21 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005 tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Nguồn gốc mẫu Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan cung cấp STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan cung cấp 1 OMK5 Nhật Long Định 26 OMK47 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 2 OMK12 Úc Long Định 27 OMK52 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 3 OMK19 Khóm Tây Ninh VLĐBSCL 28 OMK49 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 4 OMK10 Úc Long Định 29 OMK50 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 5 OMK17 Codevoire (Pháp) Long Định 30 OMK51 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 6 OMK2 Đài Loan-BL Long Định 31 OMK61 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 7 OMK7 MontiqueI (Pháp) Long Định 32 OMK66 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 8 OMK15 Thơm Phụng Long Định 33 OMK67 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 9 OMK29 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 34 OMK64 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 10 OMK18 Khóm Hà Nội VLĐBSCL 35 OMK65 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 11 OMK20 Thơm Tây Ninh VLĐBSCL 36 OMK71 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 12 OMK4 Thơm Thái Lan Long Định 37 OMK72 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 13 OMK11 Đài Loan Long Định 38 OMK73 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 14 OMK1 Đài Loan Long Định 39 OMK74 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 15 OMK8 Thơm Lâm Đồng Long Định 40 OMK75 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 16 OMK9 Thái Lan-MC Long Định 41 OMK56 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 17 OMK3 Thơm Trung An Long Định 42 OMK76 Thơm Cần Thơ VLĐBSCL 18 OMK59 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 43 OMK77 Phụng Hiệp VLĐBSCL 19 OMK16 Thơm Kiên Giang Long Định 44 OMK40 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 20 OMK44 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 45 OMK13 Trung Quốc Long Định 21 OMK48 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 46 OMK62 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 22 OMK42 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 47 OMK63 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 23 OMK43 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 48 OMK68 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 24 OMK45 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 49 OMK69 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 25 OMK6 Thom Bến Lức Long Định 50 OMK70 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 22 Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Danh sách được trình bày ở bảng 3.1. Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm. 3.2.2. Dụng cụ và hóa chất - Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng - Tủ lạnh 4 0 C và - 20 0 C - Tủ sấy 37 0 C - Cân, máy đo pH 3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA - Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl - Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus) - Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức) - Isopropanol (Đức) - Ethanol 100 % và 70 % (Đức) - Dung dịch đệm ly trích DNA Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA Thành phần Nồng độ stock Nồng độ cuối Thể tích Tris (pH8.0) 1 M 100 mM 5 ml EDTA 0,5 M 20 mM 2 ml NaCl 5 M 500 mM 5 ml Nuớc cất 38 ml Tổng cộng 50 ml Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) (Mỹ): tạo phức Mg ++ , gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết 23 SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % (Đức): phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA - Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác. 10 g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) (Mỹ) 100 ml NaCl 0,5 M - Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8.0 (Mỹ) Bảng 3.3: Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml EDTA 0,5 M 0,5 mM O,1ml Nước cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml 3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose - Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies) - Máy chụp hình gel bằng tia UV - Agarose (Mỹ) - Dung dịch TAE 50X Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X Thành phần Thể tích 1 lít Tris base 2M 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml - Ethidium bromide - DNA ladder làm thang chuẩn - DNA loading buffer 24 Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer Thành phần Thể tích Tris 1 M (pH=8.0) 0,5 M Glycerol 5,0 ml EDTA 0,5 M (pH=8.0) 100 l Xylen Cyanol 0,2 % 15 mg Bromophenol blue 0,2 % 15 mg Nước cất 4,5 ml Tổng cộng 50 ml 3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR - Máy thermal cycler (Biorad) - Mẫu DNA ly trích - Dung dịch stock của dNTPs (5 mM). - Dung dịch stock của PCR buffer (10X). Bảng 3.6: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X Thành phần Nồng độ Nồng độ cuối Thể tích Tris (pH 8.3) 1 M 200 mM 1,0 ml KCl 1 M 500 mM 2,5 ml MgCl 2 150 mM 15 mM 0,5 ml Gelatin 0,01 % 0,5 ml Nước cất 1,0 ml Tổng cộng 5,0 ml - Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL. - Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long . 25 3.3. Phƣơng Pháp 3.3.1. Đánh giá kiểu hình Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa. Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập lại, cách đo được tiến hành như sau: - Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá. - Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên. - Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của lá. - Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây. - Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái. - Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch. - Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức độ màu khác nhau. Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version 2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non- overlapping) (Sneath và Sokal, 1973). 3.3.2. Đánh giá kiểu gen 3.3.2.1. Tách chiết DNA DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất 26 lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác (Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau: - Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh. - Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate). - Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng). - Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30 phút. - Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận. - Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 65 0 C. - Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l CTAB. Ủ dung dịch 10 phút ở nhiệt dộ 65 0 C. - Bước 8: Thêm 900 l Chlorofom: iso amylalcohol (24:1) trộn đều và đem ly tâm trong 3 phút với tốc độ 13.000 vòng / phút. - Bước 9: Chuyển dịch nổi vào một tube mới 1,5 – 2 ml và thêm vào 600 l isopropanol trộn đều, tiếp tục ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút. Sau khi ly tâm, đổ bỏ phần dung dịch phía trên. - Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô. - Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE . Giữ ở nhiệt độ -20 0 C. 3.3.2.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA Kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0.8 % trong dung dịch TAE 1X. Nhuộm gel với Ethidium bromide và chụp hình qua hệ thống gel document. Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA - Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. 27 - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X - Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu. - Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 55 0 C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp (Nguyễn Thị Lang, 1999). - Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí. Tiến hành chạy điện di - Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di. - Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng). - Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV. Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư. 3.3.2.3. Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD Trộn dung dịch PCR Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số: - DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA). - Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l. - dNTP 2,0 l. - Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l. - Taq polymerase 0,5 l. - Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l. Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt. 28 Bảng 3.7: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2 dNTP 1 mM 100 M 2 Primer 5 M 0,25 M 1 Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,5 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1 H 2 O 13.5 Tổng cộng 20,0 Chạy chương trình PCR Sau khi lấy đủ các thành phần vào tube PCR, ta tiến hành chạy phản ứng với các bước tiến hành (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau: - Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 94 0 C trong 5 phút. - Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 94 0 C trong 30 giây - Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 37 0 C trong 30 giây - Bước 4: Tổng hợp ở 72 0 C trong 1 phút. - Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần. - Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 72 0 C trong 5 phút. - Bước 7: Giữ lạnh ở 4 0 C. Bảng 3.8: Chƣơng trình chạy PCR cho RAPD marker Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Số chu kì Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 Chu kỳ 94 0 C 5 phút 1 2 94 0 C 30 giây 37 0 C 30 giây 72 0 C 1 phút 35-36 3 72 0 C 5 phút 1 4 4 0 C 29 Kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1.5 % Hút 10 l sản phẩm PCR và tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1.5 % để kiểm tra sản phẩm. Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l. Phương pháp tiến hành giống như kiểm tra sản phẩm DNA . Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide. Ta sẽ ghi nhận lại những băng DNA và đem xử lý trên chương trình NTSYSpc. 3.3.2.4. Phân tích dữ liệu PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh) Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến. NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting). Các băng được nhập vào chương trình theo quy tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1. Số liệu này sẽ được sử dụng để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979): S xy =2 xy / x + y - Xy: số băng giữa hai mẫu. - X: số băng của mẫu x. - Y: Số băng của mẫu y. - Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ S xy ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y D xy = 1 - S xy Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 30 1995). Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package-NTSYS để tiện dụng hơn. Cách nhập số liệu Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định chung. Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1. 3.3.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu hình và kiểu gen Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào dữ liệu kiểu hình Qua quan sát và ghi nhận những đặc tính nông học bao gồm chiều cao cây, chiều rộng tán, chiều rộng lá, chiều dài lá, số lá trên bụi, hình dạng lá, màu sắc lá, thời gian trổ hoa và năng suất trái của tập đoàn dứa Cayenne với 50 dòng khác nhau về đều kiện địa lý đã cho thấy sự đa dạng về kiểu hình giữa các dòng dứa trong cùng một giống với nhau. Những số liệu thu nhận được từ những chỉ tiêu hình thái đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1 % (phụ lục I). Độ đa hình giữa các nhóm trong giống được đánh giá theo phân tích nhiều biến (Multivariate analysis) và phân tích phân biệt (Discriminant analysis). Kết quả phân tích này được trình bày trong bảng 4.1, trong đó chỉ tiêu ngày trổ hoa và năng suất chỉ tính trên những dòng cho trái và thu hoạch trái vào thời điểm khảo sát. . Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3. 2. Vật liệu 3. 2.1. Nguồn gốc mẫu Bảng 3. 1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc. ĐBSCL. - Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long . 25 3. 3. Phƣơng Pháp 3. 3.1. Đánh giá kiểu hình Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện. Sokal, 19 73) . 3. 3.2. Đánh giá kiểu gen 3. 3.2.1. Tách chiết DNA DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp