Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 4 potx

20 Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 9 0 / 00 Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo ủ ở 37 0 C/ 24h Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G + , bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định. Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được. Mẫu đất Dd pha loãng mẫu 10 -1 Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng 21 Thử phản ứng sinh hóa Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất. Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 Chế độ sục Thời khí gian Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ 48 giờ  Cách làm: Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (121 0 C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô. Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-). Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis 22 thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả. Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3% pH = 6 Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1. Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld. 23 Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Rỉ đường + 2% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton TSB + 1% tinh bột 24 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis  Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1. Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần). Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 pH 6,0 7,0 Hoạt độ enzyme Thời gian amylase protease amylase protease 24h 48h  Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất. 25 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 10 0 C và nhiệt độ phòng. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0. Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 50 0 C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1 Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn Môi trường sản xuất: cám gạo Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase Thời gian 48h, nhiệt độ 37 0 C Thu hoạch chế phẩm 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng. 27 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.biol.pmf.hr/ /odg-slike/odg451.jpg) 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 28 Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose 1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + 13 + + + + 14 + + + + 15 + + + + 16 + + + + 17 + + + + 18 + + + + 19 + + + 20 + + + 21 + + + 29 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như sau: Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) Chế độ sục khí Thời gian Lô 1: sục khí liên tục (n = 18) Lô 2: không sục khí (n = 18) Hoạt độ amylase (W 0 /ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) Hoạt độ amylase (W 0 /ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) 24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44 48 giờ 47,11 40 25,78 8 Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72 Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt). . 3 .4. 1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát. độ enzyme protease và amylase Thời gian 48 h, nhiệt độ 37 0 C Thu hoạch chế phẩm 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. 1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 4. 1.1. Quan sát. 2006) 3 .4. 2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3 .4. 2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác