Luận văn : Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử part 4 pdf

31 Bảng 4.1: Đặc tính nông học của 50 dòng dứa từ Cayenne Tên dòng Cao cây (cm) Rộng tán (cm) Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Số lá / bụi Tg trổ hoa (tháng) Năng suất (kg) OMK5 101ab 104 ab 71 a 4,6 ab 62 abc 16 1,2 OMK12 109 a-g 102,5 a 81,5 g-j 4,8 a-e 61,5 ab 17 3.2 OMK19 102 abc 102,5 a 80,5 e-j 4,75 a-d 62,5 a-d 15 1.1 OMK10 105.5 a-e 104 ab 82,5 hij 5,7 b-h 61 a Chưa trổ 0 OMK17 103.5 a-d 107,5 abc 82 gj 5 a-f 65 a-f Chưa trổ 0 OMK2 116.5 fgh 102,5 a 72,5 a-d 5,45 a-g 61,5 ab Chưa trổ 0 OMK7 118 h 105 ab 74 a-f 5,6 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK15 101 ab 108,5 a-d 71,5 ab 5,2 a-g 63 a-d Chưa trổ 0 OMK29 102 abc 104 ab 72 abc 5,1 a-f 64 a-e Chưa trổ 0 OMK18 100.5 a 107,5 abc 72,5 a-d 4,75 a-d 73,5 ij 16 2,4 OMK20 106 a-e 103 a 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.1 OMK4 105 a-e 105,5 ab 72 abc 5,45 a-g 61 a Chưa trổ 0 OMK11 108 a-f 103 a 82,5 hij 5,65 a-h 61 a 16 1.9 OMK1 101.5 ab 112 a-e 73,5 a-e 4,7 abc 66,5 a-h 16 1.1 OMK8 102.5 abc 102,5 a 72,5 a-d 5,25 a-g 62,5 a-d 16 2.5 OMK9 109 a-g 109 a-d 77,5 a-j 5,75 c-h 66 a-g 16 3 OMK3 103 a-d 119 d-h 73 a-d 5,55 a-g 68,5 c-i 16 1,3 OMK59 110 b-h 110 a-d 81 f-j 5,35 a-g 67,5 a-i 15 2.2 OMK16 103 a-d 112 a-e 72,5 a-d 4,6 ab 61,5 ab 17 1.3 OMK44 112 d-h 113,5 a-g 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.3 OMK48 114 e-h 102,5 a 71,5 ab 5,3 a-g 65,5 a-g 15 2 OMK42 111c-h 122,5 e-h 81 f-j 5,4 a-g 66,5 a-h 15 2.9 OMK43 103 a-d 109 a-d 77 a-j 5,6 a-g 62,5 a-d 16 1.6 OMK45 105 a-e 108 a-d 71,5 ab 4,95 a-f 76,5 j 17 2.6 OMK6 103 a-d 108,5 a-d 74 a-f 5,5 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK47 102.5 abc 105,5 ab 71,5 ab 4,55 a 63,5 a-d Chưa trổ 0 OMK52 104.5 a-d 105 ab 84 j 5,45 a-g 67,5 a-i Chưa trổ 0 OMK49 103.5 a-d 122,5 e-h 83,5 j 6,25 gh 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK50 107.5 a-e 107 ab 76 a-i 5,2 a-g 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK51 111 c-h 107,5 abc 70,5 a 5,55 a-g 65 a-f Chưa trổ 0 OMK61 101.5 ab 103 a 79,5 d-j 5,7 b-h 68 b-i Chưa trổ 0 OMK66 100.5 a 124 gh 74 a-f 5,1 a-f 71 f-j Chưa trổ 0 OMK67 107 a-e 122,5 e-h 77,5 a-j 6 fgh 71,5 f-j 17 2.85 OMK64 102 abc 123 fgh 71,5 ab 6 fgh 64 a-e Chưa trổ 0 OMK65 106 a-e 112,5 a-f 75 a-g 5,25 a-g 71 f-j 17 2.8 OMK71 112 d-h 122 e-h 73 a-d 5,1 a-f 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK72 102.5 abc 118,5 c-h 75,5 a-h 5 a-f 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK73 103.5 a-d 125 h 73 a-d 5,9 e-h 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK74 101 ab 125 h 83 ij 5,75 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK75 105.5 a-e 115 b-h 77,5 a-j 5,65 a-h 65,5 a-g Chưa trổ 2.3 OMK56 106 a-e 122 e-h 79 c-j 5,85 d-h 64 a-e 16 3.2 OMK76 102 abc 125 h 81 f-j 6,7 h 61,5 ab 16 2.9 OMK77 111 c-h 122 e-h 71 a 5,85 d-h 61,5 ab 16 1 OMK40 110 b-h 110,5 a-d 72 abc 5 a-f 69 d-i 15 2.4 OMK13 103 a-d 112,5 a-f 71,5 ab 5,3 a-g 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK62 106.5 a-e 123,5 gh 75,5 a-h 5,8 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK63 112 d-h 102,5 a 82,5 hij 6 fgh 64 a-e 17 3.5 OMK68 117.5 gh 121,5 e-h 78,5 b-j 5,6 a-g 70,5 e-j 17 2.75 OMK69 102.5 abc 124,5 gh 75 a-g 5 a-f 73 hij Chưa trổ 0 OMK70 102 abc 103 a 72,5 a-d 4,75 a-d 72 g-j Chưa trổ 0 Mean 105,7 111,86 75,9 5,38 65,76 2,2 Cv(%) 3,6 4,2 4 8,5 4,3 32 Giá trị trung bình theo sau những chữ số trong một cột có cùng mẫu tự khác biệt nhau không có ý nghĩa ở mức 5 % Từ kết quả bảng 4.1, sự đa dạng của 50 dòng dứa Cayenne về mặt kiểu hình được thể hiện như sau: - Chiều cao cây giữa các dòng trong giống có sự khác biệt với nhau về thống kê ở mức ý nghĩa 5 % và hệ số biến động 3,6 %. Chiều cao trung bình của giống biến động từ 100 – 118 cm và trung bình là 107,5 cm. Trong đó cao nhất là dòng OMK7 có nguồn gốc từ pháp (118 cm) và thấp nhất là những dòng dứa OMK18, OMK66 có nguồn gốc từ Bến Tre và Hà Nội (100 cm). Dựa vào biểu đồ 4.1 cho thấy những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom thì khác biệt không lớn bởi dù trồng ở những hình thức khác nhau nhưng chúng đều cùng một giống. 118 101 106.35 105.15 100.5 117.5 90 95 100 105 110 115 120 Min Max Trung bình Cao cây Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.1: Chiều cao cây của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Chiều rộng của tán cây cũng dao động từ 102,5 cm – 125 cm và trung bình 111,86 cm. Dòng có chiều rộng lớn nhất có nguồn gốc từ Hà Nội và sự khác biệt về chiều rộng tán của dòng này cũng có ý nghĩa so với các dòng dứa khác. - Chiều dài lá trung bình dao động từ 73,5 cm – 84 cm và chiều rộng lá trung bình khoảng 4,55 cm – 6,7 cm với hệ số biến động lần lượt là 4 % và 8,5 %. Một số dòng có cùng nguồn gốc nhưng lại khác biệt có ý nghĩa đối với hai tính trạng này như OMK12 và OMK10; OMK11 và OMK1. 33 - Số lá trên bụi giữa các dòng trong giống Cayenne cũng có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với số lá trung bình giữa các dòng dao động trong khoảng 61 – 76,5 lá và hệ số biến động 4,3 %. Kết quả từ biểu đồ 4.3 cũng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về số lá giữa dòng trồng từ nuôi cấy mô và những dòng trồng từ dạng hom. Đều này cho thấy sự đa dạng trong giống Cayenne với tính trạng này. 61 76.5 61.22 73.5 69 64 0 20 40 60 80 100 Min Max Trung bình Số lá / bụi Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.2: Số lá / bụi của các dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Trong 50 dòng dứa khảo sát thì có 25 dòng cho thu hoạch trái chiếm 50%, thời gian trổ vào khoảng tháng 2 – tháng 4 và bắt đầu thu hoạch từ tháng 6 – tháng 7. Những dòng OMK63, OMK65, OMK67, OMK68 có nguồn gốc từ Hà Nội cho hoa muộn hơn so với các dòng khác (tháng 4). Thời gian ra hoa không đồng đều giữa các giống do không có xử lý ra hoa đồng loạt để ra hoa tự nhiên nhằm xét mức độ thích nghi đối với từng dòng trong giống. - Năng suất trái giữa các dòng trong giống cũng khác nhau, dòng OMK63 có khối lượng trái trung bình lớn nhất (3,5 kg) và nhỏ nhất 1 kg ở dòng OMK77, đối với các dòng nuôi cấy mô thì khối lượng trái trung bình lớn hơn so với các dòng trồng từ dạng hom (biểu đồ 4.3) nhưng độ ngọt của trái thì thấp hơn. Hình dạng trái và kích thước trái của giống Cayenne cũng có sự đa dạng giữa các dòng (hình 4.3). 34 3.2 2.84 1 2.09 2.85 2.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Min Max Trung bình Năng suất trái Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.3: Năng suất trái của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom. Hình 4.1: A: hình cây Thơm Trung An, B: hình cây Thơm Hà Nội Hình 4.2: Hình dạng và màu sắc lá với A: xanh đậm không gai, B: xanh đốm nâu không có gai, C: xanh đốm đỏ tía có gai, D: xanh có gai E: xanh đốm nâu gai viền. 35 Hình 4.3: A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội Hình dạng và màu sắc lá của giống Cayenne cũng phân ly thành nhiều dạng khác nhau: - Màu sắc lá của giống đa dạng với 3 màu: xanh, xanh có đốm nâu và xanh có đốm đỏ tía (hình 4.1 và 4.2) đều này cho thấy có sự phân ly đối với tính trạng này giữa các dòng trong giống. Sự khác biệt này còn thể hiện ở những dòng dứa có cùng nguồn gốc như dòng OMK44 có màu xanh, OMK48 có màu xanh đốm nâu (Phụ lục II). - Hình dạng lá của giống Cayenne thường không có gai hoặc rất ít ở ngọn nhưng qua khảo sát cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng trong giống (biểu đồ 4.4) với số dòng có hình dạng lá không có gai chiếm 60 %, có gai chiếm 20 % và lá viền (có gai nhưng chỉ ở một khoảng của lá như giữa, ngọn hoặc gốc lá) chiếm 20 %. Kết quả này đã chứng tỏ trong cùng một giống nhưng có sự phân ly về tính trạng được thể hiện qua kiểu hình. Đều này cho thấy có sự đa dạng nguồn gen giữa các dòng dứa từ Cayenne và sẽ là yếu tố góp phần phân loại làm cơ sở cho lai tạo giống. Đồng thời, tính trạng này khá ổn định, do vậy cần xét sự khác biệt về kiểu gen giữa các dòng dứa để tìm mối quan hệ liên kết giữa gen và tính trạng. A 36 Hình dạng lá 60% 20% 20% không có gai Có gai Viền Biểu đồ 4.4: Sự đa dạng về hình dạng lá của 50 dòng Cayenne Dựa trên sự khác biệt có ý nghĩa về đặc tính nông học chiều cao cây, số lá trên bụi, chiều rộng tán, dài lá và rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne, phân nhóm di truyền bằng phương pháp SAHN ( Sneath và Sokal, 1973) được thiết lập nhằm sắp xếp các dòng dứa thành những nhóm có mức độ tương quan gần nhau về mặt di truyền trên cơ sở biểu hiện kiểu hình. 37 PHAN NHOM KIEU HINH DUA CORR Coefficient -0.23 0.01 0.26 0.50 0.75 1.00 OMK12 OMK5 OMK47 OMK71 OMK40 OMK68 OMK16 OMK42 OMK29 OMK18 OMK70 OMK45 OMK65 OMK1 OMK66 OMK69 OMK72 OMK15 OMK64 OMK13 OMK62 OMK3 OMK73 OMK67 OMK43 OMK49 OMK75 OMK76 OMK56 OMK74 OMK6 OMK12 OMK59 OMK19 OMK17 OMK52 OMK50 OMK10 OMK11 OMK20 OMK63 OMK9 OMK8 OMK61 OMK2 OMK7 OMK48 OMK51 OMK44 OMK4 OMK77 Hình 4.4: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu hình. Bảng 4.2: Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa cayenne dựa trên đặc tính kiểu hình Nhóm Tên dòng Số dòng I OMK5, OMK47, OMK71, OMK40, OMK68, OMK16, OMK42, OMK29, OMK18, OMK70, OMK45, OMK65, OMK1, OMK66, OMK69, OMK72. 16 II OMK15, OMK64, OMK13, OMK62, OMK3, OMK73, OMK67, OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK56, OMK74, OMK6 8 III OMK12, OMK59, OMK19, OMK17, OMK52, OMK50, OMK10, OMK11, OMK20, OMK63, OMK9, OMK8, OMK61 13 IV OMK2, OMK7, OMK48, OMK51, OMK44, OMK4, OMK77 7 38 Kết quả ở hình 4.4 và bảng 4.2 cho thấy 50 dòng dứa Cayenne được phân thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26 % về kiểu hình như sau: - Nhóm I và nhóm II có ít có sự tương quan, nhóm III và nhóm IV tương quan chỉ 2%. - Những dòng trong cùng một nhóm thì có sự tương quan chặt với nhau cho thấy chúng có thể xuất phát từ những quần thể có quan hệ với nhau về mặt di truyền như dòng dứa OMK1, OMK66, OMK69, OMK72 trong nhóm I hay các dòng OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK74 trong nhóm II. Qua kết quả nghiên cứu trên từng tính trạng và phân nhóm dựa vào đặc tính hình thái của 50 dòng dứa Cayennne cho thấy giữa các nhóm dòng có sự khác biệt về kiểu hình và chứng tỏ có sự đa dạng nguồn gen trong cùng một giống. Tuy nhiên, sự phân nhóm dựa vào kiểu hình ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố môi trường. Sự khác biệt và đa dạng của những tính trạng sinh trưởng như chiều cao cây, chiều dài lá, số lá trên bụi giữa các dòng dứa có thể không quy định bởi kiểu gen mà tùy theo đều kiện môi trường, đất đai, bóng rợp để cây phát triển. Do đó sự đa dạng nguồn gen của giống Cayenne cần phải được tiến hành dựa vào kiểu gen để xác định mức độ chính xác của việc phân nhóm. 4.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 4.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA Để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nồng độ DNA được pha loãng từ 20 – 50 ng / µl cho phù hợp với lượng DNA cần thiết để thực hiện phản ứng PCR. Theo Antoni Raflski và một số tác giả khác thì nồng độ DNA thích hợp để chạy phản ứng PCR-RAPD từ 5 – 50 ng / 1 phản ứng (Antoni Rafalski và ctv, 1994). Các mẫu DNA của 50 dòng dứa sẽ được kiểm tra chất lượng trên môi trường agarose gel 0,8 % trong TAE 1X. Nếu DNA hiện diện trên gel không rõ và bị đứt đoạn thì cần phải tiến hành ly trích lại. DNA tốt khi xuất hiện những vạch sáng và mỏng. Kết quả kiểm tra được thể hiện trong hình 4.5. 39 Hình 4.5: Chất lƣợng DNA của các dòng dứa Cayenne trên gel agarose 0.8 %. 4.2.2. Sản phẩm phản ứng PCR với marker RAPD Để phát hiện sự đa hình, 13 primer đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 dòng dứa Cayenne. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những primer này được quan sát trên gel agarose 1.5%. Kết quả quan sát cho thấy chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại, với 38 allen đa hình được tạo ra trung bình 4,28 allen / 1 primer, sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 0,3 – 3 kb (bảng 4.3). Dựa vào sự khác biệt giữa các allen thể hiện qua các băng trên gel ta có thể xác định được sự khác nhau giữa các dòng dứa về mặt di truyền. Bảng 4.3: Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của dứa Cayenne STT Ký hiệu Trình tự 5 ’ 3 ’ Số băng phát hiện Kích thƣớc (kb) Ghi chú 1 OPD 02 GGACCCAACC 4 0,3 – 1,3 Primer từ bộ kit 2 OPA10 GTGATCGCAG 4 0,2 – 1,5 Primer từ bộ kit 3 RAPD3 GTAGACCCGT 4 0,2 – 3 Primer viện thiết kế 4 OPC15 GACGGATCAG 4 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 5 RAPD2 GTTTCGCTCC 5 0,7 – 1,6 Primer viện thiết kế 6 RAPD4 AAGAGCCCGT 6 0,75 – 1,5 Primer viện thiết kế 7 RAPD6 CCCGTCAGCA 3 1,1 – 2,5 Primer viện thiết kế 8 AJ01 ACGGGTCAGA 3 0,4 – 1,018 Primer từ bộ kit 9 OPA04 AATCGGGCTG 5 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 40 - Primer RAPD3: Sản phẩm khuếch đại được tạo ra với primer này là 4 và cả 4 sản phẩm đều đa hình, có kích thước từ 0,2 – 3 kb (hình 4.6a). Trong đó có duy nhất 3 băng có kích thước 3 kb ở các dòng Cayenne như OMK20 (11), OMK11 (13), OMK16 (19). Đều này có thể cho thấy sự khác biệt về di truyền của các dòng dứa này so với những dòng khác. Đối với primer này thì có 50 % số dòng dứa tạo sản phẩm khuếch đại, trong đó phần lớn các dòng dứa Hà Nội đều không tạo sản phẩm. - Với primer RAPD4 số lượng băng tạo ra là 6, có kích thước từ 0,75 – 1,5 kb, và đều là băng đa hình, có một vị trí băng duy nhất ở mẫu số 20: OMK44 có kích thước 1,05 kb (hình 4.6b). Primer RAPD4 cũng ít có sản phẩm với dòng dứa Hà Nội và có 48 % số dòng dứa cho sản phẩm với các băng đa hình thể hiện rỏ trên gel. Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD3 và RAPD4 trên gel agarose 1,5 % Chú thích : số 1 - 25 tương ứng với danh sách giống ở bảng 3.1, a: sản phẩm với primer RAPD3, b: sản phẩm với primer RAPD4. - Với primer OPC15 có 4 sản phẩm khuếch đại được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb, số băng đa hình là 4 và có một băng duy nhất xuất hiện ở mẫu 19: OMK16 do đó có thể phân biệt được dòng này với các dòng dứa khác (hình 4.7). Số dòng cho sản phẩm khuếch đại là 25 chiếm 50 % tổng số và sản phẩm dễ nhận biết trên gel. Những dòng OMK61 – OMK75 không có sản phẩm với primer này. . đó sự đa dạng nguồn gen của giống Cayenne cần phải được tiến hành dựa vào kiểu gen để xác định mức độ chính xác của việc phân nhóm. 4. 2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 4. 2.1 OMK7, OMK48, OMK51, OMK 44, OMK4, OMK77 7 38 Kết quả ở hình 4. 4 và bảng 4. 2 cho thấy 50 dòng dứa Cayenne được phân thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26 % về kiểu hình như sau: - Nhóm. Hình 4. 3: A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội Hình dạng và màu sắc lá của giống Cayenne cũng phân ly thành nhiều dạng khác nhau: - Màu sắc lá của giống đa dạng với 3 màu: xanh, xanh có