a) Định lượng diosgenin trong bột Nần vàng.
Định lượng diosgenin trong thân rễ Nần vàng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), cách tiến hành như sau:
Bản mỏng: silica gel 60 F254.
Hệ pha động: chloroform – aceton – n-hexan (90:5:5).
Dung dịch thử: Cân chính xác 10g bột dược liệu đã xử lý, chiết với n-hexan trong bình Soxhlet dung tích 50ml trên cách thủy trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi lấy cắn. Cân chính xác khoảng 0,05g cắn thu được vào bình định mức 10ml, thêm khoảng 6ml ethanol 96%, hòa tan cắn bằng cách siêu âm 30 phút, thêm ethanol 96% tới vạch định mức. Dùng dung dịch thu được để chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 20mg diosgenin chuẩn, hòa tan trong bình định mức 10ml bằng dung dịch ethanol 96% sau đó pha loãng 2 lần, ta thu được dung dịch diosgenin chuẩn với nồng độ 0,01g/10mL (dung dịch chuẩn dùng trong ngày).
Bản silica gel 60 F254 (10cm×5cm) đã được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút được chia vạch thành 2 băng, chấm lần lượt mỗi băng 10 µL dung dịch thử (băng 2) và dung dịch chuẩn (băng 1) chấm thành vạch rộng 1cm, cao 0,3cm.
Thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử ceri sulfat (pha theo DĐVN IV).
Hòa tan 10g ceri sulfat (TT) trong 850 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT) bằng cách đung nóng nhẹ. Để nguội, thêm dung dịch acid sulfuric 10% (TT) cho vừa đủ 1000 ml.
Tiến hành sắc ký: Triển khai sắc ký đến khi dung môi chạy được 9cm, lấy bản mỏng ra, sấy ở nhiệt độ 50oC để bay dung môi. Phun thuốc thử hiện màu đều cả bản mỏng, sấy bản mỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 90oC, sau khoảng 20 phút, các vết diosgenin sẽ hiện màu. Đưa bản mỏng đã hiện vết vào máy soi vết, dùng đèn bước sóng 366nm ta thu được các sắc ký đồ của vết chuẩn và vết thử. So sánh diện tích peak sắc ký của peak diosgenin chuẩn với peak diosgenin trong dung dịch thử ta tính toán được lượng hàm lượng diosgenin trong bột dược liệu theo công thức sau:
Trong đó: St: Diện tích peak diosgenin của mẫu thử. Sc: Diện tích peak diosgenin của mẫu chuẩn. mc: Khối lượng diosgenin chuẩn.
mt: Khối lượng cắn chiết pha mẫu thử. mcắn: Tổng khối lượng cắn chiết thu được. mDL: Khối lượng bột dược liệu ban đầu. B: Hàm ẩm dược liệu.
b) Định lượng diosgenin trong cắn chiết bằng dung môi siêu tới hạn
Tiến hành tương tự với phương pháp định lượng diosgenin trong bột thân rễ Nần vàng.
Cách tiến hành chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác 50g bột dược liệu đã xử lý, làm ẩm và trương nở dược liệu bằng 50ml đồng dung môi, tiến hành chiết trong các điều kiện khảo sát cụ thể, thu được dịch chiết. Cất quay loại bỏ dung môi. Dùng cắn chiết thu được, pha dung dịch thử tương tự như mục 2.2.2a. Hàm lượng Diosgenin trong cắn chiết thu được tính theo công thức:
Trong đó: St : Diện tích Peak diosgenin mẫu thử. Sc :Diện tích Peak diosgenin mẫu chuẩn. mc: Khối lượng diosgenin pha mẫu chuẩn. mt: Khối lượng cắn chiết pha mẫu thử. Mỗi mẫu ta thực hiện 3 lần lấy giá trị trung bình.