Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát thành phần hợp chất và khả năng bảo quản nước mía của dịch chiết cây râu mèo (Orthosiphon aristatus)

TÓM TẮTNghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích xác định hàm lượng các hợp chất vàkhả năng bảo quản của dịch chiết cây Râu mèo.. Trong nghiên cứu này, hàm lượngpolyphenol, flavonoid có tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

=

KHAO SAT THANH PHAN HOP CHAT VA KHA NANG

BAO QUAN NUOC MIA CUA DICH CHIET

CAY RAU MEO (Orthosiphon aristatus)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : LE THỊ TU SUONG

Mã số sinh viên : 19126151Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thú Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu và quý thầy cô TrườngĐại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Đặc biệt là các thầy cô Khoa Khoa họcSinh học và Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trưởng đã cung cấp môitrường học tập và rèn luyện tốt Đồng thời đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiếnthức và kinh nghiệm quý báu Luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất dé em có thể hoanthành tốt khóa luận tốt nghiệp

Lời cảm ơn chân thành nhất em xin gửi đến PGS.TS Trần Thị Lệ Minh đãtrực tiếp hướng dẫn đề tài của em Cô đã dành nhiều thời gian, công sức và không ngạikhó khăn dé chỉ bảo, cho em những góp ý trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Và không thể nào quên, con xin vô cùng biết ơn cha, mẹ đã luôn giúp đỡ và

đồng hành cùng con trước những khó khăn

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thé anh chị em và bạn bè ở phòng

nghiên cứu cây Dược liệu (Bio 309), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông

Lâm Thành phố Hồ Chí Minh vẫn luôn hỗ trợ em hoàn thành nội dung nghiên cứu.Cảm ơn những người bạn ở ký túc xá đã bên cạnh mình chia sẻ những niềm vui và là

động lực của nhau cùng nhau tiễn bộ

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Lê Thi Tú Sương, MSSV: 19126151, Lớp: DH19SHB thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Day

là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tintrong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách

nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 08 năm 2023

Người viết cam đoan(Ký và ghi rõ họ tên)

Lê Thị Tú Sương

l

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích xác định hàm lượng các hợp chất vàkhả năng bảo quản của dịch chiết cây Râu mèo Trong nghiên cứu này, hàm lượngpolyphenol, flavonoid có trong mẫu dịch chiết được khảo sát ở các nồng độ ethanol40%, 60% va 80% dựa trên phương pháp quang phố UV-Vis, từ đó chọn ra nồng độphù hợp dé thực hiện các nội dung tiếp theo Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa củamẫu bằng thử nghiệm DPPH và hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus vaEscherichia coli bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy (Kirby - Bauer) dé làm tiền décho thử nghiệm khả năng bảo quản Kết quả cho thấy nồng độ ethanol 60% là nồng độphù hợp dé chiết mẫu Mẫu được chiết với nồng độ ethanol 60% cho kết quả như sau:

hàm lượng polyphenol trung bình trong dịch chiết lá và thân lần lượt là 35,56 mgGAE/g

và 13,53 mgGAE/g; hàm lượng flavonoid trung bình trong dịch chiết lá là 8,94 mgQE/g,trong dịch chiết thân là 2,12 mgQE/g Kết quả kháng oxy hóa DPPH cho thấy ICso ởcao chiết lá là 84,7 ug/mL cao hơn so với ICs ở cao chiết thân là 113,4 g/mL Khảosát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Râu mèo cho thấy ở các nồng độ khảo sát 300,

600 và 900 mg/mL không thé hiện khả năng khang Escherichia coli và có khả năngkháng Staphylococcus aureus từ nồng độ 300 mg/mL Kết quả nghiên cứu cho thay dichchiết có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hiếu khí trong mẫu nước mia trongkhoảng 2 — 4 ngày Việc bổ sung dịch chiết giúp giảm từ 30 — 34% lượng vi khuẩn cótrong mẫu nước mía ban đầu

Từ khóa: Cây Rau mèo (Orthosiphon aristatus), kháng khuẩn, chống oxy hóa, bao quản

ill

The study was carried out for the purpose of determining the content of

compounds and the preservation ability of Orthosiphon aristatus extract In this study, polyphenols and flavonoids contents in the extract sample was investigated at ethanol concentrations of 40%, 60% and 80% based on UV-Vis spectroscopy, thereby selecting the appropriate concentration for further implementation Evaluation of

antioxidant activity of samples by DPPH test and antibacterial activity on

Staphylococcus aureus and Escherichia coli by disc diffusion method (Kirby - Bauer)

to determine The results showed that an ethanol concentration of 60% is a suitable

concentration for sample extraction The sample extracted with 60% ethanol concentration gave the following results: the average polyphenol content in leave and stem was 35,56 mgGAE/g and 13,53 mgGAE/g, respectively; the average flavonoid content in the leaves was 8,94 mgQE/g, in the stem was 2,12 mgQE/g, respectively DPPH antioxidant results showed that the ICso in leaf extract was 84,7 ug/mL, higher than the ICso in stem extract which was 113,4 ug/mL Investigation of the antibacterial activity of Orthosiphon aristatus extract showed that survey concentrations of 300,

600 and 900 mg/mLconcentration did not show resistance to Escherichia coli but resistance to Staphylococcus aureus from the concentration of 300 mg/mL Research results showed that the extract has the ability to inhibit the growth of aerobic bacteria

in sugarcane juice samples for about 2 - 4 days The addition of extract resulted in a 30

- 34% reduction in the amount of bacteria present in the original sugarcane juice sample.

Keywords: “Rau meo” (Orthosiphon aristatus), antibacterial, antioxidants, preserve.

IV

MỤC LỤC

TrangLOI CAM 00 i

6 en iii0.200 Iv

1000 06 i ốc VDANE BACH GAC HỮ VIET TAT vicccrsmecoaennceesnscusmnmemnneamnmenmmaniannns viiDATA B2 TT DĐ TẾ NT sc rxscreeenesmemcormanco meester gnome crewmen viiiDANH SÁCH CAC HÌÏNH -©2222-22222+2222222227122222211 2.21 re ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU . ©2222+22222+2222221222212222 re |

1.1 Đặt vấn đề -2- s+s+2s223252212212112111211212112111111211111121121112012212211112 211 e |1# NI 6n di HĨ casaeeeidaenotbtoogkisdogttotsogfGuookctsdsrnestaitfctofftufnagipssioySinfigiogtftbotgfepsxer |1.58 161:dunø ther Mi Sites sec set sc1innb91ffhGi3nSgESPvdondigSip-j2SEiStS80j2ssốrtöbclSgiĐ5921Lo02845P0100u882EG8.d2H21E.2 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -2- 2522222E22EE2EEzEEzEzrxzrserssrssrssrxerxee.3

2.1 Tổng quan về mía và nước mmía 2-2 ++®2++2EE+EE+E++E+EE+2EE+EE+zExzrxrrzrzrrers 32.2 Sơ lược về cây Râu mèo 2-22 22E22E222E22E122122112212211211211121127121121121211 xe 4

D Delis Phần lơai TIC VẬT cccceeecsssebneotisoktosibsdlbtpsditlqsssiftostgsteöostisosdkbittoskoisstesslissteaxckesksssoi 42.2.2 Đặc điểm hình thái + 2 %+S£SE+EE+EEEE£EE2EE71211211211121111 1121111111111 1111 xe 4

ni n1 42.2.4 Thành phan hóa thực vật 2-2 22s 2E£SE£2E£EE£EEEEE22E225225223121221121122.22 2.20, 4

Di Ac) « PGITDHEDG lissssineseitiiidaiiSSSBISEEI-NRDGGGIR-IOIENNGHERGIENSRSEIGGEDRDRHESSEHISGQNNHSSISBhlNgiBSE 5 DDA DJF AV ONGIG serenade syeteeruetocmne seu onesie stinema ici qeamy nner atadee tedeimetaiall 62.2.5 Các nghiên cứu trong va ngoai nước về cây Râu mẻo -2- 2522222: 62.3 Các nghiên cứu về sử dụng chất bảo quản có nguồn gốc từ tự nhiên 72.4 Tổng quan về phương pháp quang phố hap thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) 8CHUONG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP 22 2 522222E2222E2E222222E xe 93.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2-©22222+222+22222EE222E2223222122E 22x zrrcrrkv 9l5: aCe 0 ee 9 SDJ CONE Pla PAG BIẾT GỮeenneeessebee be nitnniigiAlEsebigii0i0cLANĐSUSE.0E.10050/0110144001005000901-1g 018860 30 93.3.1 Nội dung 1: Xác định độ ẩm và hiệu suất chiết của mẫu thân, lá cây Râu mèo ở

các nồng độ ethanol 40%, 60% và 80% -¿©2222222E+2EE22EE2EE22E1221222222122322222xee 9 3.3.1.1 Độ ẩm bột nguyên liệu 2-22 S2+S22E9EE2EE2E2122121121112121112112111 2121 xe 9 3.3.1.2 Quy trình chiết xuất hop chất - 2 2222++2x+2E+2EE2E2EEEEE2EEzrxrrrrersees 10 3.3.1.3 Hiệu suất chiết cao 2 2+22212212152321121112112112121121112112111211 21211211 1c, 11 3.5 ;1zï, Nữ Ce Lae 12 3.3.2 Nội dung 2: Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khảo sát hoạt tinh

sinh hoc trong cay RAW M60 oo cece 13

3.3.2.1 Xác định hàm lượng polyphenol bang phương pháp quang phô 13

3.3.2.2 Xác định hàm lượng flavonoid bằng phương pháp quang phô - 14

3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 15

3.3.2.4 Đánh giá khả nang khang Staphylococcus aureus va Escherichia coli 16

3.3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm bao quan nước mia ở nhiệt độ phòng và 4°C 17

3.3:3:1; Aáo:địnH độ ĐH :esetnnnneg ii ii l5 4E emu eS 18 3.3.3.2 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí 25c 255222+crtrErrrrrrrree 18 3.4 Phương pháp xử lý số liệu - 2 22222222E22EE22EE2221122122711221122112212221 2212 e2 19 CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2 2©22+22+E2E22E22E22E22E22E222zzze2 20 4.1 Nội dung 1: Xác định độ ẩm và hiệu suất chiết của mẫu thân, lá cây Rau mèo ở các nông độ ethanol 40%, 60% và §0%% 22 22 2222E+2E22E22E2E22E222222222222222222e2 20 4.1.1 Độ âm của nguyên liệu + 2+ 2+S+SE£S22E92E22421121221211212121121112112111 21121 x62 20 4.1.2 Độ âm cao chiẾt - 2 22S22E2E12512112112112112112112112112111121121121111211211 21122 xe 20 4.1.3 Hiệu suất chiết cao 2-52 +22212212522122121212112112121211211121111111121211 2121 xe, 21 4.2 Nội dung 2: Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid va khảo sát hoạt tính sinh HỢP tions cay RẦU THẾU ung iguan tho ANGGTGHHHRI-GIISSIEIGINGRIGNEGISISE-MEFDIORIESEGIENEUEĐSRIGOSSpAgi 22 VN) 00000402 00017567 22

4.2.2 Hartt lượng: HAV OT ss ccsecass B31 65121515533555 4801313138835155.4881115.3864L450.54 435 S5588 385588.30 24 4.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa bang thử nghiệm DPPH -2 2 2225222222522 26 4.2.4 Hoạt tính khang Staphylococcus aureus va Escherichia Coli 28

4.3 Nội dung 3: Thử nghiệm bao quản nước mia ở nhiệt độ phòng va 4°C 2Ð CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ -5- 55-552 2121122210126 32 SV Kt nh .Ẽ 32 SN? J1 -31+-

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2 5-52+S22E£EE£EE2EEEEEEE2E2E2212112121211211121121 11111 xe 33

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

Abs : Độ hấp thụ quang

ctv : Cộng tác viên

DPPH : 1,1-diphenyl-2-pIcrylhydrazyl

DMSO : Dimethyl sulfoxide

GAE : Gallic acid Equivalent

IC : Inhibitory Concentratetion

PCA : Plate Count Agar

LLL : Lan lặp lai

QE : Quecerin Equivalent

SPW : Saline Pepton Water

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

UV - Vis : Ultra violet — Visible

vil

DANH SÂCH CÂC BANG

Trang

Bảng 3.1 Thử nghiệm khả năng bao quan nước mía ở nhiệt độ phòng vă 4°C 17

Bảng 4.1 Kết quả độ đm bột nguyín liệu 22 2 222222EE22E22EE2EE2EE22EZEzzzrrzer 20Bảng 4.2 Kết quả độ đm cao chiết -2- 2222222 22222E22E222122322212232221221222222 xe 20Bảng 4.3 Kết quả hiệu suất chiết cao - 2-2-5: 522222E22E22E2E2E22E22E22322222222222xe2 21

Bảng 4.4 Tương quan giữa nồng độ gallic acid vă độ hap thụ quang ở 765 nm 22

Bang 4.5 Kết qua về hăm lượng polyphenol trong mau lâ, thđn - 23Bang 4.6 Tương quan giữa nồng độ quercetin vă độ hap thụ quang ở 415 nm 24Bang 4.7 Kết quả về hăm lượng flavonoid trong mẫu 14, thđn - 2 2 22 25Bang 4.8 craan9 1 37Bang 4.9 Đường kính vòng khâng khuẩn (mm) - 2-2252 2S22E22E22E22E222222z2522 28Bang 4.10 Tổng số lượng vi khuẩn trong thời gian bảo quản 22252522 29

Bảng 4.11 pH trong thời G14 bÊö QUÂI vesscosscavvssncsconeseesnwsnseanerneensveanonssvenseseasexenenenorves 29

vill

Mau bột lá và thân sau khi xay -. 2-2-5 52222SEcx2EExerxcrrrerrrrerrrree 9

Quy trình xác định độ âm bột - 2 2 22222222E22E222E22E222E2E2222zxe2 10

my fe tle ec tra ge seenessaksensdbsooknhnbbsisGaL6080030601300131206g018010g.0g lỗiQuy trình xác định hiệu suất chiết cao và độ âm cao chiết 12Quá trình thử nghiệm khả năng bảo quản nước mía - -5 +5+ 18Đường chuẩn gallic acid - 2-2222 2222222S22E2EE£EE22EE22E2EE22E22Ezrrerrres 22Dưỡng chuẩn tigttellifisseseeseeeseetsisehdevbrtnrsicBtnild6100060/0186100E9091088.000610f0k0 dữ 24Hoạt tính kháng oxy hóa trên Ascorbic ac1d - +55 ++<<<+<++<<+x 26Hoạt tinh kháng oxy hóa trên cao chiết lá - 2 2©22222222222222zz22zz2 26Hoạt tính chống oxy hóa trên cao chiết thân - 2-2222 2255222522 27

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước mía là một loại nước giải khát được ưa chuộng ở một số quốc gia như:

An Độ, Trung Quốc, Thái Lan, vì hương vị ngọt ngào, giá rẻ và nhiều dinh dưỡng

(Dhansu và ctv, 2023) Do đó nhiều nhà sản xuất tạo ra các sản pham đóng hộp dé mởrộng thị trường tiêu thụ nước mia Tuy nhiên, nước mía thô giàu carbohydrate nếu déquá lâu hoặc bảo quan trong điều kiện không thích hợp sẽ bị tan công bởi hệ vi sinhvật gây hư hỏng (Yusof và ctv, 2000) Dé bao quan các nha sản xuất sử dụng nhữngchat bao quản hóa học được tông hợp nhân tạo như muối natri diacetat va kali benzoat,axit benzoic, ma hầu hết các chất bảo quản hóa học này đều dat tiền và gây các van dé

về sức khỏe người dùng (Ramachandran và ctv, 2016) Hay sử dụng nhiệt dé bảo quancũng được dé cập nhưng quá trình này lại làm mat hương vị, mùi thơm, màu sắc, mùi

vị và các chất dinh dưỡng thiết yếu (Kaavya và ctv, 2018) Các phương pháp giúp duy

trì thuộc tính dưỡng và cảm quan cũng như phải an toàn với sức khỏe đang được chú ýnhiều hơn Việc ứng dụng chất bảo quản có nguồn gốc từ tự nhiên ngày càng được

quan tâm và nghiên cứu (Ramachandran, 2016; Kaavya và ctv, 2018).

Cây Rau mèo (Orthosiphon aristatus) thuộc họ Lamiacea, là một trong những câythuốc cổ truyền Loại cây này tương đối dé trồng và có nhiều ở các nước nhiệt đới như:Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Trong nghiên cứu vào năm 2010, Ho va ctv báo cáorang dịch chiết cây Rau mèo có khả năng ức chế chống lại Vibrio parahaemolyticus tương

đương với sự ức chế của chất bảo quản thực phẩm axit lactic và dich chiết cây Rau mèo

cũng thê hiện hoạt tính chống oxy hóa; từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng các hợp chấtchiết xuất từ cây Rau mèo như một chất bảo quản trong thực phẩm

Dựa vào những đặc điểm trên nên đề tài “Khảo sát thành phần hợp chất và khảnăng bảo quản nước mía của dịch chiết cây Râu mèo (Orthosiphon aristatusy” đượcthực hiện nhằm bước đầu khảo sát hiệu quả bảo quản của dịch chiết cây Râu mèo

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát hàm lượng hợp chất trong cây

Râu mèo khi chiết ở các nồng độ ethanol khác nhau Từ đó, chọn ra nồng độ phù hợp

dé khảo sát khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, cũng như đánh giá hiệu quả bảo quan

nước mia của dịch chiét cây Rau mèo.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Xác định độ âm và hiệu suất chiết của mẫu thân, lá cây Râu mèo(Orthosiphon aristatus) ở các nồng độ ethanol 40%, 60% và 80%

Nội dung 2: Xác định hàm lượng flavonoid và polyphenol có trong dịch chiết lá,thân cây Rau méo (Orthosiphon aristatus) Đồng thời, khảo sát hoạt tính chống oxyhóa và khả năng kháng khuẩn của cây Rau méo (Orthosiphon aristatus)

Nội dung 3: Khảo sát khả năng bảo quản nước mía của dịch chiết cây Rau méo(Orthosiphon aristatus) ở nhiệt độ phòng và 4°C thông qua do pH và đếm vi khuẩnhiếu khí trong mẫu thử nghiệm ở các ngày 0, 2, 4, 6

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về mía và nước mía

Mia là một loại cây công nghiệp ngắn ngày, được trồng nhiều ở vùng nhiệt đớihoặc cận nhiệt đới và thường được trồng để sản xuất đường (Tolera và ctv, 2014).Nhiều sản phẩm như giấy, nhiên liệu sinh học từ bả mía, đặc biệt là nước ép mía đượctạo ra nhằm tăng khả năng tiêu thụ nguyên liệu mía, góp phần phát triển kinh tế xã hội

Nước mia là một loại thức uống được yêu thích trên thé giới với hương vị ngọt ngào,

tươi mát Bên cạnh đó nước mía còn chứa nhiều thành phần như đường sacccharose,canxi, kẽm, sắt, chất xơ hòa tan, vitamin A, C, BI, B2, (Chemist va ctv, 1930) Tuynhiên, nước mía thô khó có thể sử dụng trong thời gian dài do lượng đường cao tạo

điều kiện cho vi sinh vật phát triển gây hư hỏng (Arif và ctv, 2019) Điều này, gây khókhăn trong việc bảo quản nước mía nhằm mục đích đóng chai và phân phối ra thịtrường Dé đáp ứng yêu cầu của các nhà sản xuất về sử dụng các chất bảo quản thực

phẩm tự nhiên, thân thiện với môi trường và an toàn với sức khỏe người tiêu dùng thìnhiều phương pháp bảo quản đã được nghiên cứu (Dhansu và ctv, 2023) Theo Aneja

và ctv (2014), phương pháp thanh trùng bằng nhiệt được sử dụng rộng rãi trong ngành

công nghiệp nước ép dé bảo quản nhưng dẫn đến mat các chất dinh dưỡng thiết yếu,thay đổi tinh chat lý hóa va cảm quan nên các phương pháp thanh trùng không dùngnhiệt (siêu âm, chiếu xa, ) cũng được sử dung dé khắc phục hạn chế của thanh trùngbằng nhiệt Đồng thời các chất bảo quản từ các nguồn tự nhiên là xu hướng mới trongngành công nghiệp bảo quản.

Một số loại vi khuẩn thường xuất hiện trong nước mía là: Escherichia coli,Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Ngoài ra, còn có các loại nam đượctìm thấy trong nước mía như: Aspergillus flavus, Candida albicans, (Mwambete vàMpenda, 2019).

2.2 Sơ lược về cây Râu mèo

Loai : Orthosiphon aristatus Hình 2.1 Cay Rau mèo.

(Nguồn: Những cây thuốc va Vị thuốc Việt Nam,

GS.TS Đồ Tát Lợi)

Các danh pháp khoa học khác: Orthosiphon stamineus Benth, Orthosiphon

spiralis (Lour.) Merr Ngoài ra, cây Rau mèo còn các tên ban địa khác như Kumis Kucing (Indonesia) hoặc là Cat’s whIskers,

2.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây Rau méo là một loài thảo mộc sống lâu năm, chiều cao từ 0,3 m đến 1 m

Thân cây nhỏ, có cạnh vuông, nhẹ, xốp, mặt ngoài màu nâu tím sam, có rãnh doc va có

lông trắng nhỏ Lá mọc đối thành chữ thập, phiến có hình mũi mác dài 4 - 6 cm, rộng

từ 2 - 3 cm, thuôn nhọn ở đầu và mép lá có răng cưa, hai mặt lá màu lục sam, phan gan

chính có phủ lông min Cụm hoa xim co ở ngọn than va ở đầu cành, hoa có mau trang,trắng tím hoặc mau tím (Febjislami và ctv, 2019) Có nhị nhô ra giống như râu conMèo (Mangali, 2020).

2.2.3 Phân bố

Rau mèo là một trong những loại cây thuốc cô truyền được sử dụng rộng rãi ởĐông Nam Á (Febjislami và ctv, 2019) Mọc nhiều ở khắp các nơi như Nam TrungQuốc, Nam Á Ở Việt Nam, cây Râu mèo thường phân bố rải rác ở các đồng bằng

và miền núi như: Cao Bằng, Thanh Hóa, Ninh Thuận, Kiên Giang (Phạm Thị Thúy

vả ctv, 2019).

2.2.4 Thành phần hóa thực vật

Rau méo được xem như là một loại thảo được quý trong y học Theo Đông y, cây

Râu mèo có vị ngọt, nhạt, hơi dang, tính mat, không độc Có tac dụng thanh nhiệt, trừ

thấp, lợi tiểu Trong Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS.TS Đỗ Tất Lợi,

cây Râu mèo được dùng trong bệnh sỏi thận, sỏi túi mật, sốt ban, cúm, tê thấp, phù

Các thành phần hóa thực vật có trong cây Râu mẻo là polyphenol, flavonoids,saponins, steroids và tritepenoids, monoterpenes, (Faramayuda và ctv, 2022) Rau mèochứa các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính: axit rosmarinic, eupatorin, va sinensetin.Axit rosmarinic thuộc nhóm polyphenol, trong khi sinensetin và eupatorin là flavonoid (Faramayuda và ctv, 2022).

2.2.4.1 Polyphenol

Polyphenol được biết đến là một loại chất chuyển hóa thứ cấp phổ biến ở thựcvật, được tìm thấy chủ yếu trong trái cây, rau, ngũ cốc và đồ uống (Pandey và Rizvi,2009) Là nhóm hợp chất được đặc trưng bởi vòng benzen gắn một hoặc nhiều nhómhydroxyl (Lea, 2008) Polyphenol có thé được phân loại dựa trên số vòng phenol vacác nguyên tố cấu tạo nên, bao gồm các nhóm chính như: polyphenol acids,

flavonoids, stilbenes, lignans và các loại khác (Belššak-Cvitanovié và ctv, 2018).

Polyphenol thường tham gia vào quá trình bảo vệ chống lại bức xạ tia cực tím, cũng

như chống lại sự tấn công của mầm bệnh Trong thực phẩm, polyphenol góp phần tạonên vị dang, mau sac, mui, tinh 6n định oxy hóa, Ngoài ra với vai trò là một chấtchống oxy hóa, polyphenol có thé làm giảm hành vi xâm lắn và hình thành mạch của

tế bào ung thư (Lambert và ctv, 2005) Theo các nghiên cứu đã chứng minhpolyphenol còn có vai trò trong việc ngăn ngừa các bệnh thoái hóa thần kinh, đái tháo

đường, loãng xương, (Scalbert và ctv, 2005).

Stilbenes Lignans

Hình 2.2 Cấu trúc một số nhóm polyphenol

(Nguôn: Pandey và Rizvi, 2009)

5

2.2.4.2 Elavonoid

Flavonoid là hợp chất thuộc nhóm polyphenol được nghiên cứu nhiều nhất Cho

đến nay, có khoảng hơn 10.000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và xác định.Chúng thường được tìm thấy trong trái cây, thảo mộc, ngũ cốc, qua hạch (Ullah và

ctv, 2020) Cấu trúc cơ ban của flavonoid bao gồm 2 vòng thơm liên kết với nhau bang

3 nguyên tử cacbon tạo thành di vòng có oxi Chúng được chia thành các nhóm dựatrên sự thay đổi của đị vòng, bao gồm: flavonols, flavones, flavanols, flavones,anthocyanins và isoalvones (Pandey va Rizvi, 2009) Flavonoid mang lại nhiéu loi ichcho sức khỏe, bởi vì rat giàu chất chống oxy hóa giúp cho cơ thé tăng kha năng bảo vệkhỏi các độc tổ nội sinh và môi trường; flavonoid cũng có nhiều lợi ích trong y họcbao gồm đặc tính chống ung thư, chống viêm và kháng virus Đồng thời, cũng có tácdụng trong bảo vệ thần kinh va tim mach (Ullah va ctv, 2020)

OH

OH

Flavonols Flavanones Flavanols

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của flavonoid

(Nguôn: Pandey và Rizvi, 2009)

2.2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Râu mèo

Vào năm 2017, Nguyễn Phi Hùng và ctv báo cáo rằng từ địch chiết phần trên mặt

dat của cây Rau mèo thu hái ở Hà Nội, đã phân lập và tinh chế được ba hợp chất có

dang khung flavonoid trong đó có một flavonol 3’-hydroxy-3,5,7,4’-tetramethoxyflavone;

hai flavone là 5,7,3’,4’-tetramethoxyflavone và 5,7,4-trmethoxyflavone Theo Phạm Thị

Thúy va ctv (2019), kết quả nghiên cứu về hàm lượng một số hợp chat trong cây Râumèo thu hái tại tinh Thái Nguyên như sau: hàm lượng sinensetin bình quân chung là 0,0154%; hàm lượng acid ursolic bình quân chung là 0,0146%; hàm lượng acid rosmarinic bình quân chung là 0,1618%.

Trong nghiên cứu vào năm 2010, Ho và ctv báo cáo rằng dịch chiết cây Rau mèo théhiện hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn cao là do hàm lượng acid rosmarinic cao.Những nghiên cứu về tác dụng được lý đã đề cập rằng dịch chiết nước của loại cây này

có hoạt tính lợi tiêu khi thử nghiệm trên chuột (Adam và ctv, 2009), có khả năng giảmtổng hợp sỏi canxi trong thận (Ahamed va ctv, 2012) Ngoài ra, dich chiết của cây Rau

mèo cũng được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật cũng như

đặc tính điều hoà miễn dich, (Alshawsh và ctv, 2012) Theo Mohamed và ctv (2012),dịch chiết ethanol 50% của Orthosiphon stamineus Benth và hợp chất sinensetin đãphân lập cho thấy hoạt tính ức chế a-glucosidase và a-amylase Sự ức chế các enzymenày có tiềm năng sử dụng trong kiểm soát bệnh đái tháo đường tuýp 2 thông qua việckiểm soát sự hấp thụ glucose Theo Alshawsh và ctv (201 1), trong nghiên cứu về đánhgiá tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất ethanol của cây Râu mèo trong mô hình gâyđộc gan do thioacetamide gây ra ở chuột Nhóm chuột được điều trị ở liều 200 mg/kg

có sự phục hồi đáng kế các enzyme chức năng gan tăng gần mức bình thường Kết quảnay cho thấy chiết xuất 200 mg/kg của Rau mèo có tác dụng bảo vệ gan

2.3 Các nghiên cứu về sử dụng chất bảo quản có nguồn gốc từ tự nhiên

Vào năm 2016, Ramachandran và ctv đã nghiên cứu về việc sử dụng dịch chiết

từ hạt và lá chùm ngây (Moringa oleifera), chanh (Citrus limon) và gừng (Zingiberofficinale) thêm vào nước mia và đánh giá bảo quản ở 2, 4, 30°C Kết qua thấy rằng

điều kiện tối ưu là mẫu nước mía thanh trùng với dịch chiết hạt chùm ngây và nước

chanh (10%) được bảo quản ở 2°C trong thời gian 8 ngày, ở điều kiện này có thời hạn

sử dụng và các thuộc tích cảm quan tốt hơn

Theo Boukhatem và ctv (2020), nghiên cứu nay dé cập đến ứng dung tinh dầukhuynh diệp (Eucalyptus globulus) như một chất bảo quản nước giải khát và ứng dụngvào bảo quản nước ép cam Kết qua cho thấy, việc sử dụng tinh dầu khuynh diệp kếthợp với xử lý nhiệt vừa phải làm giảm sự phát triển của chủng nam men Saccharomycescerevisiae gây hư hỏng trong nước ép cam.

2.4 Tổng quan về phương pháp quang phố hap thu tử ngoại - khả kiến (UV-Vis)

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn được gọi là phương

pháp quang phố hap thụ điện tử, là một trong các phương pháp phân tích dựa trên sựhap thụ bước xạ điện từ Dưới tác động của chùm tia sáng (trong vùng bước sóng 200

— 800 nm) kích thích các electron chuyển từ trạng thái cơ ban sang trạng thái kíchthích Nguyên lý của phương pháp quang phổ hap thụ tử ngoại — khả kiến dựa trên

định luật Bouguer — Lambert — Beer:

Khi chiếu một chùm tia đơn sắc (cường độ bức xa ban dau là lo) di qua một lớpdung dịch thì cường độ bức xa sau khi đi qua dung dịch bị giảm đi còn I do quá trìnhhấp thụ, phản xạ, tán xạ, Độ hấp thụ (A) được biểu thị:

lọ

Độ hấp thụ quang của một dung dịch đối với một chùm sáng đơn sắc tỷ lệ thuậnvới độ dày truyền quang và nồng độ chất tan trong dung dịch Sự phụ thuộc này đượcbiểu thị:

A=exCxd Trong do:

Io: Cường độ ánh sáng don sắc tới;

I: Cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch;

e: Hệ số hap thụ phân tử;

C: Nồng độ dung dich (mol/L);

d: Độ dày truyền quang (cm);

A là độ hấp thụ quang

Trong phân tích định lượng bằng phương pháp quang phổ, khi bước sóng và độ

dày truyền quang d được giữ không đổi thì độ hấp thụ A sẽ tỷ lệ thuận trực tiếp vớinồng độ C Vì vậy đường chuẩn sẽ được vẽ từ dung dịch chuẩn với một dãy các nồng

độ khác nhau.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài “Khảo sát thành phần hợp chất và khả năng bảo quản nước mía của dịch

chiết cây Rau mèo (Orthosiphon aristatus)” được thực hiện trong khoảng thời gian từ

tháng 03 năm 2023 đến tháng 07 năm 2023, tại phòng Nghiên cứu dược liệu và cây

dược liệu (BIO 309), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Cây Râu mèo hoa trắng được thu hái tại tỉnh Đồng Tháp, vào thời điểm cây bắt

đầu ra hoa Tại thời điểm này hàm lượng các hợp chất trong cây đạt cao nhất

Cây Râu mèo (lá và thân) sau khi thu hái sẽ được loại bỏ lá úa vàng và rửa sạch.

Tiến hành phơi khô ở nhiệt độ dưới 60°C đến độ 4m nguyên liệu dưới 12% theo tiêuchuẩn Dược điển Việt Nam IV

Mẫu bột lá Mấu bột thân

Hình 3.1 Mẫu bột lá và thân sau khi xay

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Xác định độ ẩm và hiệu suất chiết của mẫu thân, lá cây Râumèo ở các nồng độ ethanol 40%, 60% và 80%

3.3.1.1 Độ 4m bột nguyên liệu

Độ âm của bột nguyên liệu được xác định bằng phương pháp cân khối lượng

không đối (theo TCVN 1867:2001) Cốc cân được rửa sạch, đánh số, mở nắp và cho

vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ Sau đó, đậy nắp cốc cân và chuyên vào

bình hút 4m có silica gel dé làm nguội đến nhiệt độ phòng Cân 2 g nguyên liệu cho

vào cốc cân, sau đó cân khối lượng tổng hợp Tiếp theo cho vào tủ sấy, mở nắp và say

ở 105°C Cứ sau 2 giờ cân lại 1 lần Cân đến khi mẫu thử đạt khối lượng không đổi sẽ

tính được độ âm bột nguyên liệu Kết quả độ âm bột nguyên liệu được thê hiện bởi giá

trị trung bình của 3 lần lặp lại + SEM và được phân tích bằng phần mềm Minitab 16 Cây Râu mèo | —> | Thu hái, rửa sạch | —3 | Phơikhô |—>| Xay

| Sau 2 giờ cân 1 lần | <—| Sấy 105°C <CÍ Can vio cóc |«—| Mau bot

mi: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g);

ma: Khối lượng cốc và mau sau khi sấy (8);

m: Khối lượng mẫu thử trước khi sấy (g)

3.3.1.2 Quy trình chiết xuất hợp chất

Mau lá, thân của cây Rau mèo được chiết xuất bằng phương pháp ngâm damtrong dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và 80% theo tỉ lệ 1:10 (1 g mẫu với

10 ml dung môi) Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Dịch chiết được lọc bằng giấylọc Whatman Bả mẫu bột được thu hồi và chiết tiếp lần 2 trong 24 giờ ở nhiệt độphòng Gộp dịch lọc sau hai lần chiết đem đi cô cách thủy để đuổi dung môi ở nhiệt

độ dưới 60°C Quy trình chiết xuất được thé hiện trong Hình 3.3, dựa trên tiêu chuẩnViệt Nam V, phụ lục 12.10 và “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” của NguyễnKim Phụng.

10

Ngâm trong ethanol 40%, 60%, 80%

) 22giờ

Dịch chiết Ba mau bột

Ngâm trong ethanol

24 giờ

| Cô cách thủy

Ì < 60°C

Hình 3.3 Quy trình chiết xuất hợp chat

3.3.1.3 Hiệu suất chiết cao

Hiệu suất chiết (E%) là tỉ số giữa tổng lượng cao thu được với tông khối lượngmẫu ban đầu Mẫu dịch chiết được cho vào bình tam giác đã biết trước khối lượng.Dịch chiết được cô cách thủy đề loại bỏ dung môi cho đến cắn, sấy cắn ở điều kiện50°C đến khối lượng không đổi Dé nguội trong bình hút âm và ghi nhận khối lượng

dé xác định hiệu suất chiết (Hình 3.4) Kết quả về hiệu suất chiết xuất được phân tích

bằng phần mềm Minitab 16

1]

Hiệu suất chiết được xác định theo công thức (Nguyễn Thị Linh Tuyền và ctv,2019):

(m¡ — mạ) X (100 —X)

% =

pm = mx(00-H) X 60

Trong đó:

E: Hiệu suất chiết (%);

mo: Khối lượng bình rong (g);

mi: Khối lượng bình và cắn sau khi say ở 50°C (g);

m: Khối lượng mẫu khô (g):

X: Độ âm cao chiết;

Độ âm cao chiét

Hình 3.4 Quy trình xác định hiệu suất chiết cao và độ âm cao chiết

3.3.1.4 Độ Am cao chiết

Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 12.16 Độ 4m cao chiết đượcxác định bằng phương pháp sấy, thông qua cân khối lượng mẫu sau khi sấy so với khốilượng mẫu ban đầu

Dịch chiết sau khi được cô cách thủy dé đuổi dung môi cho đến cắn và sấy cắn ở50°C dé xác định hiệu suất chiết Thì tiếp tục sấy ở nhiệt độ 105°C trong 3 giờ Lay ra

12

để nguội trong bình hút âm có chất hút ẩm silica gel Cân, làm lại nhiều lần đến khi

trọng lượng giữa 2 lần cân không đổi (Hình 3.4) Kết quả độ 4m cao chiết được thé

hiện bởi giá trị trung bình của 3 lần lặp lại + SEM

Độ am của cao chiết được tính theo công thức:

X% = —— x 100

m¡ — mạ

Trong đó:

X: Độ âm cao chiết (%);

mo: Khối lượng bình rong (g);

my: Khối lượng bình và can sau khi say ở 50°C (g);

mạ: Khối lượng bình và cao sau khi say 6 105°C (g)

3.3.2 Nội dung 2: Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khảo sát hoạt

tính sinh học trong cây Rau mèo

3.3.2.1 Xác định hàm lượng polyphenol bằng phương pháp quang phổ

Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ởbước sóng 765 nm, chất chuẩn là gallic acid (Cat#149-91-7,Merck)

Xây dựng đường chuẩn: 100 mg gallic acid được hòa tan trong methanol : nước cat(50: 50 v/v) (Cat#67-56-1, Xilong) va pha loãng thành 100 mL thu được dung dich stockgallic acid có nồng độ 1 mg/mL Đường chuẩn gallic acid được đo ở các dãy nồng độ từ0,05 - 0,25 mg/mL.

Phản ứng hiện màu: Hút 0,5 mL dung dịch chuẩn đã pha loãng trong dãy nồng độ(0,05 - 0,25 mg/mL) lần lượt vào các ống nghiệm có đánh sé thứ tự từ 0 - 5, thêm vào

5 mL thuốc thử Folin - Ciocalteu (tỷ lệ 1:10 trong nước cất) (Cat10900101000,

Merck), sau đó cho 4 mL dung dịch NazCOs 1M (Cat497-19-§, Merck) vào, lắc đều

và dé ôn định ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Do độ hap thụ quang của dãy nồng độ ở

bước sóng 765 nm.

Chuẩn bị địch chiết: Cân 3 ø mẫu lá hoặc thân cho vào bình tam giác có dán nhãn(lá, thân), lần lượt thêm vào 30 mL dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và80%, ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Dich chiết được lọc qua giấy lọc Whatman,

bả được thu hồi và tái chiết lần 2 Thực hiện phản ứng hiện màu với thuốc thử Folin Ciocalteu và NazCOa Hàm lượng polyphenol được biểu diễn theo mg đương lượng

-là

gallic acid trong một gram mẫu khô kiệt (mgGAE/g) (Faramayudal và ctv, 2022;

Pourmorad va ctv, 2006).

Mau trang: methanol : nước cất, Folin — Ciocalteu, NaxCO3 1M

Hàm lượng polyphenol tổng số trong mẫu thử (Nguyễn Thanh Nho va ctv, 2021):

_CxVxFx 100

~ mx (100 — H)TPC

TPC: Hàm lượng polyphenol tổng số của mẫu thử (mgGAE/g)

3.3.2.2 Xác định hàm lượng flavonoid bằng phương pháp quang pho

Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bướcsóng 415 nm, chất chuẩn là quercetin (#Cat90-18-6, Merck)

Xây dựng đường chuẩn: Cân 10 mg chất chuẩn quercetin, hòa tan trong ethanol 80%(#Cat64-17-5, Xilong) và pha loãng thành 100 mL thu được dung dịch stock quercetin

có nồng độ 0,1 mg/mL Đường chuẩn quercetin được đo ở các dãy nồng độ từ 0,02 —0,1 mg/mL.

Phản ứng hiện màu: Hút 0,5 mL dung dịch chuẩn đã pha loãng trong dãy nồng độ(0,02 — 0,1 mg/mL) lần lượt vào các ống nghiệm có đánh số thứ tự từ 0 - 5, thêm vào1,5 mL ethanol 95% Sau đó cho 0,1 mL AICI; 10% (Cat#7784-13-6, Xilong) vào, hỗnhop được thêm 0,1 mL CH:COOK 1M (Cat#127-08-2, Xilong) và 2,8 mL nước cat,lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Do độ hap thụ quang của daynồng độ ở bước sóng 415 nm

Chuẩn bị địch chiết: Cân 3 ø mẫu lá hoặc thân cho vào bình tam giác có dán nhãn(lá, thân), lần lượt thêm vào 30 mL dung môi ethanol ở các nồng độ 40%, 60% và80%, ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Whatman,

bả được thu hồi và tái chiết lần 2 Thực hiện phản ứng hiện màu với AIC] vàCH:COOK Do độ hấp thu quang ở bước sóng 415 nm Kết qua hàm lượng flavonoid

14

được biểu diễn theo mg đương lượng quercetin trên một gram mẫu khô kiệt (mgQE/g)

(Chang và ctv, 2002; Faramayuda và, 2022).

Mẫu trắng: ethanol, AICl: 10%, CH:COOK 1M và nước cat

Hàm lượng flavonoid tổng số trong mẫu thử (Nguyễn Thành Nho và ctv, 2021):

_CxVxFx 100

~ mx (100 — H)TFC

TFC: Hàm lượng flavonoid tổng số (mgQE/g)

3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH

Nguyên tac: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, có màu

tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó

sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH - H), có màu vàng Quá trình

thay đổi từ màu tím sang màu vàng của DPPH khi có mặt chất chống oxy hóa là doelectron tự do cua sốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và mộtnguyên tử hydro dé tạo thành DPPH - H khử Kết quả của sự khử màu tương đươngvới lượng nguyên tử hydro được giữ lại trong DPPH - H Do mức giảm độ hap thu ở

bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa (Bùi

Thị Km Lý và ctv, 2021).

Mẫu bột lá, thân Râu mèo được chiết với ethanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

và chiết 2 lần Mẫu dịch chiết thu được sẽ tiến hành cô cách thủy và sây ở 50°C để thulay cao chiết Pha loãng cao chiết trong methanol(Catf/67-56-1, Xilong) thành các day

nồng độ 50 - 250 g/mL Dung dịch DPPH 0,6 mM (Cat#1898-66-4, Merck) được pha

trong methanol.

Mẫu đối chứng dương: Ascorbic acid (Cat#50-81-7, Merck) được pha trong nướccất tới các day nồng độ từ 20 - 100 pg/mL

Quy trình: Cho 0,5 mL dung địch thử vào các ống nghiệm (được đánh số thứ tự

từ 0 - 7) có sẵn 3 mL methanol, cho tiếp 0,5 mL dung dịch DPPH 0,6 mM Hỗn hợp

15

được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng 30 phút và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm

(Đỗ Văn Mãi và ctv, 2017; Chanda và Dave, 2009)

Mẫu đối chứng thay dung dịch thử bằng methanol, mẫu trắng chỉ chứa methanol.Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:

OD, — OD,

HTCO = (——) x 100

OD, Trong đó:

HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa (%);

OD:: Độ hap thụ quang của mẫu thử;

OD.: Độ hấp thụ quang của đối chứng

Từ kết quả tính được và nồng độ mẫu, xây dựng được phương trình với y là phần

trăm hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ mẫu thử nghiệm Thay giá trị y = 50, tínhđược giá trị ICso, ICso là giá trị biểu thị nồng độ cần thiết dé khử 50% gốc tự do DPPH

Giá trị ICso của dich cao chiết mẫu sẽ được so sánh với giá trị ICso của chất chuẩnascorbic acid Giá trị ICso càng thấp tương ứng với hoạt tính kháng oxy hóa càng cao

và ngược lại Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được phân tích bằng

phần mềm Minitab 16

3.3.2.4 Đánh giá khả nang kháng Staphylococcus aureus và Escherichia coli

Khao sát khả năng khang Staphylococcus aureus va Escherichia coli của caochiết bằng phương pháp khuéch tán đĩa giấy của Kirby — Bauer

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu nguyên liệu ban đầu được chiết với ethanol trong 24 giờ,lặp lại 2 lần Lọc lấy dịch chiết và cô cắn thu cao chiết Phần cao chiết được hòa tan

trong nước cất đến các nồng độ khảo sát là 300, 600, 900 mg/mL

Chuẩn bị dung dịch 0,5 McFarland: hút 0,05 mL dung dịch BaCl; 1%(Cat#10326-27-9, Xilong) vào ống nghiệm chứa 9,95 mL dung dịch H;aSO¿; 1%(Cat#7664-93-9, Duchefa), vortex đều Kiểm tra độ đục bang máy do OD ở bướcsóng 625 nm, giá trị OD625 phải đạt từ 0,08 - 0,1.

Chuẩn bị các chủng vi sinh: các chủng vi sinh vật gồm S aureus, E coli đượchoạt hóa trong 10 mL môi trường LB lỏng (Phụ lục 3) ở nhiệt độ phòng sau 24 - 48h.Sau thời gian hoạt hóa tiến hành ria các chủng vi sinh vật lên các đĩa môi trường thạch,

ủ ở 37°C Khi khuẩn mọc đều tiến hành thí nghiệm Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc

đơn cho vào ống nghiệm chứa 10 mL NaCl 0,9% (Cat#7647-14-5, Xilong) đã được

16

hấp khử tring, vortex đều, so sánh và điều chỉnh độ đục tương đương với chuẩnMcFarland Mật độ vi sinh vật trong ống nghiệm rơi ở khoảng 108 CFU/mL Điềuchỉnh độ đục bằng cách thêm vào sinh khối vi sinh hoặc nước muối sinh lý để có mật

độ cần khảo sát

Ngâm đĩa giấy whatman trong dung dịch chứa mẫu và kháng sinh trong 20 phút.Hút 100 uL dịch khuẩn cho vào các đĩa môi trường LB agar đã chuẩn bị trước, dùng

que cấy trang vô trùng trải đều trên đĩa chờ đặt đĩa giấy khuếch tán Dùng kẹp gap đã

hơ nóng đỏ, để nguội để gắp các đĩa giấy gồm mẫu, đối chứng âm và đối chứng

dương đặt lên bề mặt môi trường LB agar tất cả được thực hiện trong điều kiện vô

trùng, ủ ở 37°C trong 24 giờ Thực hiện thí nghiệm lặp lại 3 lần Đọc kết quả và xác

định đường kính kháng khuẩn

Chứng dương: Amoxicillin 0,1% (#Cat26787-78-0, Merck).

Chứng âm: Nước cat

3.3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm bảo quản nước mía ở nhiệt độ phòng và 4°C

Mẫu nước mía được thanh trùng bằng nhiệt ở 72°C trong vòng 15 giây (Vũ Kim

Dung và ctv, 2020) Cao chiết sau khi loại dung môi được hòa tan với nước cất vô trùng

và bổ sung vào mẫu nước mia để đạt nồng độ khảo sát là 300 mg/mL và 600 mg/mL.Quá trình thử nghiệm sẽ theo dõi các chỉ tiêu về pH và đếm tổng vi khuẩn hiếu khí(theo TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)) ở 0, 2, 4 và 6 ngày trong điều kiện bảoquản ở nhiệt độ phòng và 4°C Quá trình thử nghiệm mô ta trong Hình 3.5.

Bảng 3.1 Thử nghiệm khả năng bảo quản nước mía ở nhiệt độ phòng và 4°C

Mẫu Nông độ mg/mL Nhiệt độ (°C)