Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 3 ppt

10 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase  Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg 2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác. Ca 2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. 11 Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp amylase. Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase: Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α– amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8. Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase. Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật. 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi. 2.3.2. Enzyme protease 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 12 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serin. Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid. Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là 13 trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S * + P 1 E + P 2 Trong đó: E – là enzyme, S – là cơ chất. E – S : là phức chất enzyme – cơ chất E – S * : là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme) P 1 : là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới được tạo thành) P 2 : là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành). 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau: Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, 14 hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường. Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi sinh vật. Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp. 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật  Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt, 15 có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi.  Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật.  Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm 2.3. Giới thiệu về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột. 2.4.2. Chức năng sinh học Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme. Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột. 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau như: ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie . 16 VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng. Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN, UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA. 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong nông nghiệp: Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis trong nông nghiệp được tiến hành như sau: Chăn nuôi: Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic. Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp. Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus. 17 Kháng sinh: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr + và Gr - (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Đối tƣợng khảo sát Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.2.1. Thiết bị Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, … 3.2.2.2. Dụng cụ Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri, micropipete, giá ống nghiệm, … Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 121 0 C /15 phút. 19 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10 -1 . 3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10 -1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10 -2 , tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10 -3 ,10 -4 , 10 -5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 37 0 C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng. . hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong. trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 121 0 C /15 phút. 19 3. 3. Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai. ty vacxin và sinh phẩm số 2. Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie . 16 VIME - BACTEVIT của công