Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm tác giả rất biết ơn sự giúp đỡ tận tình của Cha, Mẹ và những người thân trong gia đình. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Cô TS. Huỳnh Ngọc Oanh và Thầy TS. Nguyễn Hữu Hiếu đã giúp đỡ, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm về cách chọn lọc tài liệu, thông tin cũng như cách làm việc hiệu quả cho đề tài. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Văn phòng Đào tạo Quốc tế OISP – Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQGHCM, giúp đề tài được thực hiện tốt hơn. Chân thành cảm ơn quý anh chị nghiên cứu viên, các bạn sinh viên tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm ĐHQGHCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP) đã truyền đạt kinh nghiệm thực tiễn giúp nhóm tác giả hoàn thành các thí nghiệm. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC -o0o - ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC OISP 2017 TRÍCH LY HOẠT CHẤT AZADIRACHTIN TỪ CÂY NEEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TRÊN TÔM GVHD: TS Huỳnh Ngọc Oanh SVTH: Nguyễn Trịnh Phương Mai Chung Ngọc Diệp Lê Bá Khoa TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm tác giả biết ơn giúp đỡ tận tình Cha, Mẹ người thân gia đình Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Cơ TS Huỳnh Ngọc Oanh Thầy TS Nguyễn Hữu Hiếu giúp đỡ, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cách chọn lọc tài liệu, thông tin cách làm việc hiệu cho đề tài Nhóm tác giả chân thành cảm ơn tài trợ kinh phí Văn phịng Đào tạo Quốc tế OISP – Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM, giúp đề tài thực tốt Chân thành cảm ơn quý anh chị nghiên cứu viên, bạn sinh viên Phịng Thí nghiệm trọng điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP) truyền đạt kinh nghiệm thực tiễn giúp nhóm tác giả hồn thành thí nghiệm Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2018 Trưởng nhóm sinh viên Nguyễn Trịnh Phương Mai i TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, hạt neem chọn làm đối tượng nghiên cứu tiến hành trích ly dầu neem phương pháp trích ly Soxhlet Hiệu trích ly thể qua hiệu suất thu hồi dầu, phân tích hàm lượng azadirachtin phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao Thử nghiệm khả kháng khuẩn dầu trích phương pháp đục lỗ thạch đĩa môi trường thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose Kết nghiên cứu cho thấy dầu neem đạt hiệu suất cao 23,7% trích dung mơi metanol, tỉ lệ ngun liệu/dung mơi 1/25 (g/mL) với trích cô quay chân không 60oC Kết phân tích hàm lượng azadirachtin dầu neem đạt 518 mg/kg mẫu dầu có khả kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus ii LỜI CAM ĐOAN Nhóm tác giả xin cam đoan đề tài nghiên cứu khoa học cơng trình độc lập nhóm tơi Các số liệu thơng tin tham khảo q trình thực có nguồn gốc rõ ràng trích dẫn theo quy định Các kết nghiên cứu kết luận đề tài thành viên nhóm tự phân tích cách trung thực, khách quan, khơng chép hình thức Các kết chưa công bố tài liệu khác Trưởng nhóm sinh viên Nguyễn Trịnh Phương Mai iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu neem 1.1.1 Phân bố danh pháp 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 1.2 Hoạt chất sinh học dầu neem (azadirachtin) 1.3 Phương pháp chiết xuất 1.3.1 Ngâm chiết 1.3.2 Phương pháp trích ly Soxhlet 1.4 Hoạt tính kháng khuẩn dầu neem 1.4.1.Chất kháng sinh nuôi trồng thủy sản 1.4.2 Vi khuẩn Vibrio spp 10 1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 13 1.5.1 Tính cấp thiết 13 1.5.2 Mục tiêu nghiên cứu 13 1.5.3 Nội dung nghiên cứu 13 1.5.3 Phương pháp nghiên cứu 13 iv CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 16 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị địa điểm thực 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 17 2.1.4 Địa điểm thực 19 2.2 Quy trình trích ly 19 2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly 19 2.4 Định lượng azadirachtin dầu neem 20 2.5 Thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tôm 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Điều kiện trích ly 23 3.1.1 Ảnh hưởng loại dung môi khác đến chất lượng dầu neem 23 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượng dầu neem 23 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian trích đến chất lượng dầu neem 24 3.2 Phân tích hàm lượng AZA dầu neem HPLC 24 3.3 Thử nghiệm tính kháng khuẩn 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 30 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh gây vi khuẩn Vibrio ngành thủy sản 11 Bảng 2.1 Danh sách hóa chất vật liệu 17 Bảng 2.2 Danh sách dụng cụ thiết bị thí nghiệm 17 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng dung môi 20 Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liêu/dung môi 20 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly 20 Bảng 2.6 Điều kiện pha động 20 Bảng 3.1 Kết khối lượng dầu neem theo loại dung môi khác 23 Bảng 3.4 Kết thử nghiệm kháng khuẩn 25 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây neem tuổi Hình 1.2 Các phận neem: (a) Quả lá, (b) Hoa, (c) Hạt khơ Hình 1.3 Cấu trúc 2D 3D phân tử azadirachtin Hình 1.4 Mơ hình thiết bị tẩm trích có cánh khuấy Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động thiết bị trích ly Soxhlet Hình 1.6 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 12 Hình 1.7 So sánh tơm khoẻ tơm nhiễm bệnh EMS 12 Hình 1.8 Sơ đồ hoạt động hệ thống phân tích HPLC 15 Hình 2.1 Hạt neem sau sấy khơ 16 Hình 2.2 Hệ thống trích Soxhlet 18 Hình 2.3 Thiết bị cô quay chân không Buchi 18 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình trích ly 19 Hình 3.1 Đường chuẩn azadirachtin 25 Hình 3.2 Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus 26 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ AZA Azadirachtin DMSO Dimethyl Sulfoxit MHA Mueller – Hinton Agar HPLC TCBS High Performance Liquid Chromatography Giải thích Thạch Mueller - Hinton Sắc ký lỏng hiệu cao Thiosulfate -citrate-bile salts-sucrose LB Lysogeny broth EMS Early mortality syndrome viii Hoại tử gan tụy cấp ĐẶT VẤN ĐỀ Cây neem, cịn gọi Xoan Ấn, có tên khoa học Azadirachta indica, thuộc họ dái ngựa (Meliaceae), trồng hầu hết vùng nhiệt đới cận nhiệt đới giới, chủ yếu Ấn Độ Hiện trồng để che bóng mát, phục vụ cho chương trình trồng bảo vệ rừng Theo dân gian, neem có chứa chất tác dụng chống viêm, giảm sốt, chống nấm, chống histamine, sát trùng, ức chế tăng trưởng côn trùng [1] Các hoạt chất từ neem dùng làm thuốc trừ sâu tự nhiên hóa chất nơng nghiệp Chất kháng sinh thuốc hóa chất tiêu diệt vi khuẩn có hại thể hạn chế phát triển vi khuẩn Gần đây, thực trạng lạm dụng chất kháng sinh nuôi trồng thủy sản trở nên phổ biến, dẫn đến phát sinh dịch bệnh nghiêm trọng kháng thuốc loại vi khuẩn gây bệnh tôm cá, đặc biệt vi khuẩn Vibrio spp làm thu hẹp nhiều diện tích ni trồng thủy sản Nghiêm trọng hơn, người tiêu thụ loại thực phẩm dẫn đến phản ứng như: chân tay run rẩy, co giật, thay đổi vi sinh ruột, thay đổi tổng hợp vitamin chí tử vong tiêu thụ q nhiều Bên cạnh đó, điều cịn dẫn đến kháng thuốc gây khó khăn cho người điều trị nhiễm trùng Các nghiên cứu trích ly hợp chất neem trước hầu hết khơng đề cập chuyên sâu tính chất kháng khuẩn khảo sát tính kháng khuẩn azadirachtin nhiều loại chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mirabilis, Staphylococcus aureus [2] Cho đến nay, chưa có cơng bố ngồi nước nghiên cứu tính kháng khuẩn dầu neem azadirachtin giống vi khuẩn Vibrio spp., đặc biệt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tơm Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học bước đầu thực trích ly hoạt chất azadirachtin, hợp chất có tính chất kháng khuẩn cao, từ ngun liệu ban đầu hạt neem, đồng thời khảo sát sơ tính kháng khuẩn vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tôm Với kết khảo sát đóng góp thêm cho việc 2.1.4 Địa điểm thực Nghiên cứu thực Phịng thí nghiệm trọng điểm Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP), 119B2, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 2.2 Quy trình trích ly Quy trình trích ly azadirachtin thực theo sơ đồ hình 2.4 Hạt neem xay nhuyễn Trích ly Cơ quay chân khơng Dầu neem Hình 2.4 Sơ đồ quy trình trích ly Thuyết minh quy trình: Cân xác 10 g mẫu gói giấy lọc đảm bảo mẫu khơng bị dính nước tạp chất gây sai số Thêm lượng dung môi thích hợp vào bình cầu đế lắp đặt hệ thống trích (nối bình cầu với ống trích ống sinh hàn ống nối nhỏ) Sau thời gian trích, dịch trích thu cần phải quay chân không điều kiện 600C để thu dầu neem Dầu neem thu bình cầu với dung môi 2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly Thực theo quy trình hình 1.5 với yếu tố ảnh hưởng khảo sát theo bảng 2.3, bảng 2.4 bảng 2.5 sau: 19 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng dung môi Mẫu Isopropyl Etanol Etyl acetate Metanol Yếu tố Dung môi Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liêu/dung môi Mẫu Yếu tố Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi (g:mL) 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly Mẫu Yếu tố Thời gian trích ly (h) 1,5 2,5 3,5 2.4 Định lượng azadirachtin dầu neem Sau thu dầu neem ứng với điều kiện trích phù hợp, hàm lượng azadirachtin phân tích phương pháp HPLC Phịng thí nghiệm trọng điểm Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP) Mẫu phân tích hệ thống HPLC Agilent 1260 - Chương trình pha động thể bảng 2.6 Bảng 2.6 Điều kiện pha động 20 Thời gian, ACN MeOH H2O Tốc độ dòng mL/min 36 37 45 46 50 30 30 50 50 30 30 0 50 50 0 70 70 0 70 70 1 1 1 Đầu dò: DAD ( diode-array detector ) Bước sóng: 215 mm Ct RP C18 (250ì4,6 mmì15àm) Th tớch mu: 20 µm Nhiệt độ cột: 25ºC - Quy trình dựng chuẩn: Dùng cân phân tích cân 0,01g chất chuẩn azadirachtin, xác đến 0,00001g vào bình định mức 10 mL, hòa tan định mức đến vạch metanol thu dung dịch B Dùng pipet lấy xác mL dung dịch B vào bình định mức 10 mL, pha loãng đến vạch metanol Lọc dung dịch màng lọc 0,45 µm sau mẫu phân tích azadirachtin HPLC - Quy trình phân tích mẫu: pha loãng dầu neem 10 lần methanol, lọc qua màng mọc 0,45 µm trước tiêm vào hệ thống HPLC tương tự dựng chuẩn 2.5 Thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tôm Mẫu dầu neem thử nghiệm tính kháng khuẩn Trung tâm Khoa Học Công Nghệ Sinh Học_ Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Các bước thực hiện: - Trải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nồng độ 106 CFU/mL lên bề mặt thạch TCBS; - Đục lỗ thạch cách xa nhau; 21 - Nạp 100 µL chất kháng khuẩn nồng độ khác nhau; - Ủ đĩa 37○C, qua đêm (16-24 h) Đọc kết cách đo vịng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Điều kiện trích ly 3.1.1 Ảnh hưởng loại dung môi khác đến chất lượng dầu neem Ảnh hưởng loại dung môi đến chất lượng dầu neem thể qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khối lượng dầu neem theo loại dung môi khác Dung môi Khối lượng dầu neem (g) Hiệu suất (%) Isopropyl 0,86 8,6 Etanol 0,97 9,7 Etyl acetate 1,35 13,5 Metanol 1,57 15,7 Bảng 3.1 cho thấy ảnh hưởng loại dung môi khác đến khối lượng dầu neem Trong đó, metanol cho sản phẩm trích có khối lượng hiệu suất cao cụ thể 1,57g hiệu suất 15,7 % isopropyl cho hiệu suất thấp với khối lượng 0,86g hiệu suất 8,6 % Điều giải thích: dung mơi phân cực mạnh, azadirachtin hịa tan tốt, góp phần tăng hiệu suất trích Với số liệu thể bảng 3.1, metanol chọn làm dung mơi để tiến hành thí nghiệm 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượng dầu neem Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượng dầu neem thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết khối lượng dầu neem theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khác Nguyên liệu/dung môi (g/mL) Khối lượng dầu neem(g) Hiệu suất (%) 1/15 1/20 1/25 1/30 1/35 1,52 1,54 1,57 1,59 1,6 15,2 15,4 15,7 15,9 16 23 Dựa số liệu bảng 3.2 nhận thấy tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tăng lên từ 1/25 (g/mL) đến 1/35 (g/mL) hiệu suất khối lượng dầu neem thay đổi không đáng kể Khi cân nhắc yếu tố tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, hiệu suất khối lượng dầu thu tỉ lệ 1/25 (g/mL) tỉ lệ tối ưu để thực thí nghiệm 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian trích đến chất lượng dầu neem Ảnh hưởng thời gian trích đến chất lượng dầu neem thể qua bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khối lượng dầu neem theo thời gian trích khác Thời gian trích Khối lượng (h) dầu neem (g) 1,5 1,57 15,7 1,93 19,3 2,5 2,12 21,2 2,24 22,4 3,5 2,32 23,2 2,37 23,7 Hiệu suất (%) Ảnh hưởng thời gian trích đến chất lượng dầu neem trình bày theo bảng 3.3 Khi tăng thời gian từ 1h30 lên 2h khối lượng dầu neem tăng nhanh 0,36 g tăng từ 3h30 đến 4h khối lượng dầu neem tăng lên tăng chậm Dựa số liệu thu bảng 3.3 nhận thấy trích ly với thời gian 4h thu khối lượng dầu hiệu suất cao Do đó, thời gian trích 4h thời gian tối ưu chọn để tiến hành thí nghiệm 3.2 Phân tích hàm lượng AZA dầu neem HPLC Áp dụng mơ hình hồi quy tuyến tính ta thiết lập đường chuẩn có năm nồng độ từ 28,27 đến 68,06 mg (Hình 3.1) Từ xác định hệ số (R2) 0,99992 phương trình hồi quy tuyến tính (3.1) y = 23.52x − 0.285 Giá trị y x diện tích đỉnh (peak) nồng độ azadirachtin 24 (3.1) Diện tích đỉnh (peak) mg Hình 3.1 Đường chuẩn azadirachtin Từ đường chuẩn hình 3.1, thực phân tích hàm lượng AZA tương tự với chuẩn Kết cho thấy, hàm lượng azadirachtin sau phân tích HPLC 518 mg/kg 3.3 Thử nghiệm tính kháng khuẩn Kết thử nghiệm kháng khuẩn thể bảng 3.4 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm kháng khuẩn Nồng độ cao trích (%) Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Nước cất 6,25 12,5 7,6 25 9,9 50 12,5 100 16,4 100% DMSO đối chứng (-) 25 Đường kính vịng kháng khuẩn cao trích nồng độ pha loãng khác kết đối chứng thể qua bảng 3.4 Theo thử nghiệm cao trích khơng pha lỗng (100% cao trích), đường kính vịng kháng khuẩn 11,4 mm Khi pha loãng 50%; 25%; 12,5%; 6,25% đường kính giảm cịn 12,5; 9,9; 7,6; mm Đồng thời, tiến hành thử nghiệm đối chứng với dung mơi pha lỗng cao trích Kết cho thấy dung mơi khơng có khả kháng khuẩn Từ đó, cho thấy dung mơi khơng ảnh hưởng khả kháng khuẩn cao trích Hình 3.2 Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN Trong nghiên cứu khoa học này, dầu neem trích ly phương pháp Soxhlet từ hạt với loại dung môi metanol, etanol, isopropanol, etyl acetat Kết cho thấy, metanol cho sản phẩm trích có khối lượng hiệu suất cao cụ thể 1,57g hiệu suất 15,7 % Qua metanol dung môi phù hợp để tiến hành thí nghiệm Sử dụng dung mơi metanol để tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố như, thời gian trích ly, tỉ lệ ngun liệu/dung mơi Kết dầu neem đạt hiệu suất cao 23.7% sau trích ly tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/25 (g/mL) chọn tỷ lệ tối ưu để trích ly dầu neem Hàm lượng azadirachtin cao trích xác định HPLC có giá trị 518 mg/kg Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn cho thấy dầu neem có khả kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tôm 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mordue (Luntz), A Jennifer, & Nisbet, Alasdair J (2000) Azadirachtin from the neem tree Azadirachta indica: its action against insects Anais da Sociedade Entomológica Brasil, 29(4), 615-632 https://dx.doi.org/10.1590/S0301-80592000000400001 [2] Asif, M (2012) Antimicrobial Potential of Azadirachta indica Against Pathogenic Bacteria and Fungi Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 1(4), 78-83 ISSN 2278- 4136 [3] Đạt, D (July 7th, 2017) Cây neem cơng dụng Retrieved from https://beline.vn/cay-neem-la-cay-gi-va-tac-dung-cua-no-nhu-nao/ [4] S Navie and S Adkins, The Environmental Weeds of Australia, Centre for Biological Information Technology, University of Queensland [5] Trường, L (August 24th, 2006) Bóng mát rừng neem Retrieved from https://tuoitre.vn/bong-mat-rung-neem-157783.htmL [6] National Center for Biotechnology Information PubChem Compound Database; CID=5281303 Retrieved from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5281303 [7] Minh, N.V (September 13th, 2015) Các phương pháp sản xuất tinh dầu (thông tin tổng hợp) Retrieved from http://greentecco.net/cac-phuong-phap-san-xuat-tinh-dau-thong-tintong-hop-31889u.htmL [8] Pearce, F (July 9th, 2017) What method of extraction is used to extract caffeine from tea leaves? Retrieved from https://www.quora.com/What-method-of-extraction-is-usedto-extract-caffeine-from-tea-leaves [9] Tâm, N.T., Khánh, N.P., Nhung, P.T.H (2014) Tình hình nhiễm vi khuẩn Vibrio spp tơm bạc (Penaeus merguiensis), tôm sú (Penaeus monodon), tôm rảo đất (Metapenaeus ensis) số chợ thuộc quận Ninh Kiều thành phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học trường đại học Cần Thơ (2): 111-115 [10] Vi Khuẩn Vibrio Parahaemolyticus (September 4th, 2017) Retrieved from http://ydvn.net/contents/view/24391.vi-khuan-vibrio-parahaemolyticus.htmL 28 [11] Martin-Laurent F, Philippot L, Hallet S, Chaussod R, Germon JC, et al., DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods Appl Environ Microbiol 67: 2354-2359, 2001 [12] Dr.tom, (April 20th, 2018) Phịng bệnh chết sớm tơm thẻ chân trắng, tôm sú from https://drtom.vn/benh-tom-chet-som.htmL [13] Phạm Luận, Phương pháp phân tích sắc kí Tách chiết, NXB Bách khoa Hà Nội, 2014 [14] Bùi Xuân Vững, Cơ sở phân tích sắc kí, NXB Sư phạm Đà Nẵng, 2012 [15] Töppner, K., Hansen, D., Herbig, E (May 6th, 2014) HPLC Analysis The Role of Ultrapure Water Retrieved 29 PHỤ LỤC Sắc ký đồ chuẩn azadirachtin 30 31 32 33 ... cứu: ? ?Trích ly hoạt chất azadirachtin từ neem phương pháp chiết Soxhlet thử nghiệm khả kháng khuẩn Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tôm? ?? 1.5.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài trích ly thành... thành công hoạt chất azadirachtin từ hạt neem kết luận khả kháng khuẩn Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tôm dầu neem 1.5.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Trích ly azadirachtin từ hạt neem - Nội... hoạt chất azadirachtin, hợp chất có tính chất kháng khuẩn cao, từ nguyên liệu ban đầu hạt neem, đồng thời khảo sát sơ tính kháng khuẩn vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tôm