicks, "Developments in the world of neem," Pesticide Outlook, vol 14, no 3, pp 102-103, 2003 J D Stark and J F Walter, "Neem oil and neem oil components affect the efficacy of commercial neem insecticides," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 43, no 2, pp 507-512, 1995 V Vijayan, S Aafreen, S Sakthivel, and K R Reddy, "Formulation and characterization of solid lipid nanoparticles loaded Neem oil for topical treatment of acne," Journal of Acute Disease, vol 2, no 4, pp 282-286, 2013 C S Kumar, M Srinivas, and S Yakkundi, "Limonoids from the seeds of Azadirachta indica," Phytochemistry, vol 43, no 2, pp 451-455, 1996 D Mongkholkhajornsilp, S Douglas, P L Douglas, A Elkamel, W Teppaitoon, and S Pongamphai, "Supercritical CO extraction of nimbin from neem seeds––a modelling study," Journal of Food Engineering, vol 71, no 4, pp 331-340, 2005 D J Hansen, J Cuomo, M Khan, R T Gallagher, and W P Ellenberger, "Advances in neem and azadirachtin chemistry and bioactivity," ACS Publications, 1994 I Ara, B S Siddiqui, S Faizi, and S Siddiqui, "Tricyclic diterpenoids from the stem bark of Azadirachta indica," Journal of Natural Products, vol 51, no 6, pp 1054-1061, 1988 D Lavie, M K Jain, and S Shpan-Gabrielith, "A locust phagorepellent from two Melia species," Chemical Communications (London), no 18, pp 910-911, 1967 S Siddiqui, T Mahmood, B S Siddiqui, and S Faizi, "Isolation of a triterpenoid from Azadirachta indica," Phytochemistry, vol 25, no 9, pp 2183-2185, 1986 S Siddiqui, S Faizi, T Mahmood, and B S Siddiqui, "Two new insect growth regulator meliacins from Azadirachta indica A Juss (Meliaceae)," Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, pp 1021-1025, 1986 S Siddiqui, B S Siddiqui, and S Faizi, "Studies in the Chemical Constituents of Azadirachta indica Part II: Isolation and Structure of the New Triterpenoid Azadirachtol," Planta medica, vol 51, no 06, pp 478-480, 1985 S FAIZI and T MAHMOOD, "SALIMUZZAMAN SIDDIQUI, BINA SHAHEEN SIDDIQUI," J Chem Soc, vol 8, no 3, p 341, 1986 S Siddiqui, B S Siddiqui, and S Faizi, "Tetracyclic triterpenoids of the fruit coats of Azadirachta indica," Journal of natural products, vol 54, no 2, pp 408-415, 1991 P S Jones, S V Ley, E D Morgan, and D Santafianos, "The chemistry of the neem tree," Focus on phytochemical pesticides, vol 1, pp 19-45, 1989 P G Waterman and M F Grundon, Chemistry and chemical taxonomy of the Rutales Academic Press, 1983 D Lavie, E Levy, and M Jain, "Limonoids of biogenetic interest from Melia azadirachta L," Tetrahedron, vol 27, no 16, pp 3927-3939, 1971 54 [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] J Connolly, K Handa, and R McCrindle, "Further constituents of nim oil: The constitution of meldenin," Tetrahedron Letters, vol 9, no 4, pp 437-440, 1968 R Pachapurkar, P Kornule, and C Narayana, "A new hexacyclic tetranortriterpenoid," Chemistry Letters, vol 3, no 4, pp 357-358, 1974 R B Yamasaki and J A Klocke, "Structure-bioactivity relationships of azadirachtin, a potential insect control agent," Journal of agricultural and food chemistry, vol 35, no 4, pp 467-471, 1987 W Kraus and R Cramer, "Pentanortriterpenoide aus Azadirachta indica A Juss (Meliaceae)," European Journal of Inorganic Chemistry, vol 114, no 7, pp 2375-2381, 1981 A Bruhn, M Bokel, and W Kraus, "4α-6α-Dihydroxy-A-homoazadiron, ein neues tetranortriterpenoid aus Azadirachta indica A Juss (Meliaceae)," Tetrahedron letters, vol 25, no 34, pp 3691-3692, 1984 S SIDDIQUI, S FAIZI, and B Siddiqui, "Studies on the chemical constituents of Azadirachta indica A Juss (Meliaceae) I: Isolation and structure of a new tetranortriterpenoid-nimolicinol," Heterocycles, vol 22, no 2, pp 295-298, 1984 H Schmutterer, "Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica," Annual review of entomology, vol 35, no 1, pp 271-297, 1990 K Sundaram and J Curry, "High performance liquid chromatographic method for the analysis of azadirachtin in two commercial formulations and neem oil," Journal of Environmental Science & Health Part B, vol 28, no 2, pp 221-241, 1993 H.-P Huang and E D Morgan, "Analysis of azadirachtin by supercritical-fluid chromatography," Journal of Chromatography A, vol 519, no 1, pp 137-143, 1990 R Gahukar, "Factors affecting content and bioefficacy of neem (Azadirachta indica A Juss.) phytochemicals used in agricultural pest control: a review," Crop Protection, vol 62, pp 93-99, 2014 T Govindachari, G Sandhya, and S Ganesh Raj, "STRUCTURE OF AZADIRACTIN K, A NEW TETRANORTRITERPENOID FROM AZADIRACHTA INDICA," Indian journal of chemistry Sect B: Organic chemistry, including medical chemistry, vol 31, no 6, pp 295-298, 1992 T R Govindachari, G Sandhya, and S P G Raj, "Azadirachtins H and I: two new tetranortriterpenoids from Azadirachta indica," Journal of Natural Products, vol 55, no 5, pp 596-601, 1992 H O Kalinowski, K Ermel, and H Schmutterer, "Strukturaufklärung eines Azadirachtinderivates aus dem Marrangobaum Azadirachta excelsa durch NMR‐Spektroskopie," European Journal of Organic Chemistry, vol 1993, no 9, pp 1033-1035, 1993 W Kraus, "Constituents of neem and related species A revised structure of azadirachtin," Studies in organic chemistry, vol 26, pp 237-256, 1986 W Kraus et al., "Control of insect feeding and development by constituents of Melia azedarach and Azadirachta indica," in Proc rd International Neem Conference, Nairobi, Kenya, 1987, pp 375-385 H Rembold, H Forster, and C Czoppelt, "Structure and biological activity of azadirachtins A and B," in Proc 3rd Int Neem Conf., Nairobi, Kenya, 1986, pp 149-160 R H Verkerk and D J Wright, "Biological activity of neem seed kernel extracts and synthetic azadirachtin against larvae of Plutella xylostella L," Pest Management Science, vol 37, no 1, pp 83-91, 1993 J Dai, V A Yaylayan, G V Raghavan, and J R Parè, "Extraction and colorimetric determination of azadirachtin-related limonoids in neem seed kernel," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 47, no 9, pp 3738-3742, 1999 H Gunasena and B Marambe, Neem in Sri Lanka: a monograph University of Peradeniya-Oxford Forestry Institute (UK) Forestry Research Link, 1997 55 [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] W Blaney and M Simmonds, "A behavioural and electrophysiological study of the role of tarsal chemoreceptors in feeding by adults of Spodoptera, Heliothis virescens and Helicoverpa armigera," Journal of Insect Physiology, vol 36, no 10, pp 743747-745756, 1990 H Schmutterer, K Ascher, and H Rembold, "Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A Juss)," in International Neem Conference 1980: Rottach-Egern, Germany), 1981: German Agency for Technical Cooperation H Schmutterer, K Ascher, and H Rembold, "Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta Indica A Juss) Proceedings of the First International Neem Conference, Rottach-Egern, Federal Republic of Germany 16-18 Jun, 1980," 1981 B Joshi, G Ramaprasad, and S Nageswara Rao, "Neem seed kernel suspension as an antifeedant for Spodoptera Litura in a planted flue-cured Virginia tobacco crop," Phytoparasitica, vol 12, no 1, pp 3-12, 1984 R Saxena, H Justo, and P Epino, "Evaluation and utilization of neem cake against the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae)," Journal of economic entomology, vol 77, no 2, pp 502-507, 1984 V Sharma, M Ansari, and R Razdan, "Mosquito repellent action of neem (Azadirachta indica) oil," Journal of the American Mosquito Control Association, vol 9, no 3, p 359, 1993 S Singh and R Singh, "Neem (Azadirachta indica) seed kernel extracts and azadirachtin as oviposition deterrents against the melon fly (Bactrocera cucurbitae) and the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis)," Phytoparasitica, vol 26, no 3, pp 191-197, 1998 N Z Dimetry, S Amer, and A Reda, "Biological activity of two neem seed kernel extracts against the two‐spotted spider mite Tetranychus urticae Koch," Journal of Applied Entomology, vol 116, no 1‐5, pp 308-312, 1993 O Koul, "Azadirachtin: I‐interaction with the development of red cotton bugs," Entomologia experimentalis et applicata, vol 36, no 1, pp 85-88, 1984 T Gajmer, R Singh, R Saini, and S Kalidhar, "Effect of methanolic extracts of neem (Azadirachta indica A Juss) and bakain (Melia azedarach L) seeds on oviposition and egg hatching of Earias vittella (Fab.)(Lep., Noctuidae)," Journal of applied Entomology, vol 126, no 5, pp 238-243, 2002 P Medina, F Budia, L Tirry, G Smagghe, and E Vinuela, "Compatibility of spinosad, tebufenozide and azadirachtin with eggs and pupae of the predator Chrysoperla carnea (Stephens) under laboratory conditions," Biocontrol Science and Technology, vol 11, no 5, pp 597-610, 2001 R Saxena, "Insecticides from neem," ACS Publications, 1989 H Oberlander, D L Silhacek, E Leach, I Ishaaya, and E Shaaya, "Benzoylphenyl ureas inhibit chitin synthesis without interfering with amino sugar uptake in imaginal wing discs of Plodia interpunctella (Hübner)," Archives of insect biochemistry and physiology, vol 18, no 4, pp 219227, 1991 P Mikołajczyk, H Oberlander, D L Silhacek, I Ishaaya, and E Shaaya, "Chitin synthesis in Spodoptera frugiperda wing imaginal discs: I Chlorfluazuron, diflubenzuron, and teflubenzuron inhibit incorporation but not uptake of [14C] N‐acetyl‐D‐glucosamine," Archives of insect biochemistry and physiology, vol 25, no 3, pp 245-258, 1994 G Brahmachari, "Neem—an omnipotent plant: a retrospection," Chembiochem, vol 5, no 4, pp 408-421, 2004 Anon, "Annual Report for the division of Arable Crops Research 1984-85," 1986 Department of Agricultural Research, Department of Agricultural Research, Ministry of Agriculture, Government of Botswana, Gaborone, Botswana 56 [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] E Rajeswari and V Mariappan, "Effect of plant derivatives on rice blast pathogen, Pyricularia oryzae, blast infection and enzymes of paddy plants," in Proceedings of The World Neem Conference, Bangalore, 1993, pp 78-79 H J Zeringue and D Bhatnagar, "Inhibition of aflatoxin production inAspergillus flavus infected cotton bolls after treatment with neem (Azadirachta indica) leaf extracts," Journal of the American Oil Chemists' Society, vol 67, no 4, pp 215-216, 1990 M Siddiqui and M Alam, "Effect of root-exudates of neem and Persian lilac on plant parasitic nematodes," Anzeiger für Schädlingskunde, vol 62, no 2, pp 33-35, 1989 K Vijayalakshmi, H Gaur, and B Goswami, "Neem for the control of plant parasitic nematodes," Neem Newsletter, vol 2, no 4, pp 35-40, 1985 S R Damarla, S Sridhar, and M C Gopinathan, "Compositions containing neem seed extracts and saccharide," ed: Google Patents, 2002 P M Murali, "Process of preparing purified azadirachtin in powder form from neem seeds and storage stable aqueous composition containing azadirachtin," ed: Google Patents, 2001 P Murali, "Process for preparing purified Azadirachtin in powder form from neem seeds and storage stable aqueous composition containing Azadirachtin," ed: Google Patents, 1998 A V B Sankaram et al., "Pesticidal dry powder formulation enriched in azadirachtin up to 88% an emulsifiable concentrate enriched up to 30% of azadirachtin and a process for preparing such formulation and concentrate from neem seed/kernel," ed: Google Patents, 1999 Z Lidert, C G Overberger, and J S Clovis, "Preparation of high purity neem seed extracts," ed: Google Patents, 1995 R O Larson, "Stable anti-pest neem seed extract," ed: Google Patents, 1985 Z Lidert, "Insecticidal hydrogenated neem extracts," ed: Google Patents, 1990 E Melwita and Y.-H Ju, "Separation of azadirachtin and other limonoids from crude neem oil via solvent precipitation," Separation and Purification Technology, vol 74, no 2, pp 219-224, 2010 J A M de Paula, L F Brito, K L F N Caetano, M C de Morais Rodrigues, L L Borges, and E C da Conceiỗóo, "Ultrasound-assisted extraction of azadirachtin from dried entire fruits of Azadirachta indica A Juss.(Meliaceae) and its determination by a validated HPLC-PDA method," Talanta, vol 149, pp 77-84, 2016 G Jadeja, R Maheshwari, and S Naik, "Extraction of natural insecticide azadirachtin from neem (Azadirachta indica A Juss) seed kernels using pressurized hot solvent," The Journal of Supercritical Fluids, vol 56, no 3, pp 253-258, 2011 V N Phượng, P Đ Trí, T X Du, and N V Uyển, "Nhân giống in vitro xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A.Juss)," Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ 1999- 2000 Viện Sinh học Nhiệt đới, 2001 Nhà xuất Nông nghiệp D A Tuấn and et al, "Azdirachtin- Hoạt chất gây ngán ăn mạnh sâu khoang phân lập từ hạt neem (Azadirachta indica A.Juss) di thực vào Việt Nam.," Tuyển tập Hội nghị Khoa học Cơng nghệ hóa hữa tồn quốc lần thứ hai., pp Trang 333- 337, 2001 Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, Hà Nội V Đ Khánh, "Khảo sát hoạt tính kháng số lồi nấm gây bệnh nấm Aspergiluss flavus sinh độc tố aflatoxins sản phẩm chiết xuất từ neem trồng Việt Nam ," Luận văn Thạc sĩ, 2004 Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hồ Chí Minh L T T Phượng, "Chiết xuất hoạt chất sinh học từ hạt neem khỏa sát tác động chúng ngài gạo (Corcyra cephalonica St) ," Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, 2004 Đại học Nông Lâm, Hồ Chí Minh V Đ K Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng, "Đánh giá độ độc chế phẩm phối trộn dầu neem với Bt (Baccillus thuringiensis) sâu xanh (Heliothis armigara), sâu tơ (Plutella xylostella)," Viện Sinh học Nhiệt Đới- Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Quốc Gia 2005 57 [75] [76] [77] V V Đ Nguyễn Tiến Thắng, Đỗ Thị Tuyến, Lê Thị Thanh Phượng, Vũ Đăng Khánh, "Xây dựng qui trình chiết xuất hoạt chất sinh học từ hạt neem trồng Việt Nam khảo sát ảnh hưởng dịch chiết lên phát triển nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum, Alternaria sp.) Ngài Gạo (Corcyra cephalonica st.)," Báo cáo đề tài cấp sở- Viện Sinh học Nhiệt đới, 2003 N T Ý Nhi, "Nghiên cứu thành phần limonoid neem trồng Ninh Thuận," ĐH Khoa học Tự Nhiên Hồ Chí Minh, 2012 J Dai, V A Yaylayan, G Vijaya Raghavan, J R Pare, and Z Liu, "Multivariate calibration for the determination of total azadirachtin-related limonoids and simple terpenoids in neem extracts using vanillin assay," Journal of agricultural and food chemistry, vol 49, no 3, pp 1169-1174, 2001 58 ... 1.2.3 Các hoạt chất 1.2.3.1 Azadirachtin Trong limonoids, azadirachtin xem chất có đặc tính hoạt động nhất, tính chất tác dụng lên đa số trùng khác [27] Chiết xuất azadirachtin sử dụng thuốc trừ sâu. .. thu dầu neem, sản phẩm phụ bã tận dụng để chiết lấy hoạt chất trừ sâu Nguyên nhân tận thu chiết bã trình ép chưa lấy hết dầu hạt, đồng thời lượng hoạt chất có nhiều nhân vỏ hạt neem Bã neem xay... nhất, chiết hoạt chất azadirachtin limonoid với dầu neem Tuy hàm lượng azadirachtin với limonoid không cao hiệu mặt kinh tế Nên chon phương pháp để chiết hoạt chất Các yếu tố cần khảo sát để tối