Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng.
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0.
Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1
Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn
Môi trường sản xuất: cám gạo
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase
Thời gian 48h, nhiệt độ 370C
Thu hoạch chế phẩm
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis
Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái.
Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc
Bacillus subtilis
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis
Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng.
Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Bacillus subtilis
(www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg)
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là
Bacillus subtilis
Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis
được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa
Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose
1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + 13 + + + + 14 + + + + 15 + + + + 16 + + + + 17 + + + + 18 + + + + 19 + + + 20 + + + 21 + + +
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như sau:
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) Chế độ sục khí Thời gian Lô 1: sục khí liên tục (n = 18) Lô 2: không sục khí (n = 18) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) 24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44 48 giờ 47,11 40 25,78 8 Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72
Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt).
Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai loại enzyme giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ) (với P < 0,05) (Phụ lục A). Theo kết quả của chúng tôi khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis ở 48 giờ với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điều kiện nuôi cấy sục khí liên tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxy càng nhiều thì chúng phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme.
Cũng theo kết quả thống kê: có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy (cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng: chủng 2 – 5, chủng 2 – 6, chủng 2 – 8, chủng 1 - 9, chủng 4 - 9,...).
Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme trong cùng một chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxy một số chủng này phát triển tốt hơn và ở chế độ không cung cấp oxy một số chủng khác lại phát triển tốt hơn. Điều này cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giữa các chủng.
Từ các kết quả có được như trên, chúng tôi quyết định chọn chế độ sục khí liên tục trong thời gian 48 giờ và chọn 4 chủng: 2, 7, 9, 10 trong 9 chủng phân lập được để tiếp tục khảo sát hoạt độ của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm Chủng vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Hoạt độ trung bình của 2 loại enzyme 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ amylase protease
1 40 48 16 32 44 24 2 64 56 24 32 60 28 4 40 48 20 32 44 26 5 32 48 20 32 40 26 6 32 40 24 40 36 32 7 32 48 56 48 40 52 8 32 40 32 32 36 32 9 48 48 64 56 48 60 10 32 48 40 56 40 48
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis trên 4 loại môi trường: rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cấy giống là 3%, sục khí liên tục trong 48 giờ (mỗi chủng 4 loại môi trường) (thí nghiệm lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày qua bảng 4.4.
Bảng 4. 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. Môi trường Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Rỉ đường + 2% tinh bột (1) (n = 8) 26 30 Rỉ đường + 1% tinh bột (2) (n = 8) 18,5 22 Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton (3) (n = 8) 20 32 TSB + 1% tinh bột (4) (n = 8) 14,5 20
Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường + 2% tinh bột có hoạt độ enzyme trung bình cao hơn hoạt độ enzyme trung bình trên các môi trường rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên (cụ thể là có sự khác biệt giữa các môi trường: 1 - 2, 1 - 4, 2 - 3, 3 - 4) (Phụ lục B) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P < 0,05) (Phụ lục B).
Theo Nguyễn Đức Duy Anh, (2005): trong 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 (Edward, Fragie, Nomura, pepton - gelatin, rỉ đường + 2% tinh bột) thì môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cũng cho kết quả tốt nhất nhưng hoạt độ của cả hai loại enzyme đều rất cao (amylase: 256 W0/ml, protease: 128 Hdp/ml) so với hoạt độ enzyme của môi trường rỉ đường + 2% tinh bột trong thí nghiệm này (amylase: 26 W0/ml, protease: 30 Hdp/ml). Sự chênh lệch hoạt độ enzyme trong cùng một loại môi trường này có thể là do sử dụng hai nguồn vi khuẩn khác nhau, lượng giống cho vào với tỉ lệ khác nhau.
Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn môi trường rỉ đường + 2% tinh bột để tiến hành khảo sát ở thí nghiệm tiếp theo.
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis các chủng Bacillus subtilis
Dựa trên các kết quả có được ở các thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường rỉ đường + 2% tinh bột ở hai điều kiện pH khác nhau: pH = 6 và pH = 7, thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, với tỉ lệ giống 3%, nhiệt độ phòng (mỗi chủng nuôi ở hai pH khác nhau). Kết quả được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
pH Thời gian 6,0 7,0 Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ (n = 8) 27 13 32 18 48 giờ (n = 8) 32 18 36 18
Qua kết quả khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ở bảng 4.5 chúng tôi thấy ở pH = 7 thì hoạt độ enzyme trung bình của vi khuẩn cao hơn so với pH = 6 và ở thời gian nuôi cấy là 48 giờ hoạt độ enzyme cũng cao hơn khi nuôi ở 24 giờ (kết quả này phù hợp với kết quả về thời gian nuôi cấy ở thí nghiệm 1).
Tuy nhiên kết quả xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa hai điều kiện pH và thời gian ở cả hai loại enzyme (amylase, protease) và cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê bởi vì mức ý nghĩa của hai loại enzyme đều lớn hơn mức ý nghĩa cho phép (Pamylase = 0,055 > 0,05 và Pprotease= 0,215 > 0,05) (Phụ lục C).
4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất
Sau khi đã lựa chọn được 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường TSB, sau đó trộn với cám gạo để thử nghiệm thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản sau khi thành chế phẩm của vi khuẩn
Bacillus subtilis.
Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 - 100C) và ở nhiệt độ phòng (30 - 370C) trong thời gian là 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm
Nhiệt độ Thời gian 4 - 100C 30 - 370C Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 0 ngày 56 38 56 38 10 ngày 5,25 0,0 4,75 0,0 20 ngày 5,25 0,0 4,25 0,0 30 ngày 5,0 0,0 4,5 0,0
Từ kết quả ở bảng trên cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh thì hoạt độ của hai loại enzyme cao hơn so với điều kiện bảo quản thường. Hoạt độ của hai loại enzyme này giảm rất nhanh (hơn 10 lần) chỉ sau 10 ngày bảo quản.
Ở kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy kết quả cụ thể cho từng loại enzyme. Với enzyme amylase kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa hai nhiệt độ bảo quản (với P = 0,0026 < 0,05), còn với thời gian bảo quản có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 0 ngày với các khoảng thời gian còn lại (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Riêng với enzyme protease kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhiệt độ bảo quản này (với P = 1,000 > 0,05) và ở thời gian bảo quản cũng có kết quả tương tự như đối với
enzyme amylase, đó là chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa khoảng thời gian là 0 ngày với 10, 20, 30 ngày (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D).
Qua những kết quả ở trên, do có sự giảm đáng kể của cả hai loại enzyme chỉ trong khoảng thời gian 10 ngày bảo quản, trong khảo sát của chúng tôi cho thấy cám gạo không phải là chất nền thích hợp cho chế phẩm enzyme amylase, đặc biệt với enzyme protease lại càng không thích hợp.
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Sau một khoảng thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi có những kết luận sau: Phân lập được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.
Chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và cho enzyme tốt hơn
Môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại.
pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ thì hoạt độ enzyme của vi khuẩn là tốt nhất. Trong chất nền thử nghiệm cám gạo, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 4 – 100C hoạt độ của enzyme amylase bảo toàn tốt hơn ở nhiệt độ 30 – 370C, riêng về thời gian bảo quản hoạt độ của hai loại enzyme có sự thay đổi lớn từ 0 ngày đến 10 ngày, còn từ 10, 20, 30 ngày thì không có sự thay đổi hoạt độ enzyme.
5.2. Đề nghị
Cần phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ nhiều nguồn khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
Cần khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Thử nghiệm nhiều loại môi trường sản xuất khác nhau để có được môi trường sản xuất thích hợp nhất cho vi khuẩn.
Tìm kiếm chất nền thích hợp cho việc bảo quản enzyme amylase và protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 74 trang.
2. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
3. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, Khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
4. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
5. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
6. Vũ Thị Thứ, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới.
7. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
8. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và khảo sát khả năng sử dụng các chủng phân lập được trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
9. Nguyễn Duy Khánh, 2006. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. LVTN, khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
10. Lê Đỗ Mai Phương, 2004. Phân lập và giám định vi khuẩn Bacillus subtilis trong tự nhiên, bước đầu khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease. LVTN, trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM.
11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1976. Vi sinh vật gây bệnh thú y tập 1, 2, 3. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
12. Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
13. Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
14. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Viện Khoa học Nông Nghiệp và Kỹ Thuật Miền Nam.