NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)

Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH Thành phố Hồ Chí Minh 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: TÔN BẢO LINH CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh 2005 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Trung tâm phân tích môi trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2005 Tôn Bảo Linh iv TÓM TẮT TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  CN. Lưu Phúc Lợi Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV). Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST). Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV. Trên cơ sở tạo chồi sạch virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ. Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy. Những kết quả thu được: 1. Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu cấy quyết định. Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15 ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%. 2. Sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST: sự khác biệt có ý nghĩa của các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu do giống quyết định, giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan sinh trưởng nhanh hơn so với giống Cayenne Lâm Đồng. Nhìn chung, quá trình xử lí nhiệt (37 0 C, 30 ngày) không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh. v 3. Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST. Với phương pháp kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV – 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV – 1. vi SUMMARY TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City. August, 2005. “Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus) Cayenne pineapple plants”. Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants. Three Smooth Cayenne cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing materials. With the completely randomized design, factors that influenced on the regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 37 0 C in 30 days was also studied. The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced by the size of the excised tissue. Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were influenced by cultivar factors. Heat treatment did not considerably influence on the regeneration and subsequent growth of propagated meristem. All samples (3/3) without heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat treatment showed negative infection results with PMWaV-1. Finally, all samples (12/12) had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR. vii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary vi Mục lục vii Danh sách các bảng . xi Danh sách các hình và sơ đồ xii Danh sách các chữ viết tắt xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3.Giới hạn của đề tài 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1.Nguồn gốc của cây dứa . 3 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa 3 2.2.1. Đặc điểm thực vật học 3 2.2.2.Sinh thái cây dứa . 4 2.3.Phân loại 5 2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam . 6 2.4.1.Các nhóm dứa chính . 6 2.4.1.1. Nhóm Cayenne . 6 2.4.1.2. Nhóm Queen . 7 2.4.1.3. Nhóm Spanish 7 2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam . 7 viii 2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ . 7 2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) 8 2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) . 8 2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne 8 2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa . 9 2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới 9 2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam 9 2.5.2.1. Tình hình sản xuất 9 2.5.2.2. Sản lƣợng dứa 10 2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa . 10 2.6.1. Các loại sâu hại dứa . 10 2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ 11 2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ . 11 2.6.2.2. Bệnh thối mềm 11 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” 12 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa 12 2.7.Bệnh héo do virus . 13 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus . 14 2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật . 14 2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus . 15 2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus 15 2.8.3.1. Xử lí nhiệt . 16 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 16 ix 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST . 19 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng . 20 2.8.3.5. Vi ghép 21 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus . 21 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học . 21 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học . 21 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) . 21 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) 22 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử . 22 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học . 22 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử 22 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử . 23 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử . 23 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 23 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) 23 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) . 24 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) . 24 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc . 24 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc . 26 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28 3.1. Nội dung 28 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 x 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng . 28 3.3.1. Vật liệu . 28 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy . 28 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ 28 3.3.1.3. Hóa chất 29 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành . 29 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng 32 3.4.1. Vật liệu . 32 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành 32 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS 35 4.1.1Thời gian tái sinh . 35 4.1.2. Tỷ lệ tái sinh 36 4.1.3. Hệ số nhân chồi 36 4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST 38 4.2.1 Chiều cao chồi . 38 4.2.2. Số lá 39 4.2.3. Số rễ . 40 4.2.4 Chiều dài rễ 41 4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST 43 4.3.1. Kết quả kiểm tra PMWaV-1 . 43 [...]... lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế Một trong những nguyên nhân lây 2 lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus) Giống dứa 3 Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh đỏ đầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Lâm Đồng [1] Chồi dứa. .. giai đoạn đầu và hiện nay không có loại hóa chất nào để diệt trừ virus hiệu quả Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm đáp ứng nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến đồ hộp xuất khẩu, cần phải có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa Với đề tài Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá chúng... trồng dứa phải được luân canh với các cây trồng khác mà tuyến trùng hại dứa không có hoặc ít xuất hiện 2.7 Bệnh héo do virus Theo Sether và cộng sự (1998) [16], bệnh héo do virus (Mealybug wilt of pineapple- MWP) là bệnh gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới Bệnh biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và lá bên trên; các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém... sp Bắt đầu thối từ tâm hoa thị của cây do đất bùn có mang mầm bệnh bắn vào Cây bị bệnh lá từ màu xanh ngả vàng rồi qua đỏ và sau đó đầu lá trở nên nâu xám, gốc lá thối tỏa mùi hôi, dễ bứt lá ra khỏi thân Biện pháp phòng trị Xử lí cây con, thoát nước tránh để líp thơm ẩm thấp, bón vôi nâng pH, vệ sinh đồng ruộng nhổ bỏ cây bệnh, phun thuốc quanh các cây bị bệnh 2.6.2.2 Bệnh thối mềm Nguyên nhân Bệnh do... của virus Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm nhập của virus vào ĐST như nồng độ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng sinh của virus nhưng các giả thuyết trên chưa được chứng minh Morel và Martin (1952; trích dẫn bởi [15]) đã đưa ra sáng kiến cô lập ĐST cây thược dược bị nhiễm virus đưa vào nuôi cấy in vitro và thu được cây sạch bệnh Họ cũng là những người đầu tiên tạo. .. lực là các sản phẩm từ cây dứa [29,31,32] Tuy nhiên, một khi tăng diện tích gieo trồng và sản lượng thì bệnh hại trên dứa cũng bắt đầu phát triển Theo kết quả điều tra của nhóm nghiên cứu bệnh hại trên dứa thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp HCM năm 2003 [3,6,8,9], trên hầu hết các ruộng dứa tại Tp HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm Đồng xuất hiện những bệnh như: bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) , thối trái, thối... gian đầu lá còn ít và nhỏ nên chỗ ẩn núp của kiến và rệp ít hơn Làm cỏ sạch, phủ bạt, khử đất trước khi trồng 2.8 Phƣơng pháp tạo cây sạch virus 2.8.1 Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật [2] Hình thái Virus thực vật có hình thái và kích thước rất đa dạng Virus có thể có dạng hình gậy (virus khảm thuốc lá - TMV, virus khảm sọc lá lúa mạch…), hình cầu (virus khảm dưa chuột, virus. .. Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá chúng tôi hi vọng sẽ góp phần tạo được nguồn dứa Cayenne sạch bệnh 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR 1.3 Giới hạn của đề tài Do giới hạn về thời gian và điều... thu được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus 20 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST (A) phần mô phân sinh đỉnh được cắt (B) ĐST được cấy trên môi trường agar (C) cây con tái sinh từ ĐST (D) cây con được chuyển ra đất đã khử trùng (Nguồn: theo tài liệu internet... được cây sạch bệnh Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng không loại bỏ được viroid Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng là RNA trần và rất khó loại bỏ Thường những cây bị nhiễm phải bị hủy [36] 21 Nhân giống cây mẹ sạch bệnh Cây bị nhiễm virus Xử lí nhiệt Cây mẹ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Kiểm tra virus Kiểm tra virus Chồi hình thành Tăng sinh . NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated. CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC