Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành chồi từ mẫu đốt thân cây chanh chúc (Citrus hystrix DC.)

Kết quả nghiên cứu cho thay thời gian khử trùng của dung dịch Javen cótác động đến hiệu suất của quá trình vô mẫu đốt thân cây chanh chúc, đồng thời sự thayđổi của nồng độ BA và Kinetin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SAT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG DEN SU HINH THANH CHOI

TU MAU DOT THAN CAY CHANH CHUC

(Citrus hystrix DC.)

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : HO NGUYÊN TAM

Mã số sinh viên : 19126153

Niên khóa : 2019 - 2023

Thành phố Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN SỰ HÌNH THÀNH CHOI

TỪ MAU DOT THAN CAY CHANH CHÚC

(Citrus hystrix DC.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnThS TÔ THỊ NHÃ TRÀM HO NGUYÊN TÂM

Thành Phố Thủ Đức, 03/2024

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Huỳnh Tan Phát cũng như các anh chị

và các bạn làm việc tại Công ty Cô phần Công nghệ Sinh học TPEco Mọi người đã luôn

giúp đỡ và động viên em rất nhiều Em cũng đã nhận được nhiều lời khuyên quý báo từ

mọi người, những lời khuyên này giúp em vượt qua khó khăn một cách dễ dàng hơn

Đặc biệt hơn cả, con xin được cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh, lo lắng, độngviên, ủng hộ cũng như là điểm tựa tinh thần tốt nhất dé con có thé yên tâm hoàn thànhchặng đường cuối của thời sinh viên

Cuối cùng em xin được kính chúc quý thầy cô, gia đình, anh chị và bạn bè luôn

mạnh khỏe và hạnh phúc trong cuộc sông Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Hồ Nguyên Tâm, MSSV: 19126153, Lớp: DH19SHA thuộc ngành Côngnghệ Sinh học của Khoa Khoa học Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện,các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xinhoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đông về những cam kêt này.

Thành pho Thủ Đức, ngày 18 thang 2 năm 2024

Người viet cam đoan

Hồ Nguyên Tâm

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiễn hành nhằm xác định quy trình phù hợp để tạo được nguồnmẫu sạch ban dau và tìm ra môi trường phù hợp cho quá trình phát triển của chồi từ đốtthân cây chanh chúc (Citrus hystrix DC.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vat invitro Chọn ra nguồn mẫu đốt thân từ cây mẹ dam bảo những tiêu chí trong nuôi cấy mô,sau đó tiền hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Javen ở quy trình

vô mẫu Thời gian sử dụng dung dịch Javen dé khử trùng được khảo sát là từ 5 - 20 phút.Sau 1 tuần quan sát, xác định được khoảng thời gian khử trùng bằng dung dịch Javenhợp lý dé tao ra một nguồn mẫu sống sạch sau đó tiếp tục thực hiện hai thí nghiệm tiếptheo Cay mẫu đốt thân cây đã được khử trùng vào môi trường MS được bồ sung Kinetin

(0 - 1,2 mg/l) và môi trường MS được bồ sung BA (0 - 2 mg/l) Sau 6 tuần quan sát, xácđịnh được nồng độ Kinetin và BA phù hợp với quá trình phát sinh chồi của mẫu đốt

thân Kết qua phân tích cho thay khoảng thời gian phù hợp nhất cho quá trình vô mẫu là

20 phút cho tỷ lệ mẫu sống sạch là 85,71% Ngoài ra nồng độ Kinetin bồ sung thích hop

là 0,6 mg/1 với chiều cao trung bình 0,46 cm, số lá trung bình 2,43 lá, tỷ lệ chồi phátsinh 66,67% Nồng độ BA bé sung thích hợp là 1,0 mg/l với tỷ lệ chổi phát sinh là71,43%, số chồi trung bình 3,52 chéi, chiều cao chồi trung bình 1,46 cm và số lá trungbình là 8,10 lá Kết quả nghiên cứu cho thay thời gian khử trùng của dung dịch Javen cótác động đến hiệu suất của quá trình vô mẫu đốt thân cây chanh chúc, đồng thời sự thayđổi của nồng độ BA và Kinetin được bổ sung vào môi trường MS có làm ảnh hưởng đếnquá trình phát triên của mau trong quá trình nuôi cây mô.

Từ khóa: Citrus hystrix DC, đốt thân, BA, Kinetin, Javen, nuôi cay mô

il

The study was conducted to 1dentify the approprlate process for establishing a clean initial sample source and to determine the suitable environment for the development process of shoots from stem nodal segments of kaffir lime (Citrus hystrix DC.) through in vitro plant tissue culture techniques Sterilization times using Javen solution were investigated ranging from 5 to 20 minutes After 1 week of observation, a reasonable sterilization time with Javen solution to produce clean living sample was determined, followed by conducting two subsequent experiments Samples of sterilized stem nodal segments were cultured in MS medium supplemented with Kinetin (0 - 1.2 mg/l) and MS medium supplemented with BA (0 - 2 mg/l) After 6 weeks of observation, the appropriate concentrations of Kinetin and BA for shoot induction from the stem nodal segments were determined The analysis results showed that the most suitable sterilization time for the sterilization process was 20 minutes, resulting in clean living sample rate of 85.71% Furthermore, the suitable supplemented concentration of Kinetin

is 0.6 mg/l, with an average height of 0.46 cm, an average leaf count of 2.43 leaves, and

a shoot induction rate of 66.67% The appropriate supplemented BA concentration was 1.0 mg/l, with a shoot initiation rate of 71.43%, an average number of shoots of 3.52 shoots, an average shoot height of 1.46 cm, and an average leaf number of 8.10 leaves The research results indicated that the sterilization time of the Javen solution affected the efficiency of the kaffir lime stem nodal segment sterilization process, and the variation of supplemented BA and Kinetin concentrations in the MS medium influenced the development process of samples in the in vitro tissue culture.

Keywords: Citrus hystrix DC, stem segment, BA, Kinetin, Javen, tissue culture.

IV

NT ee 21.3 NOi dung thurc Win 01117 2CHACON 7 TÔNG COUN TÃI TBD ccessẰeckeeeeueieiieEirAxd011.36/2164600030000g076 35.1 GiGi thiệu về cây chanh CHÚC sec con HH 1101 00c HH TH 01000000 0011000,A 32„Ì1¿ PHA lGẠI Cay CHAN CHÚ sao binisise tạo thong GEGA.HE.G1GGGESBBH2E01S53G9EHLESSE SE.HS.EESB8 3H88 32.1.2 Nguồn gốc cây chanh chúc 2-22 2+222222EE22EE2EE22E22212232221221221122122222 xe 33.1.5, Si dng | en ee ee ee eee 32.1.4 Điều kiện sinh thái -22¿-222+222++22EEEtEEErtEEErrrrrrrrtrrrrrtrrrrrrrrrrirrrrrre 42.1.5 Các phương pháp nhân giống của cây chanh chúc -2 -2222+z55z222z£- 42.2 Tổng quan về nuôi cay mô tế bào thực vật - 2-2 22 2s+2z+2E+£E+zE+zE+zxzzxezed 45.1 Kiili riện nuôi sầu THÍ xe x.emud.eecưietdEcyrgrxrrccrtperdrsgrrrrcetrrrziirz 42.2.2 Cơ sở khoa học và ý nghĩa kỹ thuật của nuôi cay mô tế bào thực vật 52.2.3 Các giai đoạn chính của quá trình nuôi cấy mô thực vật -25¿ 62.2.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - -¿-©22+52+z+ccxcscsez 72.2.5 Một số hiện tượng bat thường trong nuôi cay mô tế bào thực vật 8

2G, Coe ait Baie ch Pet orvernernicrrenricmemamsionemememanvamennremneannees 9

226.1, AUR Va ảnh HƯỚNG COBB UI esse corenscacxsnnvssexsnnensusenemsenyeacanersnnnnennnnevormrenenesectnys 9

2.2.6.2 Cytokinin va ảnh hưởng của cyfOKITIH - - - <5 * 2£ +*E+vEeeEerrerrererrre 10 2.3 Các nghiên cứu khoa học liên quan - + 252 +52 *S2*22£+2E£z£+zEreerrerrerrrrree 11 23:1; Cầu Nght, CUM THONG TUG Gssccssseoagáo l6 bngocislgBaissgassuocdgglGuìtGS8Ge-3035830018 teenie: 11

2.3.2 Các nghiên cứu trên thé giới -2- 2222222E22E22EE22E22212212221221221122122222 xe 13

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -¿©225522+22x+zzz+zxze 153.1, Thời gian wil dia: điểm nghiền GĨẦN susxecceseeeenisresetoesbinegdisreoDgSGitiAiGE1050 80300 0006 153.2 Vat lidu nghién CUWU 153.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2¿22222+222E22122212221221122112211221122112211 2212 xe 153.2.2 Trang thiết bị và (UNS CU 6z g1616166151636633301481S8E0365E539t984888185015003856313588045335848803558 153.2.3 Hóa chất va môi trường . - 22+ 52S2se2 e2reEEeEEerkerrrtrxrrrerrrerrrrrerrreee 15

KP N6? 04 6a Tàn +T ,HẬ)|HĂ 173.3 Phương phap NEMEC GỮIeceeseeieetbinbodiaikeroistiilseiskpi01001 00 2001011000150182133189013800108/2/ t7

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Javen trên mẫu 173.3.2 Khao sát anh hưởng của nồng độ Kinetin đến kha năng phat sinh chdi 18

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát sinh chồi 19

A, Phương phần ah 9 6 UR sasseeeebesdreedtioidbeititogniafosagbd04i02g00:020d6chrgttSbindl 20

CHƯƠNG 4 KET QUA VA THẢO LUẬN 2-©22222222222222E22222xzzxzzzxee 21

4.1 Tác động của thời gian khử trùng dung dich Javen trong quá trình vô mau 21

4.2 Tác động của Kinetin đến khả năng phát sinh chồi -2-22 5z: 244.3 Tac động của BA đến khả năng phát sinh chồi -2-22-522552252225222zz252 30CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, -2-©22©22222222E2EE222E22E2EE22EczEerxee, 39

5.1 Kết Wate cccccccccccccscecsscecscsscecsvcecscsvcecsvesesesscecsvsscscsvsecsvsesscevsucsvsusecsvsecsvesecsesseeeeseees 39

8 mẽ 39TÀI LIỆU THAM KHẢO 0n rrrierrkeverrke 40

OE 0005 43

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

GC-MS : hệ thống sắc ký khí - quang phô khối

HgCl2 : thủy ngân clorua

IAA : indol acetic acid

IBA : indol butyric acid

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) - 16

Bang 3.2 Khao sát anh hưởng của thời gian khử trùng dung dich Javen 18

Bang 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình phát sinh chồi 19

Bang 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến quá trình phát sinh chdi 20

Bảng 4.1 Các chỉ tiêu theo dõi mẫu đốt thân cây chanh chúc sau 7 ngày quan sat 22

Bảng 4.2 Các chỉ tiêu theo dõi chi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy - - 24

Bang 4.3 Chiều cao trung bình (cm) và số lá trung bình (14) sau 2 tuần nuôi cấy 35

Bang 4.4 Tác động của Kinetin đến trạng thái chồi phát sinh sau 2 tuần nuôi cay 26

Bảng 4.5 Chiều cao trung bình (cm) và số lá trung bình (lá) sau 4 tuần nuôi cấy 26

Bảng 4.6 Tác động của Kinetin đến trạng thai chi phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy 28

Bảng 4.7 Chiều cao trung bình (cm) và số lá trung bình (lá) sau 6 tuần nuôi cấy 28

Bang 4.8 Tác động của Kinetin đến trạng thái chi phát sinh sau 6 tuần nuôi cấy 30

Bảng 4.9 Tỷ lệ (%) và số chồi trung bình (chồi) sau 2 tuần nuôi cấy - 31

Bảng 4.10 Chiều cao trung bình (cm) và số lá trung bình (1á) sau 2 tuần nuôi cấy 32

Bảng 4.11 Tác động của BA đến trạng thái chỗồi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy 33

Bảng 4.12 Các chỉ tiêu theo dõi chồi phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy - 33

Bang 4.13 Tac động của BA đến trạng thái chồi phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy 35

Bảng 4.14 Các chỉ tiêu theo dõi chồi phat sinh sau 6 tuần nuôi cấy - 35

Bang 4.15 Tác động của BA đến hình thái chồi phát sinh sau 6 tuần nuôi cấy 37

Vill

Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô - 2-2 22 2+2z2222z2z222zz>x2 7

Xử lý mẫu cho nội dung khảo sát dung dịch Javen -2-2- 21

Mau cay không đạt chuẩn sau 7 ngày quan SAt -.cccssccseesssesssesseecseeeneeens 23Mẫu sống 001 24Chéi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có bé sung Kinetin 25

Chéi phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung Kinetin 27

Chỗi phát sinh sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bồ sung Kinetin 29Chỗi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA 32Chỗi phát sinh sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA 34Chéi phát sinh sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA 36

1x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Theo Srifuengfung và cộng tác viên (2020) thì cây chanh chúc có tên khoa học

la Citrus hystrix DC, có nguồn gốc từ đảo Sumbawa của Indonesia, sau đó được trồng

ở Indonesia, Thái Lan, Malaysia và khu vực nhiệt đới của chau A (Farid và ctv, 2017)

Ở Việt Nam, cây được trồng nhiều ở tỉnh An Giang và các tỉnh miền Đông Nam Bộ

Vào năm 2022, Đặng Huỳnh Giao và cộng tác viên đã báo cáo rằng cây chanhchúc mang mùi thơm đặt trưng, chứa nhiều tinh dau ở lá, hoa và trai (đặc biệt chứa nhiều

ở phần vỏ xanh của trái) Hàm lượng tinh dầu có trong cây chanh chúc cao gấp 3 - 5 lần

so với các loại quả khác cùng họ nên có giá trị kinh tế cao và được ứng dụng ở nhiềulĩnh vực khác nhau Tinh dầu chanh chúc có kha năng đuổi côn trùng mang nhiều lợi íchđối với sức khoẻ con người như: giảm căng thắng, cải thiện giấc ngủ, lưu thông máuhuyết Tinh dầu từ cây chanh chúc còn có khả năng kháng khuẩn tự nhiên nên đượcnghiên cứu ứng dụng trong các sản phẩm diệt khuẩn Trong lá chứa chủ yếu các hợpchất flavonoid, tannin, saponin, alkaloid, dịch chiết xuất từ lá có tác dụng bảo vệ gan doparacetamol gây ra, tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư cô tử cung và

các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh (Arumugam và ctv, 2015; Chueahongthong và

ctv, 2011; Tunjung và ctv, 2015) Trong y học cô truyền còn được dùng chữa cảm cúm,sốt, cao huyết áp, đau bụng, tiêu chảy ở trẻ sơ sinh (Fortin và ctv, 2002)

Cây chanh chúc ngày càng được su dụng làm hương thơm trong ngành côngnghiệp thực pham, nước hoa và mỹ phẩm Ở bán đảo Malaysia, qua và lá cũng được

dùng dé gội dau, nước ép có tác dụng làm mềm da và khử mùi hôi cơ thé (Dassanayake,

1985) Lá được dùng làm gia vi đặc trưng trong ầm thực, một trong nhưng món ăn nôi

tiếng khắp toàn cầu đó là Tom Yum Ở Thái Lan, quả được dùng làm gia vị và pha chế

đồ uống, trà Trong am thực Việt Nam lá cây chanh chúc được sử dụng cho rất nhiềumón ăn khác nhau nhưng nồi tiếng nhất là thịt gà hấp lá chúc Ở An Giang nỗi tiếng với

đặc sản cháo bò trái chúc, món ăn của sự giao thoa văn hóa tộc người Khmer và người

Việt, bên cạnh món gà hấp lá chúc

Hiện nay cây chanh chúc chủ yếu được nhân giống bằng hai phương pháp truyềnthống chính là gieo hạt và chiết cảnh Những phương pháp truyền thống thường khôngthé đáp ứng được tốt nhu cầu của thị trường Phương pháp nhân giống in vitro là mộtcông nghệ tiên tiến mới đang ngày càng phổ biến, phương pháp này cung cấp một sốlượng cây giống chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh, cây con ôn định về 2 mặt di

truyền (nhân giống vô tính), khắc phục được nhược điểm thoái hóa, đem lại hiệu quả

thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây giống Xuất phát từ những nhu cầu thực tếtrên, đề tài khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành chdi từ

mẫu đốt thân cây chanh chúc (Citrus hystrix DC.) được thực hiện

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: khảo sát thời gian khử trùng dung dịch Javen trong quá trình vô mẫu.Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng phát sinh chồi

Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát sinh chồi

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây chanh chúc

2.1.1 Phân loại cây chanh chúc

Giới: Plantae

Ngành: Angiospermae

Lớp: Species

Bộ: Sapindales Họ: Rutaceae Chi: Citrus Loai: Citrus hystrix Tên khoa học: Citrus hystrix DC Hình 2.1 Cay chanh chúc.

2.1.2 Nguồn gốc cây chanh chúc

Cây có nguồn góc từ đảo Sumbawa của Indonesia, sau đó được trồng ở Indonesia,

Thái Lan, Malaysia và vùng nhiệt đới châu Á (Farid và ctv, năm 2017), hiện được trồng

rộng rãi trên thế giới Tại Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi nhưngphổ biến như một loài cây đặc hữu vùng Bảy Nui, An Giang

Theo Swingle và cộng tác viên (1967) cho biết vào năm 1824 thì cái tên

“Mauritius papeda” được De Candolle (DC) đặt cho cây chanh chúc, ông đã nghiên cứu

và phân loại C Hystrix là loài đầu tiên của phân chi Papeda Cây chanh chúc hay còn

được gọi phô biến ở Hà Lan và Đức là “Mauritius Papeda”, trong khi ở Pháp, Ý và TâyBan Nha thì được gọi là “Combava” Tên gọi phô biến toàn cầu của chanh chúc là KaffirLime Tại miền Bắc Việt Nam cây được gọi bằng tên trấp (chấp, giấp) còn ở vùng An

Giang miền Tây Nam Bộ, cây mang tên trúc (chúc) hay trúc thơm

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây chanh chúc là một loài cây thân gỗ nhỏ đến trung bình chiều cao từ 3 - 6 m

và chiều rộng khoảng 2,5 - 3 m, cành nhẫn và có gai Thân lúc nhỏ có màu xanh bóng

và cây có lớp vỏ mỏng bên ngoài, khi trưởng thành thân chuyển màu nâu sam, trên than

có rất nhiều gai nhọn mọc ngang Lá cây chanh chúc có hình thái độc đáo đặc trưngtrong số các loại cây cùng họ, lá mọc xen kẽ, giống hình số 8 có chiều dài 7,5 - 10 em

3

Mặt trên của lá màu xanh đậm còn mặt dưới sẽ có màu nhạt hơn, mùi rất thơm Cuống

lá dài mở rộng thành các cánh nồi bật, dài 15 cm và rộng 5 cm, mỗi lá chia thành hai

phần trông như là một lá đôi Hoa nhỏ, thơm, cánh hoa màu trắng với mép màu tím dài

7 - 10 mm, có 4 - 5 cánh hoa, hình bầu dục chữ nhật, nhị hoa màu vàng xếp thành bóhay chùm nhị Quả có hình tròn, vỏ san sùi, màu lục, khi chin có màu vàng, vỏ khá dày,

thịt qua màu vàng xanh, ít nước nhưng nước có vị the và rất chua, đường kính 5 - 7 em

Hat quả có gai, hình bầu dục, dải 1,5 - 1,8 em và rộng | - 1,2 cm

2.1.4 Điều kiện sinh thái

Theo Farid và cộng tác viên (2017), hai loại khí hậu chính phù hợp cho quá trìnhphát triển của cây chanh chúc là khí hậu nhiệt đới, khí hậu cận nhiệt đới Cây phát triển

tự nhiên và có sức sông mạnh, sông ở nơi có ánh sáng trực tiép, không chịu ram.

Độ pH của dat thích hợp cho cây nằm trong khoảng 5 - 6 pH Hiện tượng vàng lá

của cây cũng có thê là vấn đề của pH đất (thường có pH trên 7,5) Đất có khả năng thoátnước tốt sẽ giúp cho cây chanh chúc phát triển mạnh ở bộ rễ, thúc day tốc độ tăng trưởng

của cây giúp cây luôn khỏe mạnh Đất thịt pha cát, nhiều mùn rất thích hợp cho cây

chanh chúc phát triển Tùy vào nơi trồng cây (trồng trong chậu hay trồng xuống đất) màcông thức đất trồng sẽ khác nhau, việc này ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây

Theo Huxley (1992), nhiệt độ lý tưởng cho việc trồng cây nằm trong khoảng từ

25 - 30°C Sự phát triển của cây thường ngừng lại khi nhiệt độ thấp hơn 13°C hoặc caohơn 38°C Nếu có thời kỳ khô kéo dài hơn ba tháng, thì cần phải tưới tiêu cho cây.2.1.5 Các phương pháp nhân giống của cây chanh chúc

Cây được nhân giống bằng hai phương pháp chính đó là gieo hạt và chiết cành.Đây là hai phương pháp nhân giống truyền thống được áp dụng phô biến với cây ăn quả.Nhiều người thường chọn trồng cây chanh chúc bằng cách chiết cành thay vì gieo hạt,

vì hạt giống của cây thường khó nảy mầm và số lượng hạn chế nên khó có được hạt

giống chất lượng cao (Handayani và ctv, 2020) Cần lưu ý chọn giống phải sạch bệnh.2.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cay mô

Nuôi cay mô thực vật có thể hiéu là một phương pháp nhân giống nhân tạo bằngcác cô lập các bộ phận của cây như cơ quan, mô, tế bào hoặc tế bao trần dé nuôi cấy trên

môi trường có chứa chất dinh dưỡng (Wijiayanti và ctv, 2015) Nuôi cấy mô tế bào thực

vật là một phạm trù chung cho tất cả các loại nuôi cây mà nguyên liệu là các thực vậthoàn toàn sạch bệnh trên môi trường nhân tạo và trong điều kiện vô trùng (Haberlandt,

1902) Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép phát sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơquan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ (Dương Công Kiên, 2002) Nuôi cấy mô tế

bào thực vật có rất nhiều ứng dụng khác nhau, trong đó ứng dụng nổi bật nhất và đạtđược kết quả thương mại lớn nhất là nhân giống in vitro

2.2.2 Cơ sở khoa học và ý nghĩa kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào từ một cơ thê đa bào đều chứa đủ thông tin

di truyền dé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh Haberlandt là một nhà khoa họcngười Đức, là người đã đặt nền móng ban đầu cho lĩnh vực nuôi cấy mô từ việc đưathuyết tế bào của hai nhà sinh vật hoc Đức Schleiden và Schwann vào thực nghiệm năm

1902 Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương

pháp nuôi cay mô tế bào thực vật Ky thuật nuôi cây mô tế bào thực vật xét cho cùng là

kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựavào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thựcvật (Ngô Xuân Bình, 2009) Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô khang định qua thànhcông của công trình nuôi cây bao phân lúa và thuôc lá được thực hiện vào năm 1978.

Tế bảo thực vật có tính toàn năng, tức là mọi tế bào sẽ đều có cùng hệ gen và cókhả năng sinh sản vô tính Do đó, chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường thuậnlợi dé tạo ra các cá thể mới đồng loạt về tính trạng, kiểu gen và kiểu hình Dựa trên tính

toàn năng này, phương pháp nuôi cấy mô tế bào xuất hiện Cơ sở khoa học của nuôi cấy

mô tế bào được dựa trên sự nhân đôi và phân li đồng đều của các nhiễm sắc thé trong

quá trình nguyên phân Thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật có khả năng phát sinh

thành cây hoàn chỉnh (còn gọi là totipotency - khả năng biệt hóa của tế bào đơn lẻ thànhnhững tế bào chuyên biệt với số lượng không giới hạn) Các tế bào đơn lẻ, các tế bàothực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh lá, rễ hoặc thân, thường có thể

được sử dụng dé tạo ra các tế bào mới trên môi trường nuôi cấy bổ sung các chất dinh

dưỡng và hormone thực vật.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là một trong những giải pháp công nghệ

mới có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học Trên các môi trường nhân tạo, từ

5

các mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hóa và phát triển thành cây con hoàn

chỉnh (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005) Theo Dương Mộng Hùng và Lê Đình Khả (2003), đây

là một kỹ thuật hiện đại và là một phương pháp mang nhiều điểm ưu việt như: tạo ramột quan thé cây con đồng đều giữ nguyên được pham chat di chuyền từ cây mẹ, bảotồn ưu thé lai, nhân nhanh những cây quý hiếm, là phương thức nhân giống bổ sung cho

các loài cây khó thu hạt và khó bảo quản, phương pháp được thực hiện một cách chủ

động trong mọi điều kiên thời tiết Theo Vũ Văn Vụ và cộng tác viên (2005) nuôi cấy

mô còn: cho hệ số nhân giống cao, không tốn nhiều diện tích trồng trọt, cây con sạchbệnh, thuận tiện cho việc vận chuyên.

2.2.3 Các giai đoạn chính của quá trình nuôi cầy mô thực vật

Theo La Việt Hồng và Ong Xuân Phong (2021) thì quá trình nuôi cấy được chiathành 4 giai đoạn quan trọng sau:

Giai đoạn 1: tao vat liệu khởi đầu, ở giai đoạn này cần chuẩn bị cây mẹ, cây mẹcần phải khỏe, sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống

sẽ đạt hiệu quả tối ưu Sau đó lấy mẫu từ cây mẹ và khử trùng mẫu, đây là giai đoạn vô

mẫu dé đưa mẫu thích hop từ cây mẹ chuyên vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện

vô trùng Ở giai đoạn này cần tạo được mẫu vô trùng cho các giai đoạn nuôi cấy in vitro

nhằm loại bỏ các vi sinh vật tồn tại trên mẫu và môi trường quanh mẫu Các phươngpháp khử trùng phổ biến bao gồm ngâm mẫu trong các hóa chất thường là ethanol 70%loãng, dung dịch Javen loãng, nước khử ion Với thời gian nồng độ khử trùng thích hợp,

sau đó rửa lai bang nước vô trùng trước khi cây vào môi trường.

Giai đoạn 2: phát sinh và nhân nhanh chồi (đôi lúc giai đoạn này được chia nhỏhơn), mục đích giai đoạn này là giúp phục hồi mẫu sau quá trình khử trùng, phát sinhchéi, từ mẫu đã khử trùng và tạo ra lượng mẫu đủ dé nhân nhanh, nhân đa chổi hoặcsinh khối Đối với phát sinh (thường kéo dài 4 - 6 tuần) mẫu được cấy vào môi trường

cơ bản có khoáng, chất điều hòa sinh trưởng và chất dinh dưỡng bổ sung Đảm bảo các

điều kiện song tối ưu cho mẫu về ánh sáng, độ am, nhiệt độ, Công đoạn phát sinh cây in

vitro là bước rất quan trọng dé thực hiện thành công các kỹ thuật của công nghệ sinhhọc trong chương trình cải thiện giống (Pati và ctv, 2005) Đối với nhân nhanh thì đây

là một ưu điểm lớn của phương pháp nhân giống in vitro, đây là giai đoạn then chốt củatoàn bộ quá trình nhân giống Ở giai đoạn nhân nhanh, mẫu được kích thích dé phat sinh

6

nhiều chéi, cần xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp Các

chất điều hòa sinh trưởng và các chất phụ gia như nước dừa, khoai tây đóng vai trò quantrọng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà người ta có thê nhân nhanh theo hướng kích thích

sự phát triển của chồi nách hoặc kích thích sự hình thành cụm chồi từ mô phân sinhđỉnh Yêu cầu của nhân nhanh là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng đến sức

sông va tính chat di truyện của cây.

Giai đoạn 3: ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Những chỗi đạt chiều cao thích hợp ở giai

đoạn 2 sẽ được chuyền sang môi trường kích thích ra rễ Ở giai đoạn này môi trườngcần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin đề rễ phát triển Với những cây không ra

ré in vitro thì sẽ được chuyên ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh

(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Giai đoạn 4: đưa cây ra vườn ươm, đây là giai đoạn cây con thích nghỉ dần vớiđiều kiện sinh trưởng tự nhiên ngoài ống nghiệm trước khi đem ra vườn Cây con phải

đủ tiêu chuẩn về các chỉ số như chiều cao, số lá Dé tránh tinh trạng cây chết khi chuyên

ra ngoài vườn ươm thì vườn ươm phải mát, cường độ chiếu sang thap, nhiệt độ khôngkhí mát, dộ âm cao, ươm trong cơ chất dễ thoát nước, tươi xốp, giữ được âm

Plants established in individual cells.

SS 3 - 4 weeks under mist

Bevis Total growth period in cells = 3 months rooted directly in soil

1-2 months Saleabie piant

Giai doan 3 Ra ré tao cay hoan chinh Giai doan 4 Huấn luyện cây con

thích nghi với điêu kiện tự nhiên

Hình 2.2 Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô

(Nguồn: La Việt Hồng và Ong Xuân Phong, 2021)

2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bao thực vật bao gồm:

Cây cây: nuôi cây cây con và cây lớn hơn.

Cấy phôi: gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành.Cấy cơ quan: cấy các cơ quan thực vật tách rời.

Cây mô hoặc mô sẹo: cấy các loại mô tách ra từ phan bat kỳ của một cơ quan

Cấy tế bào và huyền phù tế bào: cấy tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất nhỏ.Cấy tế bào trần: là những tế bào không có thành (vách) được sử dụng trong kỹthuật đi truyền

Cấy túi phan (thé đơn bội): cấy túi phần hoặc những hạt phần chưa trưởng thành

dé thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền

Ở nghiên cứu này thực hiện phương pháp nuôi cấy mô và cơ quan tách rời thực

vật Cơ quan tách rời được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu đốt thân cây chanh chúc

Các mô cơ quan tách rời của cây như lá, thân, hoa, rễ Nhu cầu dinh dưỡng khinuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thé thay một số yêu cầu

chung như nguồn cacbon dưới dạng đường va muối của các nguyên té đa lượng và vi

lượng Còn một số chất đặt biệt như vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng Muốnduy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên chuyên sangmôi trường mới Trong nuôi cay mô các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng

vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất này (Nguyễn Thị Huỳnh Uyên, 2012).2.2.5 Một số hiện tượng bat thường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tạp nhiễm: là vấn đề dé mắc phải trong nuôi cấy mô thực vật và gây hậu quảnghiêm trọng đến hiệu suất Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính

va đây cũng được xem là giai đoạn khó khăn nhất Dé khắc phục van đề nay thì cây mẹ

và vị trí lấy mẫu phải sạch, phòng cấy phải đảm bảo vệ sinh

Hiện tượng hoại tử mẫu cấy: các triệu chứng gồm mẫu hóa nâu den, lá và chồi

non chuyên sang màu vàng trước khi hoại tử và chết Các biện pháp dé giảm hiện tượng

hoại tử mẫu cấy như điều chỉnh nồng độ môi trường nuôi cấy, giảm nồng độ dinh dưỡngxuống một phần tư hoặc một nửa, sử dụng than hoạt tính với liều lượng thích hợp, loại

bỏ lá và chéi bị vàng nâu trước khi sử dụng chúng dé nuôi cấy (Chiruvella và ctv, 2012)

Hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu: có thể sử dụng than hoạt tính hoặc

polyvinyl pryolidone để hấp thụ chất phenol, từ đó ngăn chặn quá trình hóa nâu hoặc

đen của mẫu Nhiều phương pháp khác nhau đã được đề xuất để giảm hiện tượng hóa

nâu, bao gồm việc sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non, gây ít vết thương trên mẫu khi khử

trùng, ngâm mau trong dung dich ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cây hoặc

cay chuyền thường xuyên ở giai đoạn ban đầu (Ha Thị Mỹ Ngân va ctv, 2020)

Hiện tượng thủy tinh thé: thân, lá phông to, chứa nhiều nước, cây có dạng trong.Phương pháp làm giảm quá trình hóa thủy tỉnh thể: giảm sự hấp thu nước của cây, hạnchế gây vết thương cho mẫu, giảm nồng độ đạm trong môi trường, giảm khí ethylene,tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cay (Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2020)

2.2.6 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hocmon sinh trưởng) là những

chất được sinh ra trong cây dé điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây.Trong suốt đời sống, cây phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển như nảy mầm, lớn lên,

ra hoa, kết quả Các chất điều hòa sinh trưởng giúp cây tiễn hành các giai đoạn này mộtcách cân đối hài hòa theo đặc tính và quy luật phát triển của cây với liều lượng rất thấp

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật chia làm hai nhóm chính là: các chất kích thích sinh

trưởng (Auxin, Giberelin, Xytokinin) và các chất ức chế sinh trưởng (acid absixic,Ethylen) (Hoàng Minh Tấn và ctv, 2006; Nguyễn Đức Lượng, 2008)

Chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô đóng vai trò quan trọng trong việcđiều chỉnh và khuyến khích quá trình phát triển của mô cấy Chất điều hòa sinh trưởng

đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý,

hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghỉ của thực vật đối với điều kiện củamôi trường (Bùi Trang Việt, 2002) Các chất điều hoà sinh trưởng thường được sử dungtrong nuôi cây mô dé tăng cường sự sinh trưởng, phát triển, và phân hóa cơ quan củacây là auxin và cytokinin Các chất này giúp tối ưu hóa điều kiện môi trường đề đạt đượchiệu suất tốt nhất trong quá trình nuôi cấy mô cụ thể Tuy vậy yêu cầu đối với nhữngchất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởngnội sinh của chúng.

2.2.6.1 Auxin và ảnh hướng của auxin

Auxin là một loại hormone sinh trưởng quan trọng trong thực vật, đóng vai tròquyết định trong nhiều khía cạnh của phát triển cây Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc

nhóm auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô: ơ-naphthaleneacetid acid (NAA),indole-3-acetic acid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dicholorophenoxyacetic acid (2,4-D) Trong đó IAA là auxin tự nhiên con NAA, IBA, 2,4-D là auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn Auxin có mặt ở các bộ phan của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non của cây.

Sử dụng loại và nông độ auxin trong môi trường cây phụ thuộc vào: kiêu tăng

trưởng hoặc phát triển của cây, hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy, sự tác động

qua lại giữa auxin ngoại sinh va auxin nội sinh, đặt tính của auxin.

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Đặc điểm chung củacác auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tínhnhư: tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phânhóa mạch dẫn Nói chung các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOHloãng (Razdan, 1994) Auxin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự sinh trưởngchéi ngon, gia tang kha nang hinh thanh hoa cua nhiéu loại cây trồng, đặc biệt là trêncác giống hoa kiểng (Saffari và ctv, 2004; Jiang va ctv, 2010)

2.2.6.2 Cytokinin và ảnh hưởng của cytokinin

Bao gồm các nhóm chất như 6-benzyladenine (BA), Kinetin (KI), Zeatin (ZEA)

Thidiazuron (TDZ) Cytokynin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cây mô

và làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, cytokynin có tác dụng kích thích sự

tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy Đối với dé tài này chỉ sử dụng

chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin là BA và Kinetin

Cytokinin có khả năng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ ở thực vật Vì vậy

mà cytokinin là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào Có hiệu quả này là do cytokininhoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và

rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chổi Sự cân

bang tỉ lệ giữa auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chổi) có ý nghĩa rất quyếtđịnh trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên câynguyên vẹn Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trìnhnảy cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin Trong một

tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có thể kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường

10

cytokynin cao hon auxin thì kích thích tạo chéi và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin

thì kích thích sự tạo rễ (Vũ Văn Vụ và ctv, 2015) Đề tăng hệ số nhân giống thì tăng

nông độ cytokinin trong môi trường nuôi cay ở giai đoạn tao chôi in vitro.

6-Benzyladenine (BA), công thức hóa học là C¡zH\¡Ns, có dạng bột kếttinh màu trắng, khó tan trong nước, tan ít trong ethyl alcohol và ôn định trong dung dịchaxit, kiềm BA là cytokinin được sử dụng nhiều nhất trong quá trình nhân nhanh chồi ở

các loài thực vật nuôi cấy mô Posada và cộng tác viên (1999) cho rằng nồng độ BA từ

0,1 - 3,0 mg/l là nồng độ đáp ứng nhân nhanh chdi tốt nhất các cây vi nhân giống TheoSardoei (2014), xử lý BA với nồng độ cao đã trì hoãn ảnh hưởng ưu thế ngọn bởi sự tác

động cua auxin, phá vỡ sự miên trang choi bên, gia tăng hình thành choi bên, chôi lá.

Kinetin (6-furfurylaminopuine) thường gọi là: Kinetin; N6-Furfuryladenine; furfuryl-Adenine; FAP Công thức hoa hoc CioHoNsO Chat này có mức độ hoạt độngsinh lý cao và có mặt rộng rãi trong tảo và hầu hết các loại thực vật Đây là một chất

N-điều hòa sinh trưởng tự nhiên được sản xuất bởi thực vật có tác dụng N-điều hòa đối với

sự phát triển của thực vật Kinetin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật dékích thích sự hình thành callus (mô sẹo) (kết hợp với auxin) và tái tạo các mô chồi từ

callus (có nồng độ auxin thấp hơn) Kinetin còn được áp dụng đánh thức chi ngủ

2.3 Các nghiên cứu khoa học liên quan

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Vào năm 2017, Nguyễn Văn Việt đã thực hiên nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

nuôi cay in vitro trong nhân giống Lan Hoàng Thao Vôi (Dendrobium cretaceumLindley) Kết quả nghiên cứu cho thấy, sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong

2 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường

MS, cho tỷ lệ mẫu sạch là 94,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thé chéi là 90% với thời gian phátsinh chéi 20 ngày Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường bé sung 0,5 mg/I BAP, 0,3 mg/lNAA, 0,3 mg/1 Kinetin, 100 ml/I dịch chiết khoai tây, 100 ml/I nước dừa, 30 g/l sucrose,

5 g/l agar cho hệ số nhân chéi cao nhất 12,3 sau 5 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ đạt 93,3%,

số rễ trung bình đạt 4,1 rễ/ cây và chiều dài rễ trung bình 3,6 cm khi nuôi trên môi trường

MS bồ sung 0,2 mg/1 IBA, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/I dịch chiết khoai tây, 20 g/l sucrosesau 5 tuân nuôi cây.

11

Vào năm 2019, Bui Thanh Binh và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu thành

phần hóa học của tinh dầu chúc (Citrus hystrix DC.) Thực hiện bằng phương phápchưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả phân tích thành phần hóa học của tỉnh dầu đượcxác định bằng phương pháp GC-MS cho thay tinh dầu vỏ chúc có từ 21 đến 22 hợp chattrong đó thành phần hóa học chính là các hợp chất B-pinene (34,8 - 36,6%), limonene

(19,88 - 20,39%), B-phellandrene (22,7 - 24,12%), citronella (7,01 - 7,29%), a-pinene

(3,55 - 4,05%) và terpinene-4-ol (0,59 - 1,15%) Tinh dau lá có hơn 10 hợp chất thìthành phần hóa học chủ yếu là Citronella (75,82 - 77,09%), Citronellol (13,03 - 15,50%)

và Linalool (2,62 - 2,85%) Hàm lượng tinh dầu của vỏ quả (3,8 - 5,45m1/100g) va lá(0.97 - 1,08m1/100g), cao hơn so với | vài nguyên liệu cùng họ.

Vào năm 2020, Khamphila đã thực hiện nghiên cứu về định lượng vitamin C vàphân lập hợp chất từ lá cây chanh chúc Kết quả cho thấy, định lượng của hàm lượngvitamin C trong lá (7,38 mg/100g) và quả chanh chúc (21,57 mg/100g) trồng tai tinhChampasack, miền Nam Lào Kết quả của nghiên cứu cho thấy cây chanh chúc chứa rấtnhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng cao trong cuộc sống

Mai Thanh Nga cùng cộng tác viên (2020) đã thực hiện nghiên cứu phân lập một

số hợp chất flavonoid từ lá cây chanh chúc thu hái tại tỉnh Champasack, miền nam Lào

Kết quả phân lập cho thấy từ cao chiết ethyl acetate của lá cây chanh chúc, thu hái tạitỉnh Champasack, miền Nam Lào, bằng phương pháp sắc kí cột, kết hợp với phươngpháp phổ hiện dai, đã phân lập và xác định được cấu trúc 2 hợp chat quercetin (KS1) vàmyricetin (KS2) Việc phân lập 2 hợp chat quercetin, myricetin góp phan khang địnhthêm những tác dụng dân gian đã được sử dụng của lá chanh chúc.

Vào năm 2020, Pham Thị Kim Phượng cùng cộng tac viên đã thực hiện đề tài

nghiên cứu thành phần hoá học tình dầu vỏ cam sành,chúc và chanh tây Bằng phương

pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và làm khan bởi NazSO¿ Sau đó sử dung phương phápsắc kí ghép khối phố GC - MS xác định được 43 cấu tử trong tinh dầu vỏ cam sành, 26hợp chat trong tinh dầu vỏ quả chanh chúc và 32 thành phan hoá học trong tinh dau vỏquả chanh tây Sau khi đối chiếu, nhóm tác giả nhận thấy chỉ số acid và ester của chúc

khá cao (4,208 và 21,038) trong khi đó cam và chanh tây lần lượt là (1,121 và 1,581)

(0,432 và 0,882) vi thế kha năng là chanh chúc chứa nhiều acid béo hơn

12

Vào năm 2021, Trần Thị Triêu Hà và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu xâydựng quy trình tái sinh chồi cây dua lưới in vitro từ các loại mô của cây dưa lưới mớinảy mầm Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian thích hợp để khử trùng hạt dưa lướibằng dung dịch H2O2 15% là 9 phút với tỷ lệ mẫu sạch là 80%, tỷ lệ hạt sống và sạchnay mam là 100% Mô lá, cuống lá và đốt thân của cây in vitro nảy mam từ hạt có khả

năng cảm ứng phát sinh hình thái cao hơn lá mầm, trụ dưới lá mầm và chồi đỉnh Môi

trường thích hợp dé tạo mô seo từ phiến lá và cuống lá là môi trường cơ bản có bổ sung0,3 mg/L NAA (naphthaleneacetic acid) hoặc 0,3 mg/L IBA (indole-3 butyric acid) với

tỷ lệ tạo mô sẹo đạt từ 80% - 100% Môi trường cơ bản có bổ sung 0,5 mg/L BAP

(6-benzylaminopurine) và 0,1 mg/L NAA là môi trường thích hợp nhất cho quá trình cảmứng tạo chồi từ mô seo, ty lệ tạo chdi là 100% với số chồi/mẫu là 4,3 chồi Môi trường

nuôi cấy cơ bản bé sung 0,6 mg/L BAP hoặc 0,3 mg/L kinetin là môi trường thích hopnhất đề tái sinh chồi trực tiếp từ đốt thân, ty lệ tạo chồi là 100%, số chdi tạo thành lần

lượt là 2,2 chồi/mẫu và 1,93 chồi/mẫu

2.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2015, Wee va cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu phát sinh in vitro

cua Citrus hystrix DC Đề thực hiện phát sinh chồi, mẫu được sử dụng ở nghiên cứu này

là những mẫu nút lá mam, lá mam, trụ dưới lá mầm và rễ được tách ra từ cây con sau 7tuần tuổi được nảy man trong ống nghiệm Các mẫu trên được cấy vào môi trường cobản có bồ sung 9 nồng độ BA khác nhau dé khảo sát sự ảnh hưởng của BA lên quá trình

phát sinh Kết quả của thí nghiệm trên cho thấy chỉ riêng BA là không đủ dé tạo ra sự

phát sinh chồi in vitro bình thường của C Hystrix vì có hiện tượng lão hoá của lá Dékhắc phục tình trạng trên, tiến hành thực hiện khảo sát phát sinh chồi với môi trường

MS chứa 2,22 uM BA và các nồng độ AgNO khác nhau Khao sát trên được theo dõighi nhận sau 8 tuần nuôi cấy, cho ra kết quả chứng minh rằng việc đưa bạc nitrat(AgNO:) ở mức 10,0 uM vào môi trường MS chứa 2,22 uM BA có thé khắc phục hiệuquả tình trạng lão hóa của lá và cải thiện khả năng phát sinh chdi từ các mẫu cấy khácnhau (nút lá mam, lá mầm, trụ dưới lá mầm và rễ) Sau đó, các chồi được tách ra riêng

lẻ khỏi cụm chồi và nuôi cấy trên môi trường MS được bồ sung sucrose trong ít nhất 2tháng (cấy chuyền hang tháng) nhằm giảm tác động lan truyền của BA từ môi trườngtrước Chéi có chiều cao 2 cm với 5 - 6 lá được sử dụng làm thí nghiệm tạo rễ Trong

13

thí nghiệm tạo rễ, Wee và cộng tác viên đã thực hiện khảo sát mẫu trên môi trường MS

có bổ sung nồng độ NAA khác nhau và môi trường MS có bồ sung nồng độ IBA khác

nhau Đồng thời thực hiện thêm khảo sát ra rễ, với phương pháp cấy mẫu chổi vào môitrường MS bồ sung nồng độ IBA khác nhau trong vòng 16 giờ sau đó cấy chuyền chúnglên môi trường MS bồ sung 20,0 uM AgNOa Cuối cùng là khảo sát cây con đã tạo rễ

với các điều kiện khác nhau khi ex vitro Kết qua cho thấy trong thí nghiệm tạo rễ, sự ra

rễ được cải thiện đáng kể khi chồi tiếp xúc với xử lý IBA ở mức 9,840 uM trong 16 giờtrước khi chuyển chúng trên môi trường MS bồ sung 20,0 uM AgNO: Đánh giá các

hỗn hợp bau đất khác nhau dé thích nghỉ với khí hậu cho thấy hỗn hợp được chọn là

thích hợp nhất là hỗn hợp đất mun: Peatgro: cát (1:1:1)

Vào năm 2020, Handayani và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu về tác dụng

của cytokines trong nuôi cay in vitro cây chanh chúc Hạt chanh chúc được bóc vỏ sau

đó được ngâm trong dung dịch sát trùng trong 20 phút Thao tác này lặp lại hai lần vàcuối cùng hạt được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó đem hạt đi bảo quản

tủ lạnh 1 tuần Hạt giống cần dé ráo nước trên giấy vô trùng trước khi sử dụng Hat vôtrùng được cắt thành hai phần và trồng trên môi trường được khảo sát (môi trường MS

có bổ sung 4 ppm BAP và môi trường MS) Lọ nuôi cay cần được bảo quản theo đúngquy trình Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc bỗ sung 4 ppm BAP trong môi trường

MS ảnh hưởng đến sự phát triển của hạt chanh chúc in vitro Hạt chanh chúc được bổsung 4 ppm BAP phát triển nhanh hơn với tốc độ phát triển chdi, số lượng chồi và số lánhiều hơn so với hạt không có BAP

14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 tại phòng thínghiệm nuôi cấy mô chi nhánh Công ty Cổ phan Công nghệ Sinh học TPEco, số 178A

đường Nguyễn Ai Quốc, Thành phố Biên Hòa, tinh Đồng Nai

3.2 Vat liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây chanh chúc (Citrus hystrix DC.) Cây chanh chúcsau khi mua tại nhà vườn sẽ được đưa về trồng và chăm sóc tại nhà lưới của chi nhánhCông ty Cổ phần Công nghệ Sinh học TPEco Sau hai tuần chăm sóc và phun thuốc thìchọn cây dang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, không có biểu hiện bệnh

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Các trang máy móc thiết bị phục vụ cho quá trình thực hiện đề tài: nồi hấp tiệttrùng (dùng dé tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm, môi trường nuôi cấy 6 121°C, áp suất1,2 atm), tủ cay vô trùng (để thực hiện các thao tác cây và vô mau), cân kỹ thuật, máy

đo pH, máy cất nước, tủ lạnh, máy khuấy từ, đèn huỳnh quang Các dụng cụ trong tủcấy như hộp gia nhiệt, dao cấy, đĩa cấy, đèn cồn, bình xịt cồn, giấy cấy, kéo, pence, hũnhựa, bông gòn được hấp tiệt trùng trước khi sử dụng Các dụng cụ hỗ trợ công việc phamôi trường nuôi cay như ống hút, ống đong, bình tam giác, phéu becher, pipette thủytinh, đũa thủy tinh, muỗng, vá Các thiết bị lưu trữ mẫu cấy: máy điều hòa nhiệt độ, đènleb nuôi cấy, kệ nuôi cấy.

3.2.3 Hoa chất và môi trường

Các hóa chất dùng cho quy trình khử trùng mẫu gồm cồn 70° dé lắc mau, dungdich Javen thương mại (chứa 5% NaClO), cồn 90°, HgCl2 0,1%, Tween 80, khang sinh(tetracyclin + amoxycilin + ampicillin với ty lệ 1:1:1) Ngoài ra còn có các chất điều hoàsinh trưởng thực vật gồm Kinetin (6-Furfurylaminopurine), 6-Benzyladenine (BA)

Môi trường MS cơ bản (Muraskige va Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/l đường, 5,2

g/l agar Tùy thuộc vào từng thí nghiệm sẽ bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực

15

vật khác nhau Môi trường được chứa trong ống nghiệm hoặc bình nhựa Thẻ tích môi

trường nuôi cấy trong bình nuôi cấy là 30 - 35 ml/bình Giá trị pH của môi trường nuôi

cấy trước khi khử trùng là 5,7 - 5,8 Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ121°C, áp suất 1,2 atm trong 18 phút

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Myo-Inositol 100

Vitamine

Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCI 0,50 Thiamine-HCl 0,10

16

3.2.4 Điêu kiện nuôi cay

Mẫu sau khi được cấy vào môi trường khảo sát tuỳ thuộc vào từng nghiệm thức

phải được nuôi cấy trong điều kiện môi trường thích hợp Đầu tiêu về thời gian chiếusáng trung bình thích hợp trong ngày là khoảng từ 16 đến 18 giờ với cường độ chiếu

sáng thích hợp là 15 W/m?/s, sử dụng đèn led dé cung cấp ánh sáng thiết yếu cho câynuôi cay mô (cây) Day là hai yếu tố quan trọng đối với sự tăng trưởng và tích luỹ các

hop chất thứ cấp của thực vật nuôi cấy in vitro Ngoài ra nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

thường giao động từ 25 - 28°C dé tốt cho sự phát triển, để luôn đảm bảo được là nhiệt

độ trong phòng trữ mẫu luôn duy trì ở mức thích hợp cần phải sử dụng máy điều hoàkhông khí Độ âm trung bình từ 60 - 80% sẽ phù hợp nhất dé mẫu không bị mat nướctrong quá trình nuôi cấy, dé điều chỉnh được độ âm trong không khí thì dùng quạt hút.3.3 Phuong pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Javen trên mẫu

Mục tiêu thí nghiệm: xác định thời gian phù hợp đề sử dụng chất khử trùng dung

dịch Javen trong quá trình vô mẫu

Cách tiến hành: đầu tiên, từ những cây mẹ được chăm sóc tại vườn lưới tai chinhánh Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học TPEco, số 178A đường Nguyễn Ái Quốc,

Thành phó Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai Chọn những mẫu đốt thân đang ở giai đoạn sinh

trưởng mạnh từ cây mẹ khoẻ không có biểu hiện bệnh trên cuống, lá, thân dé tiến hànhquy trình vô mẫu Dung dịch Javen được sử dụng ở nội dung này là dung dịch Javenthương mại (chứa 5% NaC]O).

Quy trình khử trùng mẫu bên ngoài tủ cấy: cắt bớt lá và gai trên đốt thân cây Sau

đó, rửa theo chiều doc của đốt thân dưới vòi nước chảy nhẹ bằng bông gòn và xà phòngsunlight pha loãng 5% (vệ sinh sạch sẽ, nhẹ nhàng tránh làm tôn thương mau, chú ýphần nách lá) Ngâm mẫu với dung dịch xà phòng sunlight pha loãng 2% trong 10 phút

Lặp lại bước rửa và ngâm mẫu với dung dịch xà phòng Sau đó tia đưới vòi nước chảy

và khử trùng bề mặt với cồn 70° Rồi dem mẫu vào tủ cay thực hiện thao tác tiếp theo

Mẫu cấy được lắc qua cồn 70° trong 1 phút, rửa lại 3 lần bằng nước vô trùng, mỗilần 3 phút Sau đó, mẫu cấy được lắc đều với dung dịch khử trùng HgCl, 0,1% (được bổ

sung 0,5 ml Tween 80) trong thời gian 4 phút, và rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng, mỗi

17

lần 5 phút Tiếp đến mẫu cấy được lắc đều với dung dịch Javen 20% (được bồ sung 0,5 ml

Tween 80) trong khoảng thời gian tối ưu nhất khảo sát được ở nội dung 1 và rửa lại 3 lần

với nước cat vô trùng Sau cùng ta đôi mẫu sang hũ được hap vô trùng rồi khử trùng bằng

2 lần kháng sinh với nồng độ 200 mg/l lắc trong thời gian lần lượt là 20 phút va 15 phút,sau mỗi lần kháng sinh rửa lại 3 lần bằng nước vô trùng Mẫu cấy được loại bỏ những

phần hư hại, bị dập sau đó mẫu sẽ được sử dụng để bồ trí các nghiệm thức

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thứclặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mẫu Tổng số mau thí nghiệm là 105 mẫu Theo dõi và ghi nhậnchỉ tiêu sau 7 ngày nuôi cay.

Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Javen

Nghiệm thức Môi trường Thời gian (phút)

AI MS 5 A2 MS 10 A3 MS 15 A4 MS 20

AS MS 25 Cac chi tiêu theo dõi sau 7 ngày:

- 3, Tống số mau của nghiệm thức

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng phát sinh choi

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ phù hợp của chất điều hòa sinh trưởngKinetin trong quá trình phát sinh chdi

Cách tiến hành: sau khi hoàn thành quy trình vô mẫu thì cấy mẫu đốt thân câychanh chúc được cấy trong môi trường MS cơ bản có bé sung chất điều hòa sinh trưởngKinetin ở các nồng độ dao động từ 0,0 - 1,2 mg/l Quan sát và ghi nhận chỉ tiêu ở cácmẫu sống sạch Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố với 5 nghiệm thức, mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm là 105 mẫu Theo dõi

18

và phi nhận các chỉ tiêu sau 2, 4, 6 tuân nuôi cây.

Bang 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình phát sinh chồi

Nghiệm thức Môi trường Kinetin (mg/l) Số mau (mau/LLL)

Chỉ tiêu theo dõi:

* Tổng số mẫu cấy tạo chồi

Tý lệ phát sinh chồi (%) = x 100% (Tính những mẫu có hiện

3 Tổng số mau của nghiệm thức

tượng xuất hiện chdi ở bề mặt)

Số chồi/mẫu phát sinh: chỉ tính những chỗi có chiều cao 1 mm trở lên

)= Tổng số chiều cao của chồi phát sinh

Chéu cao trung bình của chồi (em (Đo những chồi

3 Tổng số mau của nghiệm thức

có kích thước I mm trở lên).

Tổng số lá của chồi phát sinh

Số lá trung bình = (Chỉ tính những lá mở hoàn chỉnh trên

3 Tổng số mau của nghiệm thức

chồi, trên bề mặt thạch)

Ngày phát sinh chồi (ngày): thời gian mẫu bắt đầu xuất hiện chdi

Tình trạng mẫu: mau sắc, hình dang chdi, lá

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát sinh chéi

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA thích hợpcho sự sinh trưởng chéi trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Cách tiến hành: sau khi hoàn thành quy trình vô mẫu thì cấy mẫu đốt thân cây

chanh chúc được cấy trong môi trường MS cơ bản có bé sung chất điều hòa sinh trưởng

BA ở các nồng độ dao động từ 0,0 — 2,0 mg/1 Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn yếu

tố với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mau Tổng số mẫu thínghiệm là 105 mẫu Theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu sau 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy

19

Bang 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến quá trình phát sinh chéi

Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Số mẫu (mẫu/LLL)

Chỉ tiêu theo dõi:

Tổng số mẫu cấy tạo chồi

Ty lệ phát sinh chỗồi (%) = x 100% (Tính những mẫu có

Ð Tổng số mau của nghiệm thức

hiện tượng xuât hiện chôi ở bê mặt).

Tổng số chồi phát sinh

Số chồi trung bình (chéi) = (Chi tính những chổi có chiều

3› Tổng số mẫu của nghiệm thức

cao l mm trở lên).

š 4 h Vẻ Tổng số chiều cao của chồi phát sinh Nà Ấy

Chéu cao trung bình cua choi (cm) = » = —=— m ` - (Đo những chôi

3; Tổng số mau của nghiệm thức

có kích thước 1 mm trở lên).

Tổng số lá của chồi phát sinh

Số lá trung bình (1a) = (Chỉ tính những lá mở hoàn chỉnh trên

3 Tổng số mẫu của nghiệm thức

chéi, trên bề mặt thạch)

Tình trạng mẫu: màu sắc, hình dạng chôi, lá

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập được sẽ được xử lý thống kê trên máy tính bằng phần mềm Excel

và phân tích ANOVA đơn yếu tố bằng phan mềm MINITAB 16.2.4 Đọc kết qua dựavào bảng ANOVA, phương pháp Turkey multiple range test, bảng trung bình và bảng

so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức.

20

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tác động của thời gian khử trùng dung dịch Javen trong quá trình vô mẫu

Trong nuôi cấy mô thực vật, bước xử lí mẫu đặc biệt quan trọng quyết địnhđến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều

kiện vô trùng Vì nếu khoảng thời gian quá ngắn thì chưa đủ dé khử trùng mẫu, mẫuđược cấy vào môi trường dễ sinh ra nam và khuẩn khiến cây không phát triển được vàchết Còn nếu khoảng thời gian ngâm dung dịch Javen quá dai thì hoạt tính khử trùngcủa dung dịch Javen cây sẽ có thể bị bào mòn và chết, các vết cắt lúc xử lý mẫu tạo cơhội cho sodium hypochlorite có trong dung dịch Javen thấm vào bên trong mẫu gây độc

cho tế bào và có thể gây chết mẫu Vì vậy, cần xác định khoảng thời gian sử dụng Javentrong quy trình vô mẫu dé đạt được tỷ lệ mẫu cay sach song tối ưu nhất Vô trùng ban

đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định, tuy vậy nếu tìm đượcnông độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao

Hoá chất được chọn dé khảo sát trong quy trình vô mẫu của đề tài này là dung

dịch Javen thương mại chứa 5% NaClO được pha loãng thành dung dịch Javen NaClO

1% Dung dịch Javen là chat tây rửa có tính thông dung, dé mua, giá thành rẻ phù hopvới nuôi cấy mô sản xuất Ở thí nghiệm nay, vật liệu là mẫu đốt thân cây chanh chúc

Cây mẹ phải đạt tiêu chuẩn sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh Nội dung

1 nhằm tìm ra thời gian sử dung chất khử trùng tối ưu nhất trong quy trình vô mẫu đốt

thân dé tạo ra một nguồn mẫu sông sạch.

21

Sau khi hoàn thành quy trình khử trùng mẫu theo nghiệm thức đã bố trí thì mẫu

được cấy vào ống nghiệm riêng lẻ chứa môi trường MS và được quan sát trong vòng 7

ngày Thu được kết quả như sau:

Bảng 4.1 Các chỉ tiêu theo dõi mẫu đốt thân cây chanh chúc sau 7 ngày quan sát

Nghiệm Thờigian Tỷ lệmầunhiễm Tỷ lệmẫusạch Ty lệ mẫu sống sạch

Các giá trị trung bình trong cùng mội cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thong kê p < 0,01 Các số liệu % được chuyển đổi theo công thức aresin(x)!2 trước khi xử lý

thống kê.

Qua 7 ngày quan sát mẫu, có thé thay ty lệ mẫu sạch của cả hai nghiệm thức (Al

và A2) đều quá thấp AI là 4,76% và A2 là 23,81%, chỉ số này cho thấy khoảng thờigian 5 và 10 phút là quá ngắn, không đủ để mẫu cấy được vô trùng Sau vài ngày cấyvào môi trường, mau có hiện tượng xuất hiện các khuẩn lạc và nam Vi thế tỷ lệ mẫu

nhiễm ở hai nghiệm thức này cao với A1 nhiễm 95,24% và A2 nhiễm 76,19%

Đến kết quả của nghiệm thức A3, có thê thây tỷ lệ mẫu nhiễm đã được giảm đáng

kế (28,57%) và tỷ lệ mẫu sạch tăng (71,43%) Ở nghiệm thức này còn có xuất hiện của

sự chênh lệch của tỷ lệ sống sạch và tỷ lệ sạch, điều đó nghĩa là có xuất hiện mẫu bị ănmòn trong quá trình vô mẫu Chênh lệch giữa hai chỉ tiêu theo doi nay không đáng kể

Đối với nghiệm thức A4 cho thấy khoảng thời gian 20 phút là khoảng thời giantối ưu nhất để xử dụng dung dịch khử trùng Javen trong quá trình khử trùng mẫu cấy.Nghiệm thức mang lại kết quả tối ưu với tỷ số mẫu sông sạch là 85,71% va tỷ lệ mẫunhiễm giảm chỉ còn 4,76% Ở nghiệm thức này vẫn xuất hiện hiện tượng mẫu bị ăn mònnhưng chỉ số chênh lệch vẫn không đáng kế (9,53%)

22

Ở nghiệm thức A5 thì tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ còn 0% và mẫu sạch là 100% Tuy

nhiên tỷ số mẫu sống sạch chỉ có 66,67% Điều này cho thấy việc sử dụng dung dịchkhử trùng Javen với nồng độ 20% ở 25 phút mẫu có thể bị bào mòn và chết do các vết

cắt lúc xử lý mau tạo cơ hội cho sodium hypochlorite có trong dung dịch Javen thấm

vào bên trong mau.

Tóm lại, khi khoảng thời gian khử trùng bằng dung địch Javen quá ít thì khả năng

khử trùng mẫu cấy sẽ không cao, mẫu dễ bị nhiễm khuẩn và nắm (AI và A2) Ngượclại, néu tăng thời gian khử trùng lên thì sẽ xuất hiện hiện tượng mẫu bị chết sạch (A3,

A4, A5) Nhưng nếu so sách các tỷ lệ với nhau thì ta có thé thấy khoảng thời gian khửtrùng bằng dung dịch Javen mang lại hiệu suất tối ưu nhất cho quy trình vô mẫu đốt thâncây chanh chúc là 20 phút (A4) Cây khi được khảo sát tuy có tỷ lệ mẫu bị ăn mòn nhưng

tỷ lệ mẫu sạch là 95,24% va tỷ lệ mẫu sống sạch là 85,71%

Kết quả này trùng khớp với Nguyễn Văn Việt (2017), Nguyễn Văn Việt khửtrùng vỏ quả Lan Hoàng Thảo Vôi rồi tách vỏ quả lấy hạt rải lên môi trường nuôi cấy

Kết quả cho thấy khoảng thời gian phù hợp dé sử dụng dung dịch NaCIO 6% là 20 phút,

tỷ lệ mẫu sạch là 91,5% cùng tỷ lệ hat nảy man sau 20 ngày là 86,7% Tuy có khoảng

thời gian xử lý bang dung địch NaCIO đều là 20 phút nhưng nồng độ của dung dịch khử

trùng ở hai thí nghiệm này là khác nhau Cho thấy ngoài thời gian khử trùng thì nồng độchất khử trùng cũng ảnh hưởng đến hiệu xuất khử trùng Nồng độ này còn phụ thuộcvào mẫu khử trùng và mục tiêu sử dụng mẫu Ngoài ra còn phải xét đến tất các bướckhử trùng khác của tong thé quy trình vô mẫu dé có được một quy trình phù hợp với

mau cân khử trùng.

Mẫu nhiễm khuẩn

Hình 4.2 Mẫu cấy không đạt chuẩn sau 7 ngày quan sát

23

Hình 4.3 Mẫu sống sạch.

4.2 Tác động của Kinetin đến khả năng phát sinh chồi

Kinetin là 1 trong 3 loại cytokinin chính thường được sử dụng trong nuôi cay môthực vật Là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử 6-(2-furfuryl)-anminopurin Tác dụng chính của Kinetin là kích thích sự phát sinh chồi mô nuôi cấy

Dưới đây là kết quả quan sát sự phát triển của mẫu đốt thân cây chanh chúc khisau khi trải qua quá trình khử trùng và được đưa vào nuôi cấy trong môi trường MSđược bồ sung chất điều hoà sinh trưởng Kinetin sau 2 tuần

Bảng 4.2 Các chỉ tiêu theo dõi chỗồi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy

Số chồi/mẫu

m la Ngày phát sinh chéi phat sinh Ty lệ pout sinh

g/l) (ngay) (chằihnầu chôi (%)

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thống kê p < 0,05 Số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức arcsin(x)!” trước khi xử lý

thống kê

Sau 2 tuần quan sát, mẫu đã có sự xuất hiện của chồi phát sinh Tỷ lệ phát sinhcủa nghiệm thức có hiệu suất khá Tỷ lệ phát sinh của các nghiệm thức có chênh lệch

24

nhau nhưng không quá nhiều Cao nhất là môi trường MS bồ sung 0,6 mg/1 Kinetin với

tỷ lệ phát sinh chồi là 66,67%, đây cũng là nghiệm thức ngày phát sinh chồi sớm (6

ngày) Nghiệm thức được ghi nhận là có ngày phát sinh chdi trễ nhất là DC (9 ngày) Sốch6i/mau phát sinh của các nghiệm thức đều chỉ có 1 chồi/mẫu Tiếp tục quan sát và ghi

nhận thêm chỉ tiêu chiều cao và số lá trung bình cũng như trạng thái chồi mới phát sinh

Bang 4.3 Chiều cao trung bình (cm) và số lá trung bình (lá) sau 2 tuần nuôi cấy

Nghiệmthức Kinetin(mg/) Chiều cao trungbình(em) Số lá trung bình (lá)

Hình 4.4 Chồi phát sinh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có bồ sung Kinetin

Môi trường MS bồ sung 0,6 mg/1 Kinetin với kết quả chiều cao trung bình (0,19cm) và số lá trung bình (1,14 lá) tối ưu hơn so với các nghiệm thức còn lại Kết quả số

liệu cua hai chỉ tiêu theo dõi ở bảng 4.3 giữa nghiệm thức DC và BI cũng như B3 và B4

25