Luận văn : NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) part 4 potx

17 Ngăn chặn bất kì sự tái nhiễm nào 2.8.3.1. Xử lí nhiệt Xử lí nhiệt là một cách hiệu quả nhằm bất hoạt một số virus (Quak, 1972; và Houten và c.s., 1968; trích dẫn bởi [15]). Đôi khi xử lí nhiệt không hiệu quả do cây quá mẫn cảm với nhiệt độ hay virus không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ với lí do chưa được xác định. Cần xét đến nhiệt độ và thời gian xử lí, đảm bảo cây (chồi, cành) sống sót trong khi virus bị bất hoạt. Phương pháp này đã được áp dụng và mang lại kết quả tốt chống lại virus và mycoplasma hiệu quả ở cây ăn quả, cây mía, sắn dây và cây khoai mì (Morel, 1964; Quak, 1966, 1977; và Kartha và Gamborg, 1975; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp này rất thuận tiện đối với cây ăn quả vì nuôi cấy ĐST khó áp dụng cho đối tượng này. Ở cây thân gỗ, chỉ xử lí nhiệt chồi bên rồi ghép với cây con (cây từ hạt được vô mẫu). Thường thời gian xử lí nhiệt dao động từ 20 – 40 ngày hay vài tháng với nhiệt độ cố định hay thay đổi từ 37 – 38 0 C. Với phương pháp này có thể thu được cây sạch bệnh với một tỉ lệ cao (Fridlund, 1980; trích dẫn bởi [15]). 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Đỉnh sinh trƣởng [5] Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào ĐST, được bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nước. Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn. Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng (Nguồn: tài liệu internet [36]) Ở thực vật, sự hình thành mới cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này được phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi do sự 18 phân hóa của các tế bào sơ khởi. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ tế bào sơ khởi. Vì mô phân sinh có kích thước tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ tế bào sơ khởi qua vài lần phân chia sẽ tách rời khỏi mô phân sinh. Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng được chia thành 3 giai đoạn: i. Giai đoạn thứ nhất thường được gọi là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt. ii. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định. iii. Giai đoạn thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ các thành tế bào, và kết quả là mô không còn khả năng sinh trưởng.Trước hết các u lồi dần dần được tạo thành và được gọi là những u lá. Thể tích và chiều dài của u lá tăng rất nhanh kéo theo phần lớn của ĐST. U lồi chuyển dần thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) và phác thể lá phát triển nhanh về chiều dài. Sau khi lá được tách ra, sự phân chia tế bào sẽ được lặp lại. Kết quả là ĐST được khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu. Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên). Chồi bên thực chất có cấu tạo không khác ĐST thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi bên không phát triển, nhưng khi thoát khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân chính. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng [5,14] White (1943; trích dẫn bởi [5]) cho rằng virus khảm thuốc lá (TMV) có mặt trong các phần khác nhau trên rễ cây thuốc lá, mật độ virus giảm dần khi đến chóp rễ, và ngay ở chóp rễ hoàn toàn không có virus. Limasset và Cornuet (1949; trích dẫn bởi [5]) cho rằng có một khuynh độ về mật độ virus trong chồi ngọn cây thuốc lá và ở mô phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Các nghiên cứu cho rằng ĐST ngọn và chóp rễ không mang virus. Tuy nhiên ở một số loài thực vật virus cũng hiện diện trong ĐST của cây (Pierik, 1987) . Theo Quak (1966; trích dẫn bởi [15]) ở ĐST có sự canh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia của tế bào mô phân sinh (Pierik, 1987). Trong quá trình phân chia của tế bào, quá trình sinh tổng hợp acid nucleic được tăng 19 cường do đó gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus. Lúc này các tế bào phía dưới ĐST chủ yếu gia tăng kích thước do đó virus có thể sản sinh được. Quak (1966) còn cho rằng trong ĐST không có sự hiện diện của bó mạch và cầu liên bào nên gây trở ngại cho sự chuyển động của virus. Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm nhập của virus vào ĐST như nồng độ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng sinh của virus…nhưng các giả thuyết trên chưa được chứng minh. Morel và Martin (1952; trích dẫn bởi [15]) đã đưa ra sáng kiến cô lập ĐST cây thược dược bị nhiễm virus đưa vào nuôi cấy in vitro và thu được cây sạch bệnh. Họ cũng là những người đầu tiên tạo được cây thược dược và khoai tây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy ĐST. Sau đó, phương pháp này được áp dụng với những cây trồng quan trọng như khoai tây, Trifolium, mía … và những cây thân gỗ. Khi nuôi cấy ĐST nên chọn những cây đang tăng trưởng để thu ĐST. Nếu ĐST cô lập đang ở trong trạng thái hoạt động (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nên tách lấy vòm mô phân sinh (meristematic dome) và 1 cặp lá đầu tiên. Nếu lấy đoạn lớn hơn sẽ tạo điều kiện truyền virus. Kích thước của mô phân sinh và lá từ 0,1 – 0,5 mm [36]. Vòm đỉnh (apical dome) có kích thước từ 0,1 – 0,25 mm phụ thuộc vào loài và sự cân bằng về kích thước. ĐST phải đủ nhỏ để đảm bảo sạch virus và các tác nhân gây bệnh khác đồng thời đủ lớn để có thể phát triển thành chồi. Mặc dù rễ có thể hình thành trực tiếp từ chồi trong cùng môi trường, nhưng thường chồi phải được chuyển sang môi trường tạo rễ để phát triển. Tỉ lệ cây sạch virus thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vật liệu khởi đầu như ĐST của chồi ngọn hay chồi bên (Styer và Chin, 1983; trích dẫn bởi [5]), thời gian thu mẫu trong năm (Van Os, 1964; trích dẫn bởi [5]), thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, nhiệt độ xử lí… Tỉ lệ cây sạch bệnh thu được bằng phương pháp nuôi cấy ĐST thường rất nhỏ. Nguyên nhân là do mẫu bị nhiễm, bị hư hại, bị khô nước và bị hóa nâu, môi trường nuôi cấy không phù hợp; có khi ĐST không tăng trưởng do đang ở trong trạng thái hưu miên. Trong trường hợp thu được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không. Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus. 20 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST. (A) phần mô phân sinh đỉnh được cắt. (B) ĐST được cấy trên môi trường agar. (C) cây con tái sinh từ ĐST. (D) cây con được chuyển ra đất đã khử trùng (Nguồn: theo tài liệu internet [39]) 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST Để làm tăng cơ hội thu được cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn (cây bị nhiễm bởi nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ĐST để nuôi cấy nhằm làm giảm số lượng virus hoặc làm tăng diện tích vùng không bị nhiễm virus. Thời gian xử lí nhiệt thay đổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt độ 35 – 38 0 C (Quak, 1977; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp trên đã được sử dụng thành công với khoai tây, cúc, cẩm chướng và dâu tây. Theo Morel (1964; trích dẫn bởi [5]), khi giữ củ khoai tây ở nhiệt độ 37 – 38 0 C trong một tháng trước khi tiến hành nuôi cấy ĐST thì sẽ thu được cây sạch bệnh. Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng không loại bỏ được viroid. Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng là RNA trần và rất khó loại bỏ. Thường những cây bị nhiễm phải bị hủy [36]. 21 Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST. (Nguồn: theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Brierley (1962; trích dẫn bởi [15]) mô tả sự tạo căn hành bất định in vitro từ vảy của Lilium longiflorum. Hildebrant (1971; trích dẫn bởi [15]) cũng có những kết luận tương tự trên cây glaieul. Phôi soma hình thành từ mô phôi tâm Citrus khi tái sinh thường tạo ra những cây sạch bệnh (Button và Bornman, 1971; và Bitters và c.s., 1972; trích dẫn bởi [15]). Việc tạo cây sạch bệnh từ phương pháp tạo chồi bất định đã được tiến hành thành công ở Lili (Allen, 1974; và Asjes và c.s., 1974; trích dẫn bởi [5]) và cây dạ lan hương. Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy Lili bị nhiễm virus được kích thích để tạo thành củ bi bất định in vitro; khi kích thước ĐST của các chồi mọc từ củ tăng đến 1mm thì được chuyển sang môi trường nuôi cấy khác để ĐST tiếp tục phát triển. Phương pháp tạo chồi bất định được thực hiện theo một hướng khác để thu được cây sạch bệnh ở một số loài như: Petunia, thuốc lá, bắp cải. Ở những cây này, trên lá có những vùng đặc biệt không bị nhiễm virus trong khi toàn cây đã bị nhiễm. Những vùng này được cô lập và kích thích để tạo chồi bất định thì sẽ tạo được những cây sạch bệnh (Murakishi và Carlson, 1979; trích dẫn bởi [15]). Nhân giống cây mẹ sạch bệnh Chồi ra rễ Cây mẹ Kiểm tra virus Chuyển cây ra đất Kiểm tra virus Tăng sinh chồi Xử lí nhiệt Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi hình thành Cây bị nhiễm virus 22 2.8.3.5. Vi ghép Nếu như không cảm ứng được sự tăng trưởng của ĐST hoặc thu hút được chồi từ nuôi cấy ĐST thì có thể ghép ĐST vào cây con in vitro để nó có thể tăng trưởng. Phương pháp vi ghép này rất có ý nghĩa đối với những cây thân gỗ không thể tiến hành nuôi cấy ĐST. Phương pháp này lần đầu tiên được thực hiện bởi Morel và Martin trên đối tượng là cây thược dược vào năm 1952. Sau đó, vi ghép được thực hiện thành công bởi Murashige và c.s. (1972; trích dẫn bởi [5]), Navaro và c.s. (1975; trích dẫn bởi [5]) trên cây Citrus và đã loại trừ được hai loại virus. Trong một số trường hợp (mơ ghép với nho) thì trước khi ghép, mẫu phải được xử lí nhiệt . 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus Các kĩ thuật chẩn đoán virus gây hại thực vật được phân thành các quá trình huyết thanh học, các quá trình liên quan nucleic acid và kết hợp cả hai quá trình. Yêu cầu của các phương pháp chẩn đoán virus phải nhanh, nhạy và chính xác. 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học [21] 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học Cơ sở khoa học của phương pháp này chủ yếu dựa vào hoạt động hệ miễn dịch ở động vật: khi có protein lạ (kháng nguyên) xâm nhập vào máu của cơ thể động vật, hệ thống bạch huyết sẽ sinh ra protein đặc hiệu (kháng thể) để chống lại protein lạ trên. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ tạo kết tủa. Đây là phản ứng tự vệ của động vật, làm cho kháng nguyên gây bệnh bất hoạt và cơ thể động vật được bảo vệ. 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Nguyên tắc phương pháp dựa trên khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể nhận biết protein của virus quan tâm (thường là protein vỏ) được tạo ra trong cơ thể động vật. Sử dụng kháng thể phủ lên đĩa kiểm tra sau đó cho mẫu cần kiểm tra vào giếng (nhựa cây hay mẫu bệnh phẩm đã được ly trích). Nếu virus quan tâm có trong mẫu kiểm tra, kháng nguyên của viurs sẽ gắn vào kháng thể cố định. Bất kì thành phần không gắn kết nào sẽ bị loại bỏ khi rửa giếng, trước khi kháng thể thứ hai nhận biết kháng thể thứ nhất được thêm vào. Kháng thể thứ hai cho phép phát hiện virus gián tiếp nhờ phân tử tín hiệu (reporter molecule), thường là do một enzyme tác động lên cơ chất đổi màu. Sự đổi màu cơ chất được đánh giá bằng quang phổ. Với sự hiệu chỉnh hợp lí, ELISA có thể định tính cũng như định lượng. 23 Phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm tra một loại virus trên nhiều cây, mỗi giếng một mẫu cây. Có thể kiểm tra đồng thời nhiều virus trong 1 đĩa đơn với các kháng thể khác nhau phủ ở mỗi giếng với 2 hoặc 3 lần lặp lại. Ưu điểm: độ chính xác cao, đơn giản và giá thành thấp. Hạn chế : đòi hỏi huyết thanh kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu với virus và không phản ứng chéo protein thực vật. Một hình thức khác của ELISA gọi là Thí nghiệm đo điện thế miễn dịch enzyme (Voltametric enzyme immunoassay). Phương pháp nhằm mục đích phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của cơ chất khi enzyme gắn vào kháng thể thứ hai. Phương pháp này nhạy hơn ELISA, được sử dụng để phát hiện virus khảm dưa leo (Cucumber mosaic virus). 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) Giống ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể kháng virus. Nhựa từ mô thực vật được chuyển lên giấy thấm, màng nylon hay nitrocellulose và virus được phát hiện nhờ các probe đã đánh dấu thường là các chất phát quang. Quá trình này ít thao tác hơn so với ELISA, nhanh hơn, nhạy hơn, đơn giản (không đòi hỏi tách chiết virus) và rẻ tiền hơn (cần rất ít thiết bị), thích hợp khi cần kiểm tra 1000 – 2000 mẫu mỗi ngày. Bên cạnh các kĩ thuật hiện đại, các phương pháp quan sát phản ứng huyết thanh như: quan sát kết tủa của phản ứng dưới kính hiển vi có tụ quang đen, phản ứng khuếch tán gel…[2] cũng được sử dụng để chẩn đoán virus. 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học [2] Trong quá trình kí sinh, virus thực vật thường có khả năng tạo dạng kết tinh vô định hình hoặc dạng đặc trưng do vô số cá thể virus kết hợp lại với nhau. Virus khảm thuốc lá thường tạo dạng kết tinh trong suốt ở mô tế bào cây bệnh. Tinh thể virus có thể nhuộm màu và quan sát được trên kính hiển vi quang học thông thường ở độ phóng đại 80 lần. 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử Nhờ kính hiển vi điện tử, sợi virus hay hạt virus có thể được quan sát chính xác hình thái và cấu tạo. Hình thái virus có thể được mô tả một cách chính xác ở độ phóng 24 đại hàng vạn lần. Ngày nay, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu tạo của virus thực vật. 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử Các kĩ thuật sinh học phân tử dựa trên vật chất di truyền của virus (RNA/DNA) và quá trình tái tổ hợp của chúng. Khi xâm nhập vào tế bào kí chủ, RNA virus được phóng thích khỏi lớp vỏ protein. Các enzyme cảm ứng tổng hợp RNA (RNA replicase, RNA synthetase) cùng với RNA virus (sợi +) đóng vai trò là sợi khuôn mẫu giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi - và sợi +). Với các loại virus có RNA (sợi -) thì chúng buộc phải chuyển sang dạng mRNA (sợi +). Khi xâm nhiễm vào tế bào kí chủ, virus đã đưa RNA (sợi -) và enzyme vào tế bào. Các virus có RNA sợi kép thì quá trình hình thành RNA (sợi – và sợi +) được thực hiện nhờ RNA polymerase. Với các virus chứa DNA thì sự tổng hợp vật chất di truyền được sự trợ giúp của enzyme từ tế bào kí chủ. 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) PCR và RT-PCR là các kĩ thuật phổ biến để phát hiện và xác định RNA và DNA của virus thực vật. Phương pháp này cực kì nhạy, không quá đắt tiền và đòi hỏi ít kĩ năng thực hiện. Trong trường hợp RNA virus, một sợi cDNA bổ sung với RNA virus được tổng hợp với xúc tác reverse transcriptase (RT). Các primer được kéo dài bởi DNA polymerase bền nhiệt trong một chuỗi các bước biến tính và kéo dài, làm tăng DNA mục tiêu theo cấp số nhân. Hiện nay có 3 loại primer cơ bản được sử dụng để khuếch đại RNA virus (xem Phụ lục 3)[12]. Đối với DNA virus thì bước RT không cần thiết. Có nhiều dạng khác nhau phát triển trên kĩ thuật cơ bản nhằm tăng độ nhạy, thay đổi tính đặc hiệu hay cho phép tự động phát hiện. Các dạng thường gặp: Multiplex RT-PCR, Fluorescence RT-PCR using Taqman TM technology, Competitive flourescence PCR (CF-PCR), Immunocapture PCR (IC-PCR), Nested PCR. 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) RFLP được sử dụng kết hợp với PCR để xác định sự khác nhau giữa các virus dựa trên sự hiện diện của các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Sau khi khuếch 25 đại PCR, các mẫu được phân cắt bởi enzym cắt giới hạn và các kích thước của đoạn phân cắt được phân tích bằng điện di. RFLP là một phương pháp phân biệt các dòng virus không cần thực hiện cloning và sequencing. Hiệu của quả phương pháp này phụ thuộc vào sự đa hình trong phạm vi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) Việc lai probe DNA hay RNA giúp cho việc phát hiện nucleic acid virus ở cả hai dạng, sợi đơn và sợi đôi. cDNA probe có thể được gắn nhãn với các isotope hay probe không có chất phóng xạ. cDNA probe thường được sử dụng để phát hiện RNA virus vì dạng lai giữa RNA/RNA bền vững hơn dạng lai DNA/RNA. Dịch ly trích RNA từ mô nhiễm được chuyển lên màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus. 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc Bệnh wilt lần đầu tiên được mô tả bởi các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm Hiệp hội những người trồng mía Hawaii (HSPA) năm 1910. Năm 1900 bệnh này gây thiệt hại nặng nề cho công nghiệp trồng dứa ở Hawaii; cho đến nay bệnh xuất hiện ở hầu hết các khu vực trồng dứa trên thế giới [11,13]. Sự liên hệ giữa bệnh wilt-rệp-kiến Những nghiên cứu bước đầu về bệnh wilt trên cây dứa bắt đầu từ mối liên hệ giữa bệnh wilt-rệp sáp-kiến được thực hiện bởi Kenneth G. Rohrbach và cộng sự (1988). Ở cây bệnh wilt luôn có sự hiện diện của rệp sáp và kiến. Không có kiến quần thể rệp sáp không thể gia tăng số lượng (Rohrbach và c.s., 1988). Sự có mặt của kiến cho phép 2 loài rệp sáp Dysmicoccus brevipes (Cockerell) và D. neobrevipes Beardsley phát triển. Kiến bảo vệ rệp sáp tránh các loài kí sinh và các loài tấn công rệp đồng thời kiến tiêu thụ chất “mật” do rệp tiết ra giúp cho quá trình xâm nhập của rệp diễn ra thuận lợi. Nguyên nhân gây bệnh Năm 1989, các tiểu phần tương tự closterovirus được tinh sạch từ mô dứa Hawaii bệnh và phân loại. Đến năm 1997, các virion tương tự closterovirus (PCV) liên quan về mặt huyết thanh với quần thể PCV Hawaii được tinh sạch từ cây dứa bệnh ở Australia. Kháng thể đơn dòng (Mab) đặc hiệu closterovirus dứa được sử dụng trong thử nghiệm miễn dịch mô (TBIA) để phát hiện PCV ở dứa. 26 Hu và c.s. (1997) đã thực hiện nghiên cứu kiểm tra sự hiện diện của PCV trên hơn 20.000 mẫu dứa bằng phương pháp TBIA. PCV được phát hiện trên những cây dứa không thể hiện triệu chứng bệnh. Phân tích các kiểu bệnh PMW ở Sri Lanka được G. Hughes và S. Samita (1997) [10] thực hiện tìm ra sự tương quan giữa triệu chứng và các yếu tố lây nhiễm. Các kết quả này góp phần quan trọng cho lời giải đáp nguyên nhân gây bệnh héo lá liên quan đến rệp sáp. Nguyên nhân gây bệnh là virus PMWaV, được xếp vào họ Closteroviridae dựa vào đặc tính lây truyền. Yếu tố lây truyền virus Sether và c.s. (1998) thực hiện thí nghiệm về sự lây truyền virus của 2 loài rệp sáp Dysmicoccus spp. thông qua tỉ lệ giữa cây nhiễm virus (-) và cây không nhiễm virus (+) trước và sau khi tiếp xúc với rệp trong trường hợp có kiến và không có kiến. Tình trạng PMWaV của cây thí nghiệm được xác định bằng phương pháp TBIA và ISEM (immunosorbent electron microscopy). Thí nghiệm sự lan truyền virus của D. brevipes khi không có kiến Nghiệm thức 1(NT1): cây (-) trồng xen kẽ cây (+), không chủng rệp. NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus. NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) được chủng rệp mang virus. Kết quả ở nghiệm thức 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không thay đổi trong khi ở nghiệm thức 3 có sự gia tăng số cây nhiễm virus. Thí nghiệm sự lan truyền virus bởi D. brevipes khi có kiến NT 1: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) và không chủng rệp NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) , chủng rệp không mang virus Kết quả cho thấy ở NT 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không đổi; ở NT 3 tỉ lệ cây nhiễm virus cao hơn và thời gian lây nhiễm ngắn hơn so với trường hợp không có kiến. Nghiên cứu trên cho thấy rõ vai trò chính của rệp trong việc lây lan virus và yếu tố thúc đẩy sự lây lan là kiến. Ở thí nghiệm với D. neobrevipes cũng cho kết quả tương tự. . màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus. 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc Bệnh wilt lần đầu tiên được mô tả bởi các nhà khoa học. wilt- rệp-kiến Những nghiên cứu bước đầu về bệnh wilt trên cây dứa bắt đầu từ mối liên hệ giữa bệnh wilt- rệp sáp-kiến được thực hiện bởi Kenneth G. Rohrbach và cộng sự (1988). Ở cây bệnh wilt luôn có. được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không. Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus.