Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát phương pháp khử trùng và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo sẹo và rễ cây bảy lá một hoa (Paris vietnamensis H.Li)

Hồ Chí Minh, xin cam đoan đề tài: “Khảo sát phương pháp khử trùng và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo seo và rễ cây bay lá một hoa Paris vietnamensis H.Li là do chính t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VÀ

ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG DEN

SU TAO SEO VA RE CAY BAY LA MOT HOA

(Paris vietnamensis H.Li)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VÀ

ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRƯỞNG DEN

SU TAO SEO VA RE CAY BAY LA MOT HOA

(Paris vietnamensis H.Li)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN VŨ PHONG PHẠM VĂN NAM

KS ĐẶNG HUỲNH THÚY VY

TP Thủ đức, 03/2023

sở vật chất và luôn động viên tinh thần lúc em gặp khó khăn, vì thế mà em mới hoànthành khóa luận tốt nghiệp một cách chỉnh chu và tốt nhất.

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn đến tập thé anh chị, em, bạn bè phòng BIO 301, đặcbiệt là KS Đặng Huỳnh Thúy Vy đã giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý và động viên tinh thầnxuyên suốt quá trình em thực hiện khóa luận

Cảm ơn mẹ người luôn theo dõi, hỗ trợ, động viên và an ủi con trong suốt quảng đường

con trưởng thành, mẹ là chỗ dựa vững chắc giúp con vượt qua những khó khăng rào cảntrong cuộc sống, me là một động lực to lớn dé con phan dau và nồ lực hết mình trên

đường đời.

Lời cảm ơn cuối cùng em gửi đến tất cả mọi người đã giành những điều hoàn hảo, tốt

đẹp nhất giành cho em, em xin chân thành cảm ơn !

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên là Pham Văn Nam, MSSV: 18126099, Lop: DH18SHD thuộc ngành Côngnghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan đề tài:

“Khảo sát phương pháp khử trùng và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự

tạo seo và rễ cây bay lá một hoa (Paris vietnamensis H.Li) là do chính tôi thực hiện, nội

dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này là hoàn toàn trung thực

Tp Hồ Chi Minh, ngày 11 tháng 03 năm 2023

Người viet cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

H

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định điều kiện khử trùng và ảnh hưởngcủa chất điều hòa sinh trưởng thích hợp đến sự tạo sẹo và rễ cây bay lá một hoa (Parisvietnamensis (Takht.) H.Li) Các loại mẫu được khử trùng là các mẫu lá được cắt bỏphần cuốn lá, mẫu thân được cắt đoạn 5 em, mẫu củ được cắt sạch rễ Đối với mẫu thâncây bảy lá một hoa khử trùng bằng HgCla 0,2% trong thời gian 9 phút cho tỉ lệ mẫu thânsống sạch cao nhất 5§,3% sau một tuần Đối với mẫu củ cây bảy lá một hoa khử trùngbằng HgCl 0,2% trong thời gian 16 phút đạt tỉ lệ mẫu củ sống sạch cao nhất 93,3%.Mau lá chưa phải là vật liệu lí tưởng dé bat đầu quy trình nhân giống in vitro, đa số mẫuđều chết sau quá trình khử trùng Lat cắt mẫu củ tạo sẹo trên môi trường MS có bổ sung0,5 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L TDZ ghi nhận tỉ lệ tạo sẹo là 8,3% sau 8 tuần theo dõi Latcắt mẫu củ chưa thé tạo seo hay tạo rễ trên các môi trường bồ sung riêng lẻ các chất điều

hòa sinh trưởng 2,4-D (0,5; 1,0; 1,5 mg/L); NAA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/L) hoặc

IBA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/L) Mau củ trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5

mg/L đạt tỉ lệ tạo rễ là 8,3% Lát cắt mẫu thân hóa nâu, nhũn, chết sau quá trình theo dõi

trong l6 tuần.

Từ khóa: Mô seo, Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, in vitro, rễ bat định

ll

The aim of this study was to determine the sterilization conditions as well as the effect of plant growth regulators on the callus formation and rooting of Paris

vietnamensis (Takht.) H.Li Leaf explants with leaf curls removed, stems cutted into

5 cm segments and tuber with roots removed were being to sterilized After one week

of follow-up, the highest percentage of sterilized explants was obtained at 58.3% when immersed stem in HgCl: solution for 9 minutes Sterilization with 0.2% HgC]¿ for 16 minutes yielded the highest percentage of clean-live tubers (93.3%) Leaf specimens were not ideal starting materials for in vitro propagation because the majority of them die after sterilization In the next experiment, after 8 weeks, the ratio of callus formation was 8.3% in the slicing of tubers cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 0.2 mg/L TDZ Tuber slices were unable to callus or root firming on the culture medium supplemented with 2,4-D (0.5; 1.0; 1.5 mg/L); NAA (0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 mg/L); or IBA (0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 mg/L), individually About rooting ability, tubers explants cultured on MS medium added with 0.5 mg/L NAA stimulated root formation at 8.3% On the other hand, after 16 weeks of observation, slicing of stem sample turned to brown, mushy, and died gradually.

Key words: Callus, Paris vietnamensis (Takht.) H.L1, in vitro, root hair

IV

MỤC LỤC

TrangLỜI CẢM ƠN 52-22 22222221221221221221221212212121212121111212112121212112122122 xe i

XÁC NHAN VA CAM ĐOAN -©22-22222222122112212211221271211211211211221211 211 xe ii

TOM TẮTT 22-22-52 22122122212212512212211211221121121112112111112112112112111112111121111 1 re iiiABSTRACT oo ccccssscssesssessesssessesssessessessssssessustssiesssssssssnessetinsssessessusssesssssesiessesiesseseveeses iv

WO OG ccstrrcecreccenrs 0100019: 0619:661340004000.004d16x6L4Gi110n/808080xA0100iG3800008g0auai vDANH SÁCH CAC CHU VIET TAT oo ccsccsscsssessesssessesssessesseessessesssessessessessesneeseeaven viiDANH SÁCH CAC BẢNG 52-222 2122212212211211221121121121121121121122121 1e viiiTANH BÁCH GÁE BITING ccc canssnsscncsnssatactinennsanstannancahieseSesinesiatnnstnucnanabhcsnnensooneesdansnninnne ix

CHUONG 1 MỞ DAU oo.oeocco csc csscsscssesssseesessesssssessessssssnssssssstssessestssesiesstsasatssesaeesees |

Na ca 11.2 Mục tiêu đề tài - 5-52 223223211 25221211212212112121121121212112121211212222122122 2e |

1.3 020i ii Sẽ 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-22 522E+2E+2E£EezEezEersersersrrrrserere-e.3

2.L Tổng quan về by lá ruột tira — a onncenssnnennnnnneeanennannarsneaneeneannesnsnnsonagansanannsenaes 3

OD AN coll LRA OVA psec eve ss sistaidas cease pm oir crema eae exces3.1.2 Đặc điểm hình thái vã sinh trerOAg seccccecseussenssnssiwennecrssenssavencsonivansereerneaivonearcemoneedl) nh Ă 42.1.4 Thành phần hóa học -2- 2° 25s SE+SE92E92E9EE92E92121121221121121121121121121121121 22 c0, 5Dold LAC Unie COC ƒsisnsiresesebesnEbittydisgLu32M4050350:14808034E2381cẸ3EuSfexÄlSgtgitu3esassassissssni 62.1.6 Những bai thuốc quy o c cccececececsesessesseessessessesssseseeseesstssesessietiesessiessessseseeesneesees 72.2 Tổng quan nuôi cấy mô tế bào thực vật 22 2222+22++22++2E++2z+zzxrzzxrzrrez *20s; NATTY psssresoaesoseseleesoooiltstcggx200AS010200-SXSEEEVSSEg:SiP4S93243ÿ5øos9 đ9y4ig0gSsf2togoostlinozosrfibetrcgtysôoirdi 72.2.2 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo vật liệu khởi dau eee 92.2.3 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình tao sẹo và rễ bat định 2-52 112.2.4 Vai trò của của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật -2-5- 112.2.5 Kĩ thuật nuôi cấy tế bào lớp mỏng -22-©222222+2222222EE2EEEzEEEEzEErrrrrrrer 132.2.6 Những nghiên cứu in vitro về cây bay lá một hoa -2-55255252225+22 13CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2- 22 2222++2222+22z+zzzz+ 153.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 22+222222222E+22E+22E2221222122212222222 e2 1530w WALI HE H1EÌJOUörssaonoesbtonatibagibtg S2 4Go.ESSGSISEBE-BGRDSSSEEGHSSSSGSDSBRSPISGUGH.SBSHIIGIEH4GS5389800 15

3.2.1 NguOm mau 4 153.2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy -22- 2 2222222E22E222122122212212222222ee2 163.2.3 Thiét bi (cố 16

3.5› Phương;PhẩPp:nghIỂH'GỮI: oscceeseeeeiissecdginbstsEinbres28120E0410185E6388G0-5000-1650/299SE5-80/06 80008 163.3.1 Khao sat điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá và mẫu củ câybay lá một hoa dé tạo vật liệu khởi đâu - ¿2 222 2222132212221 EEErrrkrre 163.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo sẹo và tạo rễ

từ thân và củ cây bảy là một HOA ssscssscesssswsssasnssxesssercenssesressaersrescenreowssesssnvensecesseesasiens 193.4 Xử lý thống kê ¿- 2 222222221222122121122121121121121122121121121121121221121 1c ee 20

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -©2-22222E22E22EE22E22EE222222.Exee 21

4.1 Khảo sát điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá và mẫu củ câybay là Tiốt.Hoa.để tag vật Hiệu KHÔI TR::sssásssiiioeceggssgi160G01583934624EHIASEESSIĐGREHESĐkiBRESCGiSORE 214.2 Anh huong cua chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo sẹo và tạo rễ từ thân và

CU 6ây bay lá triệt HOS suesnnndid608114184515863358339338858933546E843ESE14SLEXSESSEESSESS38184840833581834 27

CHUONG 5 KET LUẬN VA ĐỀ NGHỊ - 2 2+S+E2E2E121125121121121121222 Xe 32

5.2 DG J1 6 -+ 1 32

TÀI LIEU KHAM KHẢO - 5 2-52SSE‡EE2E£EE£EE2EEEEEEEEEEEEE112112111211111111 1111 te 33

vi

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

Ctv : Cộng tác viên

MS : Murashige and Skoog, 1962

NAA : o-Naphathalene acetic acid

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBang 3.1 Bồ trí thí nghiệm khử trùng mau thân, lá và củ bằng javel 17Bang 3.2 Bồ trí thí nghiệm khử trùng mẫu thân, lá và củ bằng HgC1: 18Bảng 3.3 Nong độ các chất điều hòa sinh trưởng bô sung vào môi trường cảm ứng tạo

SCO VA CAO LE n 19

Bang 4.1 Ảnh hưởng của nông độ javel và thời gian xử lí đến hiệu qua khử trùng mẫuthân, là Vũ LŨ G0655 Giới đế VI 20004 22Bang 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ HgCh va thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùngmẫu thân cây bay lá một hoa sau 7 ngày theo đõi 2-52 22522S+2z2£22E2+z2zzzzsx2 23Bang 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ HgCh và thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùng

mẫu củ cây bay lá một hoa sau 7 ngày theo đõi 2-5 55 2scccrxrrerrerrrrrrxrree 25

Bang 4.4 Ti lệ hình thành mô sẹo và rễ từ lát cắt củ cây bảy lá một hoa sau 8 tuan 27

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Cây bay lá một hoa được sử dụng trong nghiên cứu - 15Hình 4.1 Kết quả khử trùng mẫu lá cây bảy lá một hoa sau 7 ngày theo dõi 2ÓHình 4.2 Kết quả khử trùng mẫu thân cây bảy lá một hoa sau 7 ngày theo dõi (bar =Oe) 1Đ:6/2R.73Đg0gH3T2BH2LJdmỹ5GìjSEEdS82i2Ngn92 26Hình 4.3 Kết quả khử trùng mẫu củ cây bay lá một hoa sau 7 ngày theo dõi (bar = 1

Hình 4.4 Lat cắt mẫu củ cây bay lá một hoa trên các môi trường nghiệm thức 30Hình 4.5 Lat cắt mẫu thân cây bảy lá một hoa trên các môi trường nghiệm thức sau 8,i81 8 2 ÿÿ›»››°>›>ddadă.:

IX

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bay lá một hoa (Paris vietnamensis (Takht.) H.L1) loại dược liệu quý được sử dụnglàm thuốc trong y học cô truyền có chứa thành phần hóa học chính là Saponin steroid vaPolyphyllin là hợp chất quý Thành phần dược tính có trong cây (Parisvietnamensis (Takht) H Li) đã được chứng minh có các tác dụng như giảm đau chốngviêm, cầm máu, điều hòa miễn dịch, chữa rắn độc cắn và đặt biệt là ức chế sự phát triểncủa khối u Bởi vì tác dụng dược lý vô cùng quý của nó mà nhu cầu sử dụng cây bảy lámột hoa ngày càng cao, người dân ở các vùng dược liệu này đã khai thác ráo riết, làmcho số lượng dược liệu này giảm đi một cách nhanh chống và đáng kể trong tự nhiên

Trong khi đó, quan thé loài này có những đặc điềm sinh thái khá phức tạp, quá trình sinh

trưởng và phát triển trong môi trường tự nhiên lâu đài, tỉ lệ phát tán hạt giống và nảymam của cây rất thấp và khó thuần dưỡng khi rời khỏi môi trường tự nhiên vốn có của

nó Việc nhân giống chủ yếu bằng cách ươm hạt và giâm củ có mắt ngủ, tuy nhiên tỉ lệnảy mam thấp dẫn đến khó trồng trong điều kiện vườn ươm Trong khi nhiều loại sâm

có giá trị kinh tế đã được trồng trong vườn ươm để phục vụ cho việc khai thác dược liệuthì cây bảy lá một hoa vẫn dựa hoàn toàn vào số lượng trong tự nhiên, chưa có nhà vườnnào trồng thành công loài này Cùng với việc bị khai thác quá mức quan thé loài đượcliệu này đang đứng trên bờ vực có nguy cơ dẫn đến tuyệt chủng Thế nên cần phải cócác biện pháp duy trì, bảo vệ và khai thác, phát triển hiệu quả, bền vững quan thé này ởViệt Nam là điều cấp thiết

Hiện nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu nhân giống loài cây này Các nghiêncứu chỉ dừng lại ở việc xác định các hoạt chất có trong cây bảy lá một hoa (Đỗ Tắt Lợi,2004; Zhang J và ctv, 2012; Tang Ly va ctv, 2014) Vì thế mà đề tài này được thực hiệnnhằm khảo sát điều kiện khử trùng và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thíchhợp đến sự tạo sẹo và rễ từ lát thân, củ cây bảy lá một hoa

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định điều kiện khử trùng và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thíchhợp đến sự tạo sẹo và rễ cây bảy lá một hoa

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá vàmẫu củ cây bảy lá một hoa để tạo vật liệu khởi đầu

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo

sẹo và tạo rễ từ thân và củ cây bảy lá một hoa.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về bảy lá một hoa

2.1.1 Phần loại

Bay lá một hoa có tên khoa học là Paris vietnamensis (Takht.) H.Li Hay tên đồngdanh là Daiswa hainanensis subsp Vietnamensis (Takht.) Bảy lá một hoa được miêu tảkhoa học đầu tiên năm 1984 (Takht H.Li, 2010) Bay lá một hoa là một loại cây thuộcchi Paris (chi trong lấu), họ hắc được hoa hay họ lê lô (Melanthiaceae), trong dân gian

nó còn được gọi là Thất Diệp Nhat Chi Hoa, Thiết Dang Dai, Chi Hoa Dau, Tảo Hữu,

Thỏa Hà Xa, Thất tử liên v.v

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (divisio) : Angiospermae

Lớp (class) : Monocots

Bộ (ordo) : Liliales

Ho (familia) : Melanthiaceae

Chi (genus) : Paris

Loai (species) : Paris vietnamensis

2.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng

Bảy lá một hoa là một loại thân thảo nhỏ, có hình dạng rất đặc biệt, sống lâu năm

củ thường dài khoảng 5 - 15 cm, đường kính khoảng 2,5 cm rất nhiều đốt Thân thang

đứng cao khoảng 25 — 70 cm, phía bên dưới gốc có các lá đã thái hóa thành các vẫy bao

quanh củ Giữa thân có một tang lá mọc vòng gồm 6 — 8 cái lá, thường là 7 lá, cuốn láđài từ 2,5 — 3 cm, phiến lá mỏng có hình mác rộng, dai 11 — 21 cm, rộng 4 — 9 cm, đầuphiến lá nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẫn, màu sắc lá thường là xanh nhạt, vàng nhạt,

đôi khi có màu tím nhạt Hoa mọc đơn độc ở đỉnh cây, cuốn hoa đài 15 — 30 em, lá đài

hình mũi mác màu xanh lục như lá, có 4 — 7 (thường là 6) lá xếp thành vòng trên thân,dai 3 — 7 cm, rời từng cánh một không rụng Số lá đài, thường bằng (hoặc xấp xi) số lá

và số cánh hoa Số lá đài có thé thay đồi nhiều hay ít trong cùng 1 loài chứ không phải

con số có định Cánh hoa dạng dài, xoắn ít tới nhiều, dai hơn lá đài 1,2 — 2 lần Số lượngnhị khoảng 8-14, thường gấp 2 lần số lượng lá, số lá đài và số cánh hoa xếp 2 vòng

3

Bầu có cạnh bầu lõm sâu, thường có ba ngăn, 4 - 7 cạnh, số cạnh bầu thường bằng VỚI

số la, số lá đài, số cánh hoa và số thùy của đầu nhụy Phận gốc voi nhụy — đỉnh bầuthường có màu sắc đa dạng từ mau tia, tim tới màu xanh lam Vietnamensis được phân

biệt với các loài khác thuộc chỉ ở đặc điểm đặc trưng bao gồm: nhị có trung đới kéo đàihình trụ ngắn 1 - 1.5 mm, cánh hoa dai hơn đài 1,5 — 2 lần, cạnh bầu lõm sâu, lát cắt

ngang qua bầu hình sao, nhụy gần như xẻ từ gốc với phần hợp (vòi nhụy) rất ngắn, phần

xẻ thành các thùy (đầu nhụy) dài, hạt có áo hạt màu đỏ (Nguyễn Tiến Dũng và ctv,2018).

Đây là loài cây ưa âm và ưa bóng sinh trưởng chủ yếu dưới các tán cây, thường

moc nơi đất 4m, nhiều mun, rải rác dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh ở các hốc

đá, doc bờ khe suối miền núi ở độ cao từ 100 m đến 1500 m (Nguyễn Quỳnh Nga và

ctv, 2016) Vào cuối mùa thu hằng năm phan thân trên mặt đất lui di Thân rễ mang 1

đến 2 chồi ngủ tồn tại xuyên suốt mùa đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau

Trong tự nhiên, thường chỉ có những cây trưởng thành với chiều dai thân rễ trên Semmới cho hoa quả và kết quả

Cây được nhân giống bằng hạt hoặc bang củ có các chồi ngủ Mỗi cây chỉ có một

hoa và mỗi hoa chỉ có một ít hạt (khoảng 5-10 hạt), cho nên tỉ lệ nhân giống bằng hạt

hiệu quả không cao Củ có nhiều đốt chứa các chồi ngủ nên có thể tách từng đoạn đềtrồng thời gian gieo trồng thường vào mùa xuân (tháng 2 — 3) hoặc mùa thu và thời gianthu hoạch khoảng (tháng 6 — 7) Cây ra hoa quả hàng năm Mùa hoa (tháng 5 — 6); mùaquả (tháng 6 — 10) Khi quả già tự mở cho hạt rơi xuống đất Cây con mọc ra từ hạt quansát thay vào khoảng (thang 4 — 5)

2.1.3 Phân bố

Trên thế giới, loài này phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Mianma, Lào, Thái Lan,

An Độ, Nê Pan

Ở nước ta, trước đây cây bảy lá một hoa được phát hiện tại vùng núi Cúc Phương

thuộc Hà Nam, Ninh Binh, Sa Pa (Lào Cai), Da Bắc (Hòa Bình), Sơn Động (Hà giang)(Đỗ Tat Loi, 2004) Cho nay nước ta đã thống kê và ghi nhận được tổng số 8 loài và 2thứ thuộc chi Paris gồm: Paris dunniana H.Lév., Paris fargensii Franch., Parisvietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.]JI, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H.Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var yunnanensis (Franch.)

Hand — Mazz., và Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H.Hara Phân bố rai rác ởmột số tỉnh miền núi phía Bắc cho tới vùng núi cao miền Trung và Tây (Nguyễn QuỳnhNga va ctv, 2016).

2.1.4 Thành phan hóa học

Bảy lá một hoa được xem là một loại kỳ hoa dị thảo với hình dạng đặc biệt và bộphận thường dùng là thân rễ, có chứa thành phần hóa học chính là Saponin steroid vàPolyphyllin là hợp chất quý Thân rễ cây bảy lá một hoa chứa diosgenin, pennogenin,

đường 7 — 9%, 2 glucosid là a-paridin và o-paristyphnin.

Từ cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ bảy lá một hoa đã phân 6 hợp chất tinhkhiết gồm: diosgenin, hỗn hợp hai chất stigmasterol-3-O-B-D-glucopyranosid và j-

sifosterol-3-O-B-D-glucopyranosid, gracillin, paris saponin D, paris saponin H.

Từ cao phân đoạn etyl axetat va butanol phan trên mặt đất loài bay lá một hoa phânlập được 15 hợp chat tinh khiết: trong đó có 1 hợp chất mới là 12-hydroxy-diosgenin-3-

O-œ-L-rhamnopyranosy]-(1—›2)-[œ-L-rhamnopyranosy]-(1—›3)]-B-D-glucopyranosid,

5 hợp chat lần đầu tiên phân lập từ chi Paris gồm

I-O-ơ-linolenoyl-3-B-D-galactopyranosyl-glyxerol, stigmasterol, thymidin, resveratrol, e-viniferin; 2 hợp chấtlần đầu tiên phân lập từ loài bảy lá một hoa gồm quercetin và 7 hợp chất khác làdiosgenin-3-O-g-Lrhamnopyranosy]-(1—2)-B-D-glycopyranosid, dioscin, parIs saponin II pennogenm, stigmasterol-3-O-D-glucosid, diosgenin-3-O-d-L- rhamnopyranosyl-(1—›4)-B-D-glycopyranosid và paris saponin VIL.

Các hợp chat được phan lập từ loài paris bao gồm saponin, flavonol, sphingolipid

và các glycosid khác Trong đó, nhóm có cấu tric saponin được nghiên cứu nhiều nhất

la saponin steroid.

Tổng cộng, 94 saponin steroid đã được phân lập từ chi Paris Trong số đó, các đạidiện thường gặp nhất là saponin loại spirostan, saponin diosgenin 1 — 20 Saponindiosgenin là một hệ vòng A-F sáu vòng, với nhóm oligosaccharidic liên kết với aglycontại C(3) Hợp chất 1 được phân lập lần đầu tiên từ P pubescens, cau trúc va cấu hìnhtuyệt đối của nó đã được làm sáng tỏ bằng các phương pháp quang pho (XX Huang va

ctv, 2010), và sau đó, nó được xác định liên tục trong P polyphylla var pseudothibetica

(ZY Zhao va ctv, 2011) và P axialis (XX Huang và ctv, 2011).

2.1.5 Tác dụng được lý

Bay lá một hoa loại dược liệu quý được sử dụng lam thuốc trong y học cô truyền

lâu đời nay của rất nhiều nước như: An Độ , Việt Nam, Trung Quốc v.v Thanh phan

dược tính có trong cây (Paris vietnamensis (Takht) H Li) đã được chứng minh có các

tác dụng như giảm đau chống viêm, cầm máu, điều hòa miễn dịch, chữa rắn độc can và

đặt biệt là ức chế sự phát triển của khối u Bởi vì có các công dụng đặt biệt ấy mà nhu

câu sử dụng của người tiêu dùng về loại cây dược liệu nảy ngày cảng cao

Trong đông y bảy lá một hoa có tính hơi lạnh, vị đắng, hơi cay Tác dụng chủ yếu

là xô ha, lợi tiêu, tiêu dom, hoạt huyết tán ứ, thanh nhiệt, giải độc Theo dân gian, bảy

lá một hoa có vi ngọt, hơi cây, tính bình không độc Tác dụng là thanh nhiệt giải độc,chữa sốt và rắn độc, sốt rét, ho lao ho lâu ngày Thân rễ của cây bay lá một hoa có chứasaponin, flavonol, sphingolipids và nhiều glycoside khác (Đỗ Tat Lợi, 2004) Nhiềuthành phần hóa học thực vật được tìm thấy trong thân và rễ của cây bảy lá một hoa có

hoạt tính dược lý như terpenoid, quinon, carbohydrate, alkaloid, sterol, flavonoid,

saponin, glycoside, phenol và tanin (Yuan-Chuen Wang va ctv, 2011) Theo nghiên cứu

(Zhang J va ctv, 2012) Saponin trong thân rễ của cây bay lá một hoa có tác dụng khángkhuẩn, kháng vi-rút và chống viêm và thúc day quá trình giải độc Saponin cũng là mộtthành phần của một số dược phẩm dùng dé ức chế sự phát triển của tế bảo ungthư (Tang Ly và ctv, 2014).

Các nghiên cứu trước đây đã cung cấp những tài liệu liên quan về khả năng củasaponin steroid từ P polyphylla hoạt động như các hợp chất hoạt tính sinh học thé hiệnhoạt tính gây độc tế bao và kháng khuẩn như: nghiên cứu về cấu trúc của saponin mớiđược phân lập từ thân rễ của P polyphylla (Xia wu và ctv, 2012) Nghiên cứu về ham

lượng phenolic và flavonoid, hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn (Homs Mayirnao

và ctv, 2017) hoạt tính chống ung thư của saponin steroid in vitro và in vivo (Xinhai Zhu

va ctv, 2016) Tuy nhiên, Một nghiên cứu hóa hoc dựa trên saponin steroid được báocáo bởi (YingWang và ctv, 2013) cho thấy 70 saponin steroid đã được phân lập từ cácloài khác nhau thuộc chi Paris Hoạt tính sinh học của các saponin steroid này đã được xác định là có hoạt tính mạnh hon saponin từ P polyphylla.

2.1.6 Những bài thuốc quý

Một số bài thuốc quý trong y học cô truyền từ cây bảy lá một hoa:

Trị viêm phé quản mang tính: sử dụng thân rễ cây bay lá một hoa đã phơi khô, rửasạch và nghiền thành bột min Sử dụng 5g bột dé sắc thành thuốc uống trong ngày Kiêntrì sử dụng 2 tuần sẽ cảm nhận được tình trạng bệnh giảm dan

Chữa ran cắn: Với vét thương bị rắn độc cắn, sử dụng từ 5 — 7 lá cây bảy lá mộthoa đã rửa sạch, giã nát dé đắp lên vết thương Đồng thời, sử dụng khoảng 20g củ tươihoặc 10g củ khô của cây bảy lá một hoa dé sắc cùng 100g cây Bán chi liên làm thuốcuống trong ngày Đều đặn thực hiện trong 7 ngày, tình trạng vết thương sẽ nhanh chónglành lại, độc tính còn sót cũng được giải trừ.

Điều Trị xuất huyết tử cung: Dùng bột của của cây thuốc và viên thành những hìnhtròn nhỏ khoảng 2g mỗi ngày sử dụng 2 lần, mỗi lần 2 viên nhỏ Thang thuốc này đãnghiên cứu lâm sàng trên 122 ca, có đến 85% người nhận được kết quả bệnh thuyêngiảm.

Điều trị sốt: Sử dụng 15g củ của cây bảy lá một hoa, 10 mạch môn, 12g bạch cúc,10g kim ngân hoa Các vị thuốc sau khi đã được làm sạch dem sắc cùng 800ml nước.Bệnh nhân sử dụng mỗi ngày 1 thang chia thành 3 lần uống trước bữa ăn chính Saukhoảng 3 ngày tình trạng sốt co giật sẽ được cải thiện

2.2 Tổng quan nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm

2.2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô - tế bao thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôicay nguyên liệu thực vat hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡngnhân tạo, trong điều kiện vô trùng Hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ốngnghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ốngnghiệm (Ngô Xuân Bình, 2010).

2.2.1.2 Các phương pháp nhân giống vô tinh in vitro

Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh: nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng(Limmasets và Cornuet, 1949) đã phát hiện rằng ở các cây nhiễm bệnh virus, virus phân

bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy chúng ở vùng đỉnh sinh trưởng Phát

hiện đó là cơ sở để (Morel và Martin, 1952) chứng minh giả thuyết trên bằng cách tạo

được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: nuôi cấy chỗi bat định.Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo: Trong nhân giống in vitro nếu tái sinhđược cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cay ban dau thì không những nhanh chóng

thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường

hợp mô nuôi cay không tai sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus Tế bao calluskhi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Dé tránh tinh trạng đó nhấtthiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hyvọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn callus còn có thé thu đượcnhững cá thé sạch virus như trường hợp của (Kehr và Sehaffer, 1976) thu được ở tỏi

Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính: (Street và Reinert, 1958) lần đầutiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota).(Murashige, 1977) cho rằng phôi vô tính có thé trở thành một biện pháp nhân giống in

vitro.

Nhân giống trong các nồi phan ứng sinh học: Trước đây, các nồi phản ứng sinh

học hay còn gọi là nồi lên men (fermentor) chủ yếu được dùng cho công nghệ vi sinh.Trên cơ sở các thiết bị đó, với một số cải tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công

nhiều loại phôi vô tinh và các thé chồi, cụm chdi hoặc củ nhỏ

Hệ thống hình thành chéi: Sự hình thành chổi có tương quan với hàm lượng etylen vaCO>.

2.2.1.3 Khái niệm mô seo

Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô cơ quan phân hóa dướicác điều kiện đặc biệt (tạo vết thương, chất điều hòa sinh trưởng thực vật) Trong môi

trường thích hợp mô sẹo có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh.

Nuôi cay mô seo được thực hiện với các loai thực vật khong có kha năng nhângiống bằng đỉnh sinh trưởng hoặc với các loại mẫu nuôi cay không thé trực tiếp hìnhthành chi (Wang va ctv, 2011) đã khảo sát sự kích thích seo (callus) từ lá có linh lăng.Cho thấy sự xuất hiện của sẹo (callus) từ bề mặt cắt của lá và gân lá

Mô sẹo có thể hình thành từ các mô cơ quan của nhóm thực vật một lá mầm hayhai lá mầm Các mô cơ quan thường dùng tạo mô sẹo là các tượng tần libe mộc, mô tiền

tượng tầng, cơ quan dự trữ, tế bảo diệp lục lá, trụ bì rễ, phôi nhủ và tử diệp (Nguyễn

Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Khi nuôi cấy các bô phận của thực vật trên môitrường nuôi cấy khác nhau tạo mô sẹo, thì mô sẹo được tạo ra có màu sắc khác nhau.Thường thì mô sẹo có màu trang, hơi xanh hoặc vàng (Vũ Văn Vụ va ctv, 2009).

Khi hình thành mô sẹo, thì mô sẹo có dạng mô sẹo xốp hoặc mô sẹo cứng Đối với

mô sẹo xốp chứa các tế bảo xốp và nhân nhỏ, không bảo to và chất tế bào loãng Còn

mô sẹo cứng gồm các tế bào chắc, nhân to, không bào nhỏ và tế bào chất đậm đặc (VũVăn Vụ và ctv, 2009).

2.2.1.4 Khái niệm rễ bat định

Rễ bat định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều

vùng trên cơ thé thực vật như đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp nhưng có mạch, đơn

tử điệp hay song tử diép nhân giống bang giò, dây leo hay thủy thực vật hoặc nhữngthực vật sống bám vào cây chủ Hiện tượng hình thái giải phẫu thực vật có thể chung

cho hai co quan rễ nhánh hoặc rễ bat định (Mai Tran Ngọc Tiếng, 2001)

Rễ bắt định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiên môi trường stress hay bị

vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi Có ít nhất hai con đường hình

thành rễ bat định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tang hay

từ mô sẹo (Pop và ctv, 2011).

Sự hình thành rễ bat định được điều hòa bởi nhiều yếu tố môi trường và các yếu tô

nội sinh (Sorin và ctv, 2005) Auxin và ethylen được xem là chất kích thích hình thành

rễ trong khi cytokinin và gibberellin thì ngược lại (Pop và ctv, 2011) Cho nên có thểnói rễ bất định tạo ra từ mô, tế bào có khả năng biệt hóa tạo cơ quan như tế bào tượng

tầng hay mô sẹo Đề thu được rễ bất định cần thông qua mô sẹo hoặc một loại tế bao có

khả năng biệt hóa cơ quan dưới ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

Trong nghiên cứu này rễ bất định được kì vọng như một nhân tố tiềm năng phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về tạo rễ thứ cấp sinh ra từ rễ bất định, nhân nuôi sinhkhối rễ dé thu hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghệ điều chế dược phẩm

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo vật liệu khởi đầu

2.2.2.1 Nguồn mẫu

Việc chọn nguồn mau, cách lay mẫu là yếu tố quan trọng dé có một nguồn vật liệukhởi đầu tốt, không hư hại để phục vụ trong quá trình thực hiện các thí nghiệm vô mẫuthực vật thành công.

Đối với nguồn mẫu có săn tại nơi thực hiện thí nghiệm phục vụ xuyên suốt quátrình thí nghiệm, không làm ảnh hưởng gì đến thí nghiệm Tuy nhiên, đối với nguồnmẫu không có săn, phụ thuộc vào nhà cung cấp mẫu nới cung cấp mẫu Thì ảnh hưởngrất lớn đến quá trình thực hiện thí nghiệm Ví dụ như khi đang thực hiện thí nghiệm mànguồn mẫu bị hết hay không có nguồn để cung cấp sẽ làm gián đoạn cho việc thí nghiệm.Thời gian di chuyển nguồn mẫu từ nơi cung cấp đến nơi thực hiện thí nghiệm xa, cáchbảo quản nguồn mẫu không đúng sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng nguồn mẫu như héo

ta, thối,v.v Lam mất chức năng sinh học của cây cho nên ảnh hưởng đến quá trình thực

hiện thí nghiệm.

Lay mau vào thời điểm thời tiết nang ráo, tránh lấy mẫu khi thời tiết mua, âm thấp,

vi mưa sẽ làm tạp chất và vi sinh vật bám lên bề mặt của mẫu, ảnh hưởng xau đến quá

Nhiều chat hoá học khác như thuốc kháng sinh, HgCl›, thuốc diệt nam cũng được

sử dụng dé khử trùng bề mặt mẫu cấy Nồng độ và thời gian khử trùng các chat này thikhác nhau và phụ thuộc vào loại và kích thước của mẫu, có thê tìm thấy trong nhiều tàiliệu Mặc du, nhiều ý kiến cho rang chỉ các mô thực vật ở bên ngoài tiếp xúc với hoáchất mới được tay độc Điều đó là hiển nhiên, vì thé sự thành công của việc khử trùngchỉ có thé đạt được nếu mô khử trùng cái mà không tiếp xúc với hoá chất không chứacác yêu tô gây nhiễm.

10

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo seo và rễ bat định

Việc ảnh hưởng đến quá trình tạo sẹo va tạo rễ in vito thì có rất nhiều yếu tố: môi

trường nuôi cấy, loại mẫu, tuổi mẫu, nhiệt độ, ánh sáng, tạo vết thương, chất điều hòa

sinh trưởng thực vật, thao tác thực hiện thí nghiệm v.v.

Mô sẹo là một đám tế bào vô tổ chức, không phân hóa, phân chia mạnh, thườngđược tạo ra đo quá trình xáo trộn hình thành mô cơ quan Vì thế, mẫu non của cây trưởng

thành thì dé phát sinh hình thái tạo mô seo (Bùi Trang Việt, 2000).

Ánh sáng là một yếu tô gây ảnh hưởng đến quá trình phát sinh mô sẹo, làm chậmhoặc ngưng quá trình phát sinh mô sẹo, do nhóm auxin dé bị phân hủy khi có ánh sáng

Vi vậy, dé hình thành mô sẹo người ta thường dé trong buông tối

Chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình hình thànhtạo mô sẹo và hình thành rễ bất định, đó là auxin, cytokinin Khi tăng nồng độ auxin thì

mô sẹo có dạng rời rạc nhưng giảm lượng auxin thì mô sẹo có dạng nốt và cứng (Lê Văn

Hoa và ctv, 2012) Sự hình thành mô sẹo liên quan đến sinh lý của mô cấy, liên quan tới

việc sử dụng auxin riêng lẽ hay hết hợp với cytokinin (Bùi trang việt, 2000)

Trong môi trường chỉ có auxin thì mô nuôi cấy chỉ hình thành rễ Vì vậy trong kĩthuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kì quantrọng và bắt buộc (Vũ Văn Vu, 1999) Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các

vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), axit amin (như arginin) và nhất làcác hợp chat ortho - điphenolic (như axit cafeic, axit chlorogenic) (Bùi Trang Việt,

2000).

2.2.4 Vai trò của của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

2.2.4.1 Vai trò của auxin

Auxin có nguồn gốc tự nhiên đầu tiên là IAA (indole — 3 - acetic acid) Sau đó mớiphát hiện ra một số loại auxin khác như 2,4 D, IBA Auxin được tổng hợp trong ngọnthân, trong mô phân sinh (ngọn và long) và lá non, từ tryptophan được tổng hợp trong

lã trưởng thành dưới ánh sang đóng vai trò Quan trong trong phát sinh hình thái Sau đóauxin di chuyển xuống rễ và tích tụ trong rễ

Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của auxin có vai trò trong việcthiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh

cơ quan (Bùi Trang Việt, 1998; Berleth và cs, 2001) Sự di chuyền hữu cực từ ngọn tớigốc cần năng lượng, tùy thuộc vào sự định hướng của mô, ít chịu ảnh hưởng của trọng

11

lực, rất chậm,thường xảy ra trong các tế bào nhu mô bao quanh bó mạch của thân và

trong mọi tế bào diệp tiêu (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phan dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ rang

được nhìn rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyền vận này,

chúng bị thoái hóa bởi auxin —oxydase, điều này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao

hơn gần với những nơi tổng hợp ra chúng Như vậy auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ

ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa dé đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế

bào (Dương Công Kiên, 2002).

2.2.4.2 Vai trò của cytokinin

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào dưới điều kiện có auxin Cytokinin tácđộng đến hai quá trình phân chia tế bào: phân bào và phân nhân (Bùi Trang Việt, 2000)

Do hoạt động của cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ đến sự sinh tổng hợp nuceid acid vàprotein (Vũ Văn Vụ và ctv, 2008).

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặt trưng lên sự phân hóa mô co quan thực vật, nhất

là sự phân hóa chéi (Vũ Van Vụ va ctv, 2008) Kích thích sự tăng trưởng của lá, phân

hóa mầm, trạng thái ngủ của hạt, kích thích nây man và tăng sự nở hoa (Võ Thị BạchMai, 2004).

Cytokinin làm giảm ưu thế ngọn, phân cành nhiều Vì vậy, từ rễ cho đến chồi ngọn

thì hiện tượng ưu thế ngọn tăng dần tương ứng với hàm lượng auxin tăng và cytokinnin

giảm (Vũ Văn Vụ, 2009).

2.2.4.3 Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong qua trình phát sinh cơ quan

Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin giúp tăng trưởng chéi ngọn va tạo mô phânsinh ngọn từ nhu mô Tuy nhiên, auxin ở nồng độ cao, làm giảm đi sự phát triển của thể

chỗi vừa thành lập hay chỗi nách, các chồi đang trong trạng thái tiềm sinh

Cytokinin và auxin hỗ trợ lẫn nhau trong sự tăng trưởng nhưng cũng có đối lập

giữa giúp tạo chdi (cytokinin) và giúp tạo rễ (auxin) Vì vậy, cả hai con đường phát sinh

hình thái cơ quan gián tiếp hay trực tiếp thông qua mô sẹo, việc kết hợp giữa cytokinin

và auxin sẽ quyết định chiều hướng phát sinh hình thái (Miller và Skoog, 1965) đã

chứng minh rằng quá trình tạo rễ hay chồi của mô sẹo thuốc lá tùy thuộc vào tỉ lệ

auxin/cytokinin trong mô trường nuôi cay Tỉ lệ auxin/cytokinin cao giúp hình thành tạo

rễ và tỉ lệ auxin/cytokinin thấp giúp hình thành tạo chồi (Bùi Trang Việt, 2000)

12

2.2.5 Kĩ thuật nuôi cấy tế bào lớp mỏng

Kĩ thuật nuôi cấy tế bào lớp mỏng (TCL: Thin Cell Layer) thường đươc sử dụng

nghiên cứu trên các mẫu cây có kích thước nhỏ được cắt lát mỏng từ các mô cơ quankhác nhau: lá, thân, củ, các bộ phận của hoa, lá mam hay phôi Nếu mẫu được cắt theolát đọc thì gọi là ITCL (longitudinal Thin Cell Layer) gồm một số loại tế bào hoặc vàilớp tế bào với kích thước 1 mm x 0,5 mm hay 10 mm còn mẫu được cắt theo lát nganggọi là fTCL (transverse Thin Cell Layer) gom một số lượng nhỏ các tế bao thuộc loại

mô khác nhau có kích thước 0,2 — 0,5 mm đến vai mm bề dày (Tran và ctv, 2003)

Một đặc điểm phổ biến của ITCL và tTCL là tính mỏng, có nghĩa là lát cắt mỏng

có số lượng tế bảo càng ít càng tốt Đặc tính “mỏng” đóng vai trò cực kỳ quan trọng bởinhững phân tử chỉ thị xác định cho sự biệt hóa có thé được xác định ngay trong những

tế bào đích (hay tế bào đáp ứng) Sự xác định vị trí như vậy cho phép giới hạn những tế

bào đáp ứng (Dương Tan Nhựt, 201 1)

Ky thuật TCL sau đó được áp dụng thành công trong phat sinh phôi vô tinh và taisinh chéi ở nhiều loài cây hai lá mầm và cây một lá mam, bao gồm một vài giống Lan

va các giống cây trồng khác như, cây sâm Ngọc Linh (Vũ Thị Hiền và ctv, 2016), câyHồng Môn (Trần thị Ngọc Lan và ctv, 2017)

2.2.6 Những nghiên cứu in vitro về cây bảy lá một hoa

Raomai va ctv, 2015 thực hiện quy trình tai sinh hiệu quả cho cây Paris polyphylla

Sm được thông qua việc hình thành các thân rễ nhỏ (MRs) bằng cách sử dụng kỹ thuật

nuôi cấy lớp tế bào mỏng ngang (tTCL) MR được tạo ra từ các mẫu cấy fTCL có nguồn

gốc từ phần gốc và thân giữa trong khi phần ngọn không thê hiện bất kỳ loại phản ứng

nào Ty lệ phần trăm phản ứng cao nhất (86,6 %) của sự hình thành MRs với trọng lượngtươi tối đa (1,05 + 0,08 g) đạt được từ các phần cơ bản được nuôi cấy trên môi trường1⁄2 MS bồ sung 0,5 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) MR được chuyền sang môi trườngkhông chứa chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã tạo ra chồi chồi mà cuối cùng tái sinhthành cây con và được di thực thành công với ty lệ sống sót hơn 95 % trong điều kiện

nhà kính.

Năm 2022 Puwein và ctv, nhân giống in vitro sử dụng chất điều hòa sinh trưởng

thực vật (PGR) đã được đánh giá ở Paris polyphylla Các lớp tế bào mỏng (0,5—1 mm)của thân rễ (mẫu cấy) được cắt lát và cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog)nồng độ bán phan với 3% (w/v) sucrose và đông đặc với 0,3% (w/v) clerigel Trong môi

13

trường này, 50% mẫu cấy được xử lý bằng (0,5 ug mL—1) than hoạt tính (AC) và 50%

không có AC Môi trường MS nồng độ một nửa được bổ sung các nồng độ khác nhaucủa 6-benzylaminopurine (BAP) riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất phụ trợ Tỷ lệ phầntrăm tối ưu (80%) của phản ứng tạo chỗồi được tạo ra nhờ tác dụng kết hợp giữa BAP(0,5 ug mL—I) và axit axetic a-naphthalene (NAA) (0,2 ng mL—]) trong môi trườngchứa AC Sau khi cấy chuyền, số chỗồi chỗồi cao nhất (4,00 + 1,00) trên mỗi mẫu cấy đạt

được trong môi trường MS với AC, được tăng cường với sự kết hợp của BAP (0,5 ug

mL—1) và NAA (0,2 wg mL—1) Môi trường chứa AC cho thấy cảm ứng tạo chồi lớn

hơn so với môi trường không chứa AC Có tới 94,4% chéi tái sinh được thiết lập thànhcông trong đất nhà kính

14

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu

Đề tai bắt đầu thực hiện từ 8/2022 đến 12/2022

Địa điểm thực hiện đề tài tại phòng 301 Sinh học Tích hợp Thực vật (PIB), KhoaKhoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguồn mẫu

Nguồn mau cây bay lá một hoa (Paris vietnamensis) 2 năm tuôi được thu thập từvùng núi Tây Bac (Phang Sô Lin — Sin Hồ - Lai Châu) Vật liệu nuôi cấy được sử dungtrong nghiên cứu nay là lá, thân, củ.

Hình 3.1 Cây bay lá một hoa được sử dụng trong nghiên cứu (a) Cay bảy lá

một hoa thu nhận ở Phăng Sô Lin — Sin Hồ - Lai Châu; (b) Mẫu lá dài khoảng 7 em

và rộng khoảng 5 em ; (c) Mẫu đoạn thân dài khoảng 5 cm; (d) Mẫu củ.

15