Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh Enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh Enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ

NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI

Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ

NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 -

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua

Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng

Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua

Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Phi

TÓM TẮT

BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM Tháng 9/2007 "PHÂN LẬP,

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH

ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS

SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC"

Giáo viên hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian

bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus

subtilis Kết quả chúng tôi có được:

Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme

(amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi

ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn

Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại

Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của

các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ

enzyme của vi khuẩn tốt nhất

Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm

ABSTRACT

A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase,

protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the

results had showed:

We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis

Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase,

protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation

The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7

for 48 hours culture

Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.5 Đặc điểm sinh hoá 5

2.1.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 6

2.1.6.1 Cấu tạo bào tử 6

2.1.6.2 Khả năng tạo bào tử 6

2.3.1.4 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 10

2.3.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase 10

2.3.1.6 Ứng dụng amylase vi sinh vật 11

2.3.2 Enzyme protease 11

2.3.2.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 11

2.3.2.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật 12

2.3.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 13

2.3.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật 14

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp thực hiện đề tài 19

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19

3.4.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 19

3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 19

3.4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 20

3.4.2 Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 21

3.4.2.1 Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 21

3.4.2.2 Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 22

3.4.2.3 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis 23

3.4.3 Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 25

3.4.3.1 Quy trình thực hiện 25

3.4.3.2 Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản 25

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 26

4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 26

4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 26

4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa 27

4.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn 29

4.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 31

4.4 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis 33

4.5 Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất 34

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

PHỤ LỤC 40

Bảng 4 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm 31

Bảng 4 4 Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn 32

Bảng 4 5 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất 33

Bảng 4.6 Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm 34

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2 1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3

Hình 4 1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 26Hình 4 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 27

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 20Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 21

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày đời sống tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng

Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo con Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh

Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu

khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”

1.2 Mục đích đề tài

Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất

chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

1.3 Yêu cầu đề tài

Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm

Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng

Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ

chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm

1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus

subtilis Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng

viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005)

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Đặc điểm phân loại:

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis

Hình 2 1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba

 Đặc điểm phân bố:

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được

phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,

vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996)

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C

 Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng

phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy

 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4

 Môi trường

Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu

Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin

Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt

Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo

màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều

2.1.5 Đặc điểm sinh hoá

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose

Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+)

Phản ứng sinh hoá Kết quả

2.1.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.6.1 Cấu tạo bào tử

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ Vỏ bào tử có nhiều lớp Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý

2.1.6.2 Khả năng tạo bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành

bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000)

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore) Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

2.1.7 Tính chất đối kháng

Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự

hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

dưỡng Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976)

2.2 Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 2.3.1 Enzyme amylase

2.3.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814 Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường

Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase)

2.3.1.2 Vi sinh vật tạo amylase

Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau:

Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus

Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975;

Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961)

Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B subtilis, B macecassavanum, Clostridium

acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh

trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác

Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu

và sử dụng rộng rãi nhất Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này

Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C

2.3.1.3 Đặc tính của amylase

Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase, amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối

Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân

 α-amylase:

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase

α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá)

Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose (hoặc glucogen) (nhiều) (ít)

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+

, Ag+, Hg2+ So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ

tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971) Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh

bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005)

Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn

α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0)

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500

C

Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao

 β-amylase

β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm) Vi khuẩn không có β-amylase

2.3.1.4 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật

Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường

Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã

hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân

2.3.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase

 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:

Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%) Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột

Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô

Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin

Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật

Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme

Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease

Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase Coban kích thích tổng hợp amylase

Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase:

Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào

đặc tính của chủng vi sinh vật pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α–

2.3.2 Enzyme protease

2.3.2.1 Nguồn thu nhận enzyme protease

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học

Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,

Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số

loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.2.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:

Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid

Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:

Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo

Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH

hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus

Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin vào khoảng 33800 – 48400 dalton Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton

Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là

trung tâm hoạt động của các protease kim loại Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

E + S E – S E – S* + P1 E + P2Trong đó:

E – là enzyme, S – là cơ chất

E – S : là phức chất enzyme – cơ chất

E – S* : là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme) P1 : là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới được tạo thành)

P2 : là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành)

2.3.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật

Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật

Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ

Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:

Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S

Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật

Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969) Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,

hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005)

2.3.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường

Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường

Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi sinh vật

Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp

2.3.2.5 Ứng dụng protease vi sinh vật

 Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt,

có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi

 Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

2.3 Giới thiệu về probiotic 2.4.1 Định nghĩa

Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột

2.4.3 Một số chế phẩm probiotic thông dụng

Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau như:

ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2

Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2 BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie

VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng

Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN, UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus

subtilis

 Trong nông nghiệp:

Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis

trong nông nghiệp được tiến hành như sau: Chăn nuôi:

Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con

Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng

Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc,

nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic Trồng trọt:

Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae ngoài ra còn ứng dụng nhiều

trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch

Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm

sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải

Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà

Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia

furnacalis trên bắp

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus

Kháng sinh:

Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác

dụng ức chế vi khuẩn Gr+

và Gr- (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007

3.1.2 Địa điểm

Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Đối tượng khảo sát

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.2.1 Thiết bị

Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng

Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản

3.4 Phương pháp thực hiện đề tài

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn

Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1

3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4 Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1

cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 370C/24h Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc

nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống

lại trên môi trường TSA nghiêng

Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00

Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo

ủ ở 370C/ 24h

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc

Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi

khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định

Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được

Mẫu đất

Dd pha loãng mẫu 10-1

Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA

Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá

Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng

Thử phản ứng sinh hóa

Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

3.4.2 Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis

3.4.2.1 Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh

enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất

Bảng 3 1: Bố trí thí nghiệm 1

Chế độ sục Thời khí gian

Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ

amylase

Hoạt độ protease

Hoạt độ amylase

Hoạt độ protease 24 giờ

48 giờ

 Cách làm:

Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa

4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô

Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi

trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3% Cho vòi sục khí vào bình với

Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi

Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-)

Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis

thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả

Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa

chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

3.4.2.2 Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3%

pH = 6

Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1 Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:

Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld

Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo

Rỉ đường + 1% tinh bột

Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton

TSB + 1% tinh bột

3.4.2.3 Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme

của các chủng Bacillus subtilis

 Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1

Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần)

 Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus

subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất