Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử (Nội dung hoàn chỉnh)

Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa, cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh tế xã hội.

PHẦN I: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa, cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả Cây dứa với ưu thế chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh

tế xã hội Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả nước (36.541 ha năm 2002) (Tuấn và Tiến, 2002) nhằm tăng sản lượng cho tiêu dùng

và nguyên liệu cho các nhà máy chế biến ở các tỉnh như: Tiền Giang, Kiên Giang, Long An, Hậu Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai Trước đây, dứa Queen được trồng phổ biến ở nước ta nhưng có nhiều nhược điểm không phù hợp với công nghệ cơ giới và tỉ lệ thành phần trong chế biến thấp Chính vì thế, dứa Cayenne đang

là giống được quan tâm với nhiều đặc điểm tốt và diện tích trồng đạt 3600 ha năm

2002 ở các tỉnh phía Bắc và Đông Nam Bộ (Tuấn và Tiến, 2002) Tuy nhiên, diện tích trồng mới nguồn vật liệu này vẫn còn thấp do nhu cầu giống chưa đủ và phần lớn giống là nhập ngoại Vì vậy, trước hết cần phải tìm hiểu tính đa dạng di truyền của giống dứa Cayenne, trên cơ sở đó để thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các giống cây trồng sẵn có trong nước cũng như du nhập từ nước ngoài

Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa

Cayenne bằng phương pháp marker phân tử”

Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị (marker) DNA (RFLP, RAPD, AFLP, SSR ) Tuỳ vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của dứa Cayenne bằng marker RAPD

Hy vọng kết quả của đề tài này sẽ đóng góp một phần nhất định vào tiền đề của công tác chọn tạo giống dứa ở Việt Nam

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

- Tìm hiểu và sưu tầm nguồn gen của cây dứa Cayene bằng phương pháp chỉ thị (marker) phân tử

- Tìm hiểu sự đa dạng về kiểu hình của các dòng dứa từ giống Cayenne

- Đề xuất vật liệu lai ban đầu cho công tác chọn và tạo giống dứa Cayenne

1.2.2 Yêu cầu

- Thành thạo thao tác ly trích DNA

- Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện

- Nắm vững các kỹ thuật sử dụng chỉ thị RAPD

- Hiểu rõ về các phần mềm xử lý thống kê sinh học như NTSYS-pc, Excel, IRRISTAT

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học

2.1.1 Đa dạng sinh học

Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên-WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa dạng sinh học được định nghĩa như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trường”

Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ:

- Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ

vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm

- Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể

- Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002)

- Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới

2.1.2 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau Sự đa dạng về genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi

cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B Primack, 1999)

Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến

Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường (Richard B Primack, 1999)

2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên

và nó cũng quan trọng đối với con người

Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người

2.2 Giới thiệu chung về dứa Cayene

2.2.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây dứa có tên khoa học Ananas comosus L (Merrill), thuộc họ Bromeliaceae, chi Ananas , trong chi này có 6 loài, trong đó loài Ananas comosus là có giá trị kinh tế

hơn cả Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, theo K.F Baker và J.L.Collin thấy xuất hiện ở

miền nam Braxin, bắc Achentina và Paragoay

Theo Hume và Miller, các giống dứa đang trồng hiện nay được chia làm 3 nhóm: Cayene, Queen (hay còn gọi là Nữ hoàng), Spanish (hay Tây Ban Nha) Trong

đó nhóm Cayene được chia làm các giống như Smooth Cayene, Sarawak (giống có khả năng chịu ẩm, úng và chống bệnh héo), Enville, Baron roth schild, Typhone, Smooth Guatemalan

Ở Việt Nam, theo đều tra nghiên cứu của viện nghiên cứu rau quả đã tập hợp được 3 giống Cayenne được trồng ở nước ta gồm: Cayenne chân mộng trồng ở Vĩnh Phú, Cayenne Phủ Quỳ trồng ở Nghĩa Đàn - Nghệ An, Cayenne Đức Trọng trồng ở Lâm Đồng và ở Nam Bộ chủ yếu là Cayenne trơn nguồn gốc từ Pháp Nguồn gốc của các giống Cayene trồng ở nước ta thường nhập từ nước ngoài và qua tiến hành lai tạo (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002)

2.2.2 Giá trị kinh tế

Về mặt dinh dưỡng, dứa được xem là “hoàng hậu” trong các loại quả vì hương

vị thơm ngon và giàu các chất dinh dưỡng Wooster và Blank (1950) đã phân tích thành phần dinh dưỡng của quả dứa Cayenne ở Hawaii cho kết quả sau:

- Đường 11 - 15 %, saccharose chiếm 1/3, còn lại là glucose và fructose

- Acid: 0,6 % gồm 78 % acid citric, còn lại là acid malic và acid khác

- Hàm lượng các loại vitamin: vitamin A - 130 đơn vị quốc tế, vitamin B1 - 0,02

mg, vitamin C - 4,2 mg / 100 g

- Các chất khoáng: Ca - 16 mg, P - 11 mg, Fe - 0,3mg, Cu - 0,07 mg

- Protein - 0,4 g và lipit - 0,2 g

- Hydratcacbon - 13,7 g, nước 85,5 g và xenlulose - 1,4 g

Ngoài ra trong quả dứa còn có men bromelin giúp cho việc tiêu hoá rất tốt Nó được dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim

Về hiệu quả kinh tế: Cayenne cho quả to, sản lượng cao, có thể đạt trên diện tích lớn ở HaWaii 80 – 100 tấn / ha Aubert cho rằng sản lượng Cayenne có thể gấp đôi dứa Queen Đồng thời, ưu điểm lớn của Cayenne là vỏ mỏng, nước nhiều, quả hình ống, là loại hình lý tưởng để chế biến đồ hộp, dù là dứa khoanh hay nước dứa.Về mặt canh tác, nhờ quả không có gai nên thao tác thuận lợi, hiệu suất lao động tăng lên nhiều Hiện nay ngành nông nghiệp nước ta đang có kế hoạch phát triển và mở rộng diện tích dứa nhằm tăng sản lượng cho các nhà máy chế biến (Vũ Công Hậu, 1999)

2.2.3 Đặc điểm hình thái của dứa Cayenne

Dứa là một loại cây thảo lâu năm: sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một quả; quả thứ hai thường bé hơn quả trước Các mầm nách của cây con lại cho phát triển và cho một quả thứ ba

Cây dứa trưởng thành cao 1,0 - 1,2 m và có hình dạng như một con cù (cù- thứ

đồ chơi của trẻ em) có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt, tán cây xoè rộng Cấu tạo của dứa (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002) gồm có các thành phần sau:

2.2.3.1 Rễ

Rễ thường là bất định và mọc ngang mặt đất Dựa vào nguồn gốc phát sinh chia thành các dạng: rễ cái, rễ nhánh và rễ bất định Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi (nhân giống vô tính) nên mọc từ thân ra, nhỏ và phân nhiều nhánh Ở tầng đất dày rễ có thể ăn sâu 0,9 m Nhưng bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 - 26 cm và phát triển rộng đến 1 m

Rễ dứa thuộc loại háo khí ưa xốp và thoáng nên trồng tốt nhất trên đất đồi feralit đỏ vàng và kém phát triển trên đất cát, đất sét Đồng thời rễ dứa phát triển tốt trong đất có hàm lượng nước từ 10 – 20 %, độ pH thích hợp nhất từ 4.0 - 5.5, giới hạn 3.5 - 6.0 Để cho bộ rễ phát triển bình thường cần cung cấp dinh dưỡng N, P, K, Ca,

Fe, Mg, S…trong đó N, P có vai trò quan trọng Thiếu N, P rễ phát triển kém, không ra quả

Sinh trưởng và phát triển của rễ bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ Trong phạm vi 12 - 300C, nhiệt độ càng tăng bộ rễ phát triển càng mạnh và ngược lại Nhiệt

độ giới hạn 5 - 430C nếu cao hay thấp hơn trong nhiều ngày bộ rễ sẽ chết Theo Mao Tác nghiên cứu 3 giống dứa Cayenne ở Philippin, Đài Loan và Nam Ninh năm 1960 cho biết hoạt động của bộ rễ đạt đỉnh cao vào tháng 5 và tháng 10 do nhiệt độ các tháng này tăng cao Các nguyên liệu chồi khác nhau đem trồng đều có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển bộ rễ dứa

2.2.3.2 Thân

Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần ở dưới đất Hình dạng của thân biểu hiện tình trạng của cây như thân ngắn, bặm chứng tỏ cây khỏe, ngược lại thân dài bé là cây yếu Thân cây dứa trưởng thành dài 20 - 30 cm, đường kính 3 – 7 cm, trọng lượng 200 – 400 g Ở trung tâm thân là một mô rỗng, mềm, chứa các chất dinh dưỡng chứa nhiều tinh bột ở giữa, nối tiếp là một lớp bó mạch có nhiều xơ, và ngoài cùng được bao bọc bởi một lớp biểu bì và gốc lá

Thân mọc khỏe trong đều kiện nhiệt độ 250C trở lên, nếu dưới 50C thì ở đỉnh thân và gốc lá bị những vết cháy do rét Nếu vừa lạnh vừa mưa kéo dài thì đỉnh thân sẽ

bị thối Trường hợp ngập nước thì cả rễ và thân đều bị thối

2.2.3.3 Lá

Lá mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài Mặt lá và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước cho lá Hình dạng lá không có gai, trừ một vài cái gai

ở ngọn, màu xanh thẩm với đốm nâu đỏ, lá dài từ 80 – 100 cm, rộng 5 – 8 cm, khi trưởng thành có khoảng 60 - 80 lá Hình dạng lá thay đổi tuỳ theo vị trí, tuổi của chúng

từ đó dẫn đến việc sắp xếp chúng thành nhiều loại khác nhau Diện tích lá lớn thì quả thường to và ngược lại cho nên cần phải tìm cách tác động cho cây đạt được số lá tối

đa Nhiệt độ giới hạn của dứa là 5 - 400

C Trên 400C cây ngừng hoạt động, ở 80C cây cũng ngừng ra lá, 50C các hoạt động ngừng và dưới 00C cây chết rét Sinh trưởng của

lá còn bị ảnh hưởng bởi độ phì của đất Bón phân bổ sung một cách hợp lý làm cho cây sinh trưởng khỏe, bộ lá sum xuê Vì vậy, ta cần phải cung cấp đủ lượng dinh dưỡng và cân đối giữa NPK cùng các nguyên tố khác để đảm bảo cho bộ lá sinh trưởng tốt

2.2.3.4 Hoa, quả, hạt

Dứa trung bình có 150 hoa ,với lá bắc dưới hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ Cánh hoa màu xanh mờ với biến sắc màu đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy Trong một năm dứa ra hoa nhiều vụ thường vào tháng 2 – tháng 3 và thu hoạch quả vào

tháng 6 – tháng 7

Cuống quả của dứa có chiều dài so với chiều dài quả tương đối ngắn, trọng lượng quả trung bình cao từ 2 - 4 kg / trái, hình trụ, mắt to và dẹt, màu đỏ da cam, khi chín ở giữa mắt hơi nhô lên Thịt quả khi chín ít nhiều trong, không xơ, màu vàng nhạt Vị ngọt và chua, đường kính lõi trung bình khoảng 2,5 cm.Trên ngọn quả dứa là một chồi ngọn thường to và đơn độc Theo Cl.Py và Tissesau (1960) nhiệt độ thích hợp cho quả chín là 250C nếu quá cao sẽ làm tăng độ chua trong quả và phẩm chất

- Lá chỉ có gai ở ngọn, đặc trưng cho Smooth Cayenne

- Lá hoàn toàn có gai, trường hợp xuất hiện hầu hết ở các loài

- Lá hoàn toàn không gai hay còn gọi với tên lá viền

Tính trạng chỉ có gai ở ngọn và gai là những đôi tính trạng trong đó chỉ có gai ở ngọn là tính trạng trội (S) và có gai là tính trạng lặn (s) Đều này chứng minh rằng Cayenne là dị hợp tử và tất cả các loại có gai là đồng hợp tử với tính (s) Mặt khác, tính trạng lá viền hay không viền là cặp tính trạng độc lập (P) và cân đối hơn với tính trạng (S) (s) Đồng thời Collins đã chứng minh sự tồn tại của những gen khác, tất cả những gen này hình như là những đôi tính trạng đối với gen „có gai‟

Số lượng trung bình của chồi cuống trên một cây cũng là một đặc trưng di truyền nhưng lại ảnh hưởng ngoại cảnh và sự phát triển sinh trưởng của dứa khi phân hoá hoa tự Đây là một đặc trưng quan trọng cần theo dõi bởi nó là vật liệu tốt để trồng sau này và dễ xảy ra nhiều biến dị trong quá trình phát triển

Một số biến dị di truyền thường xảy ra ở dứa ảnh hưởng về phương diện kinh tế như: biến dị kéo dài ở quả, với hình dạng dài ra và đường kính bé; biến dị “quả khô” tất cả bộ phận hoa đều không đậu, trừ các lá bắc, và trở thành biến dị “cổ chai” khi cho các bộ phận hoa ở phần trên hoa tự không đậu; hay là những biến dị biểu hiện bằng những lá sinh sôi nảy nở quanh các mắt hay tại mắt (Claude Py và m.A.tisseau, 1993)

2.2.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nước và thế giới

Brazil (1.442.300 tấn), Trung Quốc (1.284.000 tấn) Những nước chiếm ưu thế về thị trường dứa tươi (khoảng 670.000 tấn) như Costa Rica, Philippine và Cote d‟Ivoire; về dứa đông lạnh là Thái Lan và Philippine (Rohrbach và ctv, 2003) Mỹ là nước nhập khẩu dứa lớn nhất từ năm 1998 - 2000 bình quân 552597 ngàn USD / năm ở các dạng dứa đóng hộp, tươi và cô đặc

Theo thống kê, sản lượng giống dứa Smooth Cayene chiếm 70 % sản lượng thế giới và hầu hết ở dạng đóng hộp (khoảng 95 %) Tuy nhiên giống này sản xuất ở dạng dứa tươi chất lượng chưa tốt nên đã trở thành áp lực cho các nhà đầu tư đòi hỏi phải cải thiện giống Cayenne để cung cấp dạng tươi tốt hơn (Sanewski and Scott, 2000) Hiện nay, một số nước đang cố gắng phát triển giống Cayenne như Đài Loan, Malaysia, Cuba, Brazil và Pháp

2.2.5.2 Trong nước

Theo số liệu điều tra của viện quy hoạch và thống kê nông nghiệp, diện tích dứa Cayenne năm 2002 là 3.641 ha trồng ở 18 tỉnh, thành phố và con số này đã được gia tăng trong những năm gần đây Các tỉnh có diện tích dứa Cayenne nhiều như Ninh Bình (700 ha), Nghệ An (695 ha), Hà Tỉnh (438 ha),(Tuấn và Tiến, 2002) Sản lượng dứa tươi sản xuất cả nước theo tổng cục thống kê Nông-Lâm-Ngư dao dộng từ 263 –

316 ngàn tấn / năm trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm gần 71 % Nguyên liệu cung cấp cho các nhà máy chế biến đang trong tình trạng cung chưa đủ cầu do sự ra đời của nhiều nhà máy chế biến dứa với công suất cao và kỹ thuật hiện đại như Đồng Giao ở Tiền Giang, An Giang hay nhiều nhà máy nhỏ công suất nhỏ ở Hà Tỉnh, Hồ Chí Minh, Cần Thơ

2.3 Nguyên tắc và ứng dụng của một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền nhờ vào chỉ thị (marker)

2.3.1 Phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái

Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà

sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng do tác động của môi trường, có thể được dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000)

Chỉ thị hình thái đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau Trong đó, có nhiều thành công trên thực vật như: ở

dứa, Duval và d‟Eeckenbrugge., (1993) đã phân tích 5 nhóm dứa trồng với 18 tính trạng chất lượng và 27 tính trạng số lượng bao gồm đặc tính thực vật, hoa và trái Kết quả đã cho thấy sự tương đồng giữa các giống Cayenne, Queen và Pernambuco, trong khi Mordilona và Spanish nằm trong nhóm khác

Ngoài ra ở lúa, Kato và cs., (1928, 1930) bằng chỉ thị hình thái đã chia lúa trồng

thành 2 loài phụ Indica và Japonica Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga

(1954) chia thêm một loài phụ thứ 3, Javanica

Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định: ảnh hưởng rất nhiều do tương tác kiểu gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện

ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị izozyme

Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng, nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do đó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác khác nhau

Isozyme có bản chất protein và là chất đa điện ly, nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích điện sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di Các phân tử protein enzyme là do gen quy định Trong quá trình tiến hoá, dưới tác động của môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó

mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích thước, lực tích điện Vì vậy, dùng phương pháp điện di có thể tách được các loại protein khác nhau Trong nghiên cứu đa dạng di truyền sự khác nhau của các protein phản ánh sự khác nhau về đặc điểm di truyền giữa các cá thể Chính vì vậy isozyme được dùng làm marker trong phân tích mức độ đa dạng về di truyền của loài

Phân tích isozyme nhìn chung là phương pháp khả thi, đồng tính trội và tương đối rẻ tiền Khoảng 90 isozyme đã được sử sụng trên thực vật, với những vị trí (loci) isozyme đang được lập bản đồ trong nhiều lĩnh vực (Tanksley và ctv, 1991) Tuy

nhiên số lượng marker isozyme ít do đó không đủ để nghiên cứu toàn vẹn sự đa dạng

di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường

Ứng dụng của marker isozyme đã được sử dụng thành công để nhận diện giống

ở một số loài cây ăn trái như bơ ( Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb, 1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992) Đối với dứa, marker isozyme cũng đã được sử dụng để phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme (Aradhya M.K và ctv, 1994)

2.3.3 Phương pháp dùng chỉ thị (marker) phân tử

Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho đời sau, giống như các nhân tố di truyền Meldel, nhưng lại có thể định lượng được Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt được hai cá thể, hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem như là một marker DNA Marker DNA có nhiều ưu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trường Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn et al., 1993; Dunforal et al., 1995) Chúng có thể được dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al., 1995)

Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004):

- Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS

- Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA based): RFLP, minisatellite

hydridization-Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

RAPD Random amplified polymorphic DNA

AP-PCR Arbitrary primer-PCR

DAF DNA amplification fingerprinting

AFLP Amplified fragment length polymorphism

ALP Amplicon length polymorphism

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

SSCP Single strand conformation polymorphism

RFLP Restriction fragment length polymorphism

STS Sequence-tagged sites

Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lược được thế giới ủng hộ từ năm

1995, là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu Sau khi đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002)

2.3.3.1 Chỉ thị RFLP (RFLP marker)

Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh năm 1980 Nguyên lý này dựa vào các đặc tính sau:

- Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa

là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA (loại enzyme 6 cắt và 4 cắt) Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau

- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên DNA genome

Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện

di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng lai cellulose hoặc nylon Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ Kết quả của quá trình này được phát hiện nhờ những chất phát quang (fluorescens) Khi phân tích đa dạng di truyền, sự đa dạng của cá thể sẽ thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng

Chỉ thị RFLP đã được ứng dụng nhiều trong chọn giống và đa dạng di truyền ở thực vật Chẳng hạn, Takashige Ishii và cs (1995) đã phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á qua sử dụng 12 probe DNA có kích thước từ 0,8 - 3,4 kb liên kết với các vùng của các nhiễm sắc thể từ số 1 - 12 Tương tự, Qifa Zang và cộng

sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng)

và japonica (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống lúa kháng, nhiễm bệnh đạo ôn (Nguyễn Trịnh Toàn và cs, 1997) Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp này đòi hỏi số lượng và chất lượng DNA phải cao, tốn nhiều công sức, thời gian và đắt tiền (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3.2 Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR

Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction) Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn Phương pháp PCR tạo nên ALP ( amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể, các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít Tuy

nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq

polymerase

Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3‟ ở

cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence) Để primer được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau

đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra Đó là một chu kỳ của PCR Do các sản phẩm mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó Chu kỳ gồm ba bước như trên được lập lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ (Khuất Hữu Thành, 2003)

Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau:

- Bước 1:Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 940C - 960C trong vòng 30 giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu)

- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 -

720C thường là 550C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến

720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv, 1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại

Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lập lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 720C trong 5 phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở

40C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004)

Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau:

Tổng số khuếch đại = m x 2nTrong đó n là số chu kỳ, m là số copy của chuổi mã hoá cần nghiên cứu Giả sử chúng ta đạt hiệu quả là 100 %, sau 30 chu kỳ chúng ta sẽ có tổng số sản phẩm khuếch đại là 1,07*109

Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR:

- DNA polymerase: được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Themus aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao Trong hầu hết các protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taq sử dụng là 0,5 U / 25 µl Nếu nồng độ Taq quá cao (> 1,25 U / 25 µl,

những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ

Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR

mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Primer và dNTP

Dung dịch dNTP làm stock phải được trung tính ở pH=7.0 và tồn trữ ở -200C Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM Sự ổn định của dNTP trong suốt các chu kỳ lập lại ước còn khoảng 50 % sau 50 chu kỳ (Innis và ctv, 1990) Hàm lượng dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó

Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các primer tương xứng Do vậy, chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn Nếu có 50 % G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính đặc hiệu

- DNA mục tiêu

Người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật mã biết trước, được gọi với thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR Kết quả thu nhận sẽ tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì lượng này là 5 – 25 ng DNA

 Chỉ thị RAPD (RAPD marker)

Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin

về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương ứng Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn

Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991) Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng

một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên Thường primer này chứa từ 9-12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp Có ngàn hàng loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa

hình RAPD là 0.3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana, là 0.5 / 1primer ở cây đậu

tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000)

Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện

đa hình Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại

Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bước như sau:

- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.)., lập dendrogam Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau:

- Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni et al., 1996; Winter et al., 1995)

- Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể

- In dấu vân tay (DNA fingerprinting)

- Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation)

Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau:

- Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử

- Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất

- Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu

- Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân

Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu

sự đa dạng di truyền

 Marker AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – đa dạng chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc, là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR Ở đây sản phẩm PCR là kết quả của quá trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt bằng enzyme giới hạn (Zabow M Và Vos P.,1993) Nguyên lý của kỹ thuật này như sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai

đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau đó thiết kế các primer theo các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối

ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau Sản phẩm được phân tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu thí nghiệm

Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào (Zabeau, 1993)

do đó được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây trồng như lúa, lạc (Redona et al., 1998; He et al., 1997) Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần nào hạn chế sử dụng

 Marker SSR ( Microsatellite marker)

Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy cảm (Ramakrishna và ctv, 1995) Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại nhiều lần (Simple sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp Do đó SSR có thể khuếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của 2 bên trên một locus Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn lập lại DNA khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh

Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất cao và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm Tuy nhược điểm của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu

di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền Chẳng hạn, Parasnis (1998) phát hiện đoạn lập lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 2003)

2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền trên Thế Giới và Việt Nam

2.4.1 Nghiên cứu trên Thế Giới

Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với nhu cầu thị trường Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại chỉ thị phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn Những thành công được thể hiện qua những nghiên cứu sau:

- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y Kato và ctv,

1992) Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và

3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius) Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A comonus và A ananassoidies với mức tương quan của A comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381) Qua đó cho thấy sự

khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến

- Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001)

đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là

58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai

- Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống

(dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác biệt với các loài hoang dại Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trường, tỉ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma

- Xác định độ tin cậy kiểu gen của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003)

- Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng

marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001)

- Ngoài ra, các nghiên cứu về sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác như cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, dâu tây, khoai tây, cà chua cũng đã có nhiều báo cáo thành công

2.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen , sử dụng kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng Dưới đây là một số nghiên cứu

đã ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng như:

- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Ctv, 2004) Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc

220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc

- Khảo sát tính đa hình trên cây cà chua bằng chỉ thị RAPD (Thái kỳ Tài và ctv, 2004)

- Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD (Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003)

- Phân tích sự đa dạng di truyền của giống đậu nành bằng marker phân tử (Phạm Thị Bé Tư, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2003) Kết quả 50 giống đậu nành đã được phân thành 5 nhóm chính thông qua 17 primer và phân tích dựa trên UPGMA

- Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa (Bùi chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Đức thành và ctv, 1999)

- Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (Đỗ Đức Tuyến, 2000)

- Nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên 17 giống dưa leo dựa vào kỹ thuật RAPD (Phan Lê Diệu Phương, 2003)

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005 tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP Cần Thơ

3.2 Vật liệu

3.2.1 Nguồn gốc mẫu

Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne được sử dụng trong đề tài

STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan

cung cấp

STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan

cung cấp

1 OMK5 Nhật Long Định 26 OMK47 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

2 OMK12 Úc Long Định 27 OMK52 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

3 OMK19 Khóm Tây Ninh VLĐBSCL 28 OMK49 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

4 OMK10 Úc Long Định 29 OMK50 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

5 OMK17 Codevoire (Pháp) Long Định 30 OMK51 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

6 OMK2 Đài Loan-BL Long Định 31 OMK61 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

7 OMK7 MontiqueI (Pháp) Long Định 32 OMK66 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

8 OMK15 Thơm Phụng Long Định 33 OMK67 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

9 OMK29 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 34 OMK64 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

10 OMK18 Khóm Hà Nội VLĐBSCL 35 OMK65 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

11 OMK20 Thơm Tây Ninh VLĐBSCL 36 OMK71 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

12 OMK4 Thơm Thái Lan Long Định 37 OMK72 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

13 OMK11 Đài Loan Long Định 38 OMK73 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

14 OMK1 Đài Loan Long Định 39 OMK74 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

15 OMK8 Thơm Lâm Đồng Long Định 40 OMK75 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

16 OMK9 Thái Lan-MC Long Định 41 OMK56 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

17 OMK3 Thơm Trung An Long Định 42 OMK76 Thơm Cần Thơ VLĐBSCL

18 OMK59 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 43 OMK77 Phụng Hiệp VLĐBSCL

19 OMK16 Thơm Kiên Giang Long Định 44 OMK40 Thơm Bến Tre VLĐBSCL

20 OMK44 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 45 OMK13 Trung Quốc Long Định

21 OMK48 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 46 OMK62 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

22 OMK42 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 47 OMK63 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

23 OMK43 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 48 OMK68 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

24 OMK45 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 49 OMK69 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

25 OMK6 Thom Bến Lức Long Định 50 OMK70 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng Những dòng dứa này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ Danh sách được trình bày ở bảng 3.1

Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử

lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm

- Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl

- Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus)

- Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức)

- Isopropanol (Đức)

- Ethanol 100 % và 70 % (Đức)

- Dung dịch đệm ly trích DNA

Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA Thành phần Nồng độ stock Nồng độ cuối Thể tích

Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA

EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) (Mỹ): tạo phức Mg++, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết

SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % (Đức): phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA

- Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác

10 g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) (Mỹ)

3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose

- Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies)

- Máy chụp hình gel bằng tia UV

- DNA ladder làm thang chuẩn

- DNA loading buffer

Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer

3.2.2.3 Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR

- Máy thermal cycler (Biorad)

- Mẫu DNA ly trích

- Dung dịch stock của dNTPs (5 mM)

- Dung dịch stock của PCR buffer (10X)

- Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có

kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL

- Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

3.3 Phương Pháp

3.3.1 Đánh giá kiểu hình

Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử

lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập lại, cách đo được tiến hành như sau:

- Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá

- Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên

- Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của

lá

- Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây

- Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái

- Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch

- Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức

độ màu khác nhau

Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version 2.1 Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng

hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính

sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được tính toán theo Sneath và Sokal (1973) Dựa trên ma trận tương quan (Correlation matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những

mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, overlapping) (Sneath và Sokal, 1973)

non-3.3.2 Đánh giá kiểu gen

3.3.2.1 Tách chiết DNA

DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002) Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất

lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác

(Henry T Nguyen, 1998) Quy trình gồm những bước sau:

- Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống tube và ghi nhãn cẩn thận Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh

- Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate)

- Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ) Nghiền các mô lá với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng)

- Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30 phút

- Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận

- Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath

- Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô

- Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE Giữ ở nhiệt độ -200C

3.3.2.2 Kiểm tra chất lƣợng DNA

Kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0.8

% trong dung dịch TAE 1X

Nhuộm gel với Ethidium bromide và chụp hình qua hệ thống gel document

 Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA

- Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di

- Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X

- Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn Nếu quá trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu

- Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp (Nguyễn Thị Lang, 1999)

- Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí

 Tiến hành chạy điện di

- Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l) Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di

- Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng)

- Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư

3.3.2.3 Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD

 Trộn dung dịch PCR

Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số:

- DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA)

- Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l

- dNTP 2,0 l

- Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l

- Taq polymerase 0,5 l

- Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l

Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt

- Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 940C trong 5 phút

- Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 940C trong 30 giây

- Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 370C trong 30 giây

- Bước 4: Tổng hợp ở 720C trong 1 phút

- Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần

- Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 720C trong 5 phút

Nhiệt

độ

Thời gian

Nhiệt

độ

Thời gian

2 940C 30 giây 370C 30 giây 720C 1 phút 35-36

 Kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1.5 %

Hút 10 l sản phẩm PCR và tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1.5 % để kiểm tra sản phẩm Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l Phương pháp tiến hành giống như kiểm tra sản phẩm DNA

Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide Ta

sẽ ghi nhận lại những băng DNA và đem xử lý trên chương trình NTSYSpc

3.3.2.4 Phân tích dữ liệu PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh)

Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu

có nhiều biến NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting) Các băng được nhập vào chương trình theo quy tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1 Số liệu này sẽ được sử dụng

để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix) Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979):

Sxy=2 xy / x + y

- Xy: số băng giữa hai mẫu

- X: số băng của mẫu x

- Y: Số băng của mẫu y

- Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y

Từ Sxy ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y

Dxy= 1 - SxyTrên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv,

1995) Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package-NTSYS để tiện dụng hơn

 Cách nhập số liệu

Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định chung Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1

3.3.3 Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu hình và kiểu gen

Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào dữ liệu kiểu hình

Qua quan sát và ghi nhận những đặc tính nông học bao gồm chiều cao cây, chiều rộng tán, chiều rộng lá, chiều dài lá, số lá trên bụi, hình dạng lá, màu sắc lá, thời gian trổ hoa và năng suất trái của tập đoàn dứa Cayenne với 50 dòng khác nhau về đều kiện địa lý đã cho thấy sự đa dạng về kiểu hình giữa các dòng dứa trong cùng một giống với nhau Những số liệu thu nhận được từ những chỉ tiêu hình thái đều khác biệt

có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1 % (phụ lục I) Độ đa hình giữa các nhóm trong giống được đánh giá theo phân tích nhiều biến (Multivariate analysis) và phân tích phân biệt (Discriminant analysis) Kết quả phân tích này được trình bày trong bảng 4.1, trong đó chỉ tiêu ngày trổ hoa và năng suất chỉ tính trên những dòng cho trái và thu hoạch trái vào thời điểm khảo sát

Bảng 4.1: Đặc tính nông học của 50 dòng dứa từ Cayenne Tên dòng Cao cây

(cm)

Rộng tán (cm)

Dài lá (cm)

Rộng lá (cm)

Số lá / bụi Tg trổ hoa (tháng) Năng suất (kg)

OMK12 109 a-g 102,5 a 81,5 g-j 4,8 a-e 61,5 ab 17 3.2 OMK19 102 abc 102,5 a 80,5 e-j 4,75 a-d 62,5 a-d 15 1.1 OMK10 105.5 a-e 104 ab 82,5 hij 5,7 b-h 61 a Chưa trổ 0 OMK17 103.5 a-d 107,5 abc 82 gj 5 a-f 65 a-f Chưa trổ 0 OMK2 116.5 fgh 102,5 a 72,5 a-d 5,45 a-g 61,5 ab Chưa trổ 0 OMK7 118 h 105 ab 74 a-f 5,6 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK15 101 ab 108,5 a-d 71,5 ab 5,2 a-g 63 a-d Chưa trổ 0 OMK29 102 abc 104 ab 72 abc 5,1 a-f 64 a-e Chưa trổ 0 OMK18 100.5 a 107,5 abc 72,5 a-d 4,75 a-d 73,5 ij 16 2,4 OMK20 106 a-e 103 a 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.1 OMK4 105 a-e 105,5 ab 72 abc 5,45 a-g 61 a Chưa trổ 0 OMK11 108 a-f 103 a 82,5 hij 5,65 a-h 61 a 16 1.9 OMK1 101.5 ab 112 a-e 73,5 a-e 4,7 abc 66,5 a-h 16 1.1 OMK8 102.5 abc 102,5 a 72,5 a-d 5,25 a-g 62,5 a-d 16 2.5 OMK9 109 a-g 109 a-d 77,5 a-j 5,75 c-h 66 a-g 16 3 OMK3 103 a-d 119 d-h 73 a-d 5,55 a-g 68,5 c-i 16 1,3 OMK59 110 b-h 110 a-d 81 f-j 5,35 a-g 67,5 a-i 15 2.2 OMK16 103 a-d 112 a-e 72,5 a-d 4,6 ab 61,5 ab 17 1.3 OMK44 112 d-h 113,5 a-g 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.3 OMK48 114 e-h 102,5 a 71,5 ab 5,3 a-g 65,5 a-g 15 2 OMK42 111c-h 122,5 e-h 81 f-j 5,4 a-g 66,5 a-h 15 2.9 OMK43 103 a-d 109 a-d 77 a-j 5,6 a-g 62,5 a-d 16 1.6 OMK45 105 a-e 108 a-d 71,5 ab 4,95 a-f 76,5 j 17 2.6 OMK6 103 a-d 108,5 a-d 74 a-f 5,5 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK47 102.5 abc 105,5 ab 71,5 ab 4,55 a 63,5 a-d Chưa trổ 0 OMK52 104.5 a-d 105 ab 84 j 5,45 a-g 67,5 a-i Chưa trổ 0 OMK49 103.5 a-d 122,5 e-h 83,5 j 6,25 gh 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK50 107.5 a-e 107 ab 76 a-i 5,2 a-g 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK51 111 c-h 107,5 abc 70,5 a 5,55 a-g 65 a-f Chưa trổ 0 OMK61 101.5 ab 103 a 79,5 d-j 5,7 b-h 68 b-i Chưa trổ 0 OMK66 100.5 a 124 gh 74 a-f 5,1 a-f 71 f-j Chưa trổ 0 OMK67 107 a-e 122,5 e-h 77,5 a-j 6 fgh 71,5 f-j 17 2.85 OMK64 102 abc 123 fgh 71,5 ab 6 fgh 64 a-e Chưa trổ 0 OMK65 106 a-e 112,5 a-f 75 a-g 5,25 a-g 71 f-j 17 2.8 OMK71 112 d-h 122 e-h 73 a-d 5,1 a-f 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK72 102.5 abc 118,5 c-h 75,5 a-h 5 a-f 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK73 103.5 a-d 125 h 73 a-d 5,9 e-h 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK74 101 ab 125 h 83 ij 5,75 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK75 105.5 a-e 115 b-h 77,5 a-j 5,65 a-h 65,5 a-g Chưa trổ 2.3 OMK56 106 a-e 122 e-h 79 c-j 5,85 d-h 64 a-e 16 3.2

OMK77 111 c-h 122 e-h 71 a 5,85 d-h 61,5 ab 16 1 OMK40 110 b-h 110,5 a-d 72 abc 5 a-f 69 d-i 15 2.4 OMK13 103 a-d 112,5 a-f 71,5 ab 5,3 a-g 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK62 106.5 a-e 123,5 gh 75,5 a-h 5,8 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK63 112 d-h 102,5 a 82,5 hij 6 fgh 64 a-e 17 3.5 OMK68 117.5 gh 121,5 e-h 78,5 b-j 5,6 a-g 70,5 e-j 17 2.75 OMK69 102.5 abc 124,5 gh 75 a-g 5 a-f 73 hij Chưa trổ 0 OMK70 102 abc 103 a 72,5 a-d 4,75 a-d 72 g-j Chưa trổ 0

Giá trị trung bình theo sau những chữ số trong một cột có cùng mẫu tự khác biệt nhau không có ý nghĩa ở mức 5 %

Từ kết quả bảng 4.1, sự đa dạng của 50 dòng dứa Cayenne về mặt kiểu hình được thể hiện như sau:

- Chiều cao cây giữa các dòng trong giống có sự khác biệt với nhau về thống kê ở mức ý nghĩa 5 % và hệ số biến động 3,6 % Chiều cao trung bình của giống biến động

từ 100 – 118 cm và trung bình là 107,5 cm Trong đó cao nhất là dòng OMK7 có nguồn gốc từ pháp (118 cm) và thấp nhất là những dòng dứa OMK18, OMK66 có nguồn gốc từ Bến Tre và Hà Nội (100 cm) Dựa vào biểu đồ 4.1 cho thấy những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom thì khác biệt không lớn bởi dù trồng ở những hình thức khác nhau nhưng chúng đều cùng một giống

118

101

106.35 105.15 100.5

117.5

90 95 100 105 110 115 120

Nuôi cấy mô

Biểu đồ 4.1: Chiều cao cây của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô

và dạng hom

- Chiều rộng của tán cây cũng dao động từ 102,5 cm – 125 cm và trung bình 111,86 cm Dòng có chiều rộng lớn nhất có nguồn gốc từ Hà Nội và sự khác biệt về chiều rộng tán của dòng này cũng có ý nghĩa so với các dòng dứa khác

- Chiều dài lá trung bình dao động từ 73,5 cm – 84 cm và chiều rộng lá trung bình khoảng 4,55 cm – 6,7 cm với hệ số biến động lần lượt là 4 % và 8,5 % Một số dòng

có cùng nguồn gốc nhưng lại khác biệt có ý nghĩa đối với hai tính trạng này như OMK12 và OMK10; OMK11 và OMK1