Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 1 pdf

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua. Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng. Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua. Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Phi iv TÓM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ enzyme của vi khuẩn tốt nhất. Nhiệt độ 4 - 10 0 C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 37 0 C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. v ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis. Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation. The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7 for 48 hours culture. Enzyme activity conserved better in 4 – 10 0 C than in 30 – 37 0 C. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH x DANH SÁCH SƠ ĐỒ xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích đề tài 2 1.3. Yêu cầu đề tài 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 6 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử 6 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử 6 2.1.7. Tính chất đối kháng 6 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 7 2.3.1. Enzyme amylase 7 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu 7 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase 7 2.3.1.3. Đặc tính của amylase 8 vii 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 10 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase 10 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật 11 2.3.2. Enzyme protease 11 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease 11 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật 12 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 13 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật 14 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật 14 2.3. Giới thiệu về probiotic 15 2.4.1. Định nghĩa 15 2.4.2. Chức năng sinh học 15 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis 16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18 3.1.1. Thời gian 18 3.1.2. Địa điểm 18 3.2. Vật liệu thí nghiệm 18 3.2.1. Đối tượng khảo sát 18 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 18 3.2.2.1. Thiết bị 18 3.2.2.2. Dụng cụ: 18 3.3. Nội dung nghiên cứu 19 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài 19 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 19 viii 3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 19 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 22 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis. 23 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 25 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 25 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 26 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 26 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 26 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa 27 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. 29 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 31 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis 33 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Đề nghị 36 PHỤ LỤC 40 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 21 Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 23 Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 24 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá 29 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) 29 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm 31 Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. 32 Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất 33 Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm 34 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 26 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 27 . Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ. khuẩn Bacillus subtilis 19 3.4 .1. 3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.4.2 .1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời. vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus