Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc và một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii)

TÓM TẮTĐề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc và một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo hoa đồng tiền Gerbera jamesonii” được thực hiện nhằm xác địnhảnh hưởng của nan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG DAI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SÁT ANH HUONG CUA NANO BAC VA MỘT SO CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN SU HINH THANH

MO SEO HOA DONG TIEN (Gerbera jamesonii)

Ngành học:

Sinh viên thực hiện:

Mã sô sinh viên:

Niên khóa:

CÔNG NGHỆ SINH HỌCNGUYÊN THỊ HIỆP

18126047

2018 - 2022

TP Thu Đúc, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SAT ANH HUONG CUA NANO BAC VÀ MOT SO

CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN SU HINH THANH

MO SEO HOA DONG TIEN (Gerbera jamesonii)

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiệnPGS.TS NGUYEN VU PHONG NGUYÊN THỊ HIỆPThS HÀ THỊ TRÚC MAI

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Đây là một trong những công đoạn cuối cùng dé em có thé hoàn thành khóa luận

tốt nghiệp và kết thúc một chặng đường theo học Đại học ở khoa Khoa học Sinh học —Trường Dai học Nông Lam TP HCM Đó là một chặng đường khá dai và nhiều biến cố

khó khăn đã xảy ra Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận, em đã nhận được

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn rat tận tình từ các quý thầy cô — giảng viêntrường Dai học Nông Lam TP HCM nói chung và các quý thầy cô — giảng viên khoaKhoa Học Sinh Học nói chung Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy vàtrang bị cho em những kiến thức, kỹ năng bổ ích trong suốt quá trình em theo học

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thay PGS.TS Nguyễn VũPhong đã luôn tận tình, quan tâm, hướng dẫn em trong suốt quá trình em thực hiện đềtài nghiên cứu Truyền đạt và dạy em rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm và góp ý cho emnhững kiến thức chuyên môn rất bổ ích Cảm ơn thay đã cung cấp và tạo điều kiện tốtnhất đề cho em có thể thuận lợi thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài, luôn độngviên tinh thần em suốt quá trình thực hiện

Đồng thời, em cũng gửi lòng biết ơn đến ThS Hà Thị Trúc Mai, KS Đặng HuỳnhThúy Vy đã rất tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý cho em rất nhiều trong suốt quá trình

em thực hiện dé tài Em cũng cảm ơn tất cả các anh, chi, bạn phòng lab PIB đã luônđồng hành và yêu thương, giúp đỡ nhau trong các công việc

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện rất nhiều về mặt kinh tế vàtinh thần, luôn ủng hộ em Cảm ơn bạn bè em vì đã đồng hanh va ủng hộ tinh thần Cảm

ơn bản thân em vì đã nỗ lực dé hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn !

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Thị Hiệp, MSSV: 18126047, Lớp: DH18SHD thuộc ngành Công

nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây làkhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 03 năm 2024

Người viet cam đoan

i

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc và một số chất điều hòa sinh trưởng đến

sự hình thành mô sẹo hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii)” được thực hiện nhằm xác địnhảnh hưởng của nano bạc và các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình hình thành mô sẹophôi hóa và phôi vô tinh cây hoa đồng tiền in vitro, từ đó ứng dụng trong vi nhân giống.Mau lá non in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS + 2 mg/L 2,4-D + 1 mg/L BAP +

AgNPs (0 —3 ppm) Mô seo lá được tang sinh trong môi trường MS + 2 mg/L 2,4-D + 1

mg/L BAP, sau đó chuyên sang môi trường MS bồ sung các chat điều hòa sinh trưởngBAP, NAA và nano bạc ở các nồng độ khác nhau dé cảm ứng tạo phôi Kết qua cho thay,

sự hiện điện của nano bạc trong môi trường nuôi cấy gây tôn thương cho mô sẹo, với tỷ

lệ mô sẹo hóa nâu và chết tăng lên theo nồng độ của nano bạc Đối với mẫu lá, môi trường

MS bồ sung 0,5 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA dat tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo phôi hóa cao nhất

là 25,0% Việc bổ sung nano bạc vào môi trường đã cải thiện tỷ lệ hình thành mô sẹo phôihóa và giảm thiêu sự tạp nhiễm Đối với mẫu chồi đỉnh, môi trường MS bồ sung 3 mg/LBAP, 0,2 mg/L NAA và 2 ppm nano bạc đã thúc day quá trình hình thành mô sẹo phôihóa và tạo thành phôi vô tính hoàn chỉnh sau 18 tuần nuôi cấy

Từ khóa: AgNPs, BAP, Gerbera jamesonii, mô sẹo phôi hóa, NAA.

1H

The study "Investigating the effects of silver nanoparticles and some growth regulators on the formation of embryogenic callus in Gerbera jamesonii" aimed to determine the impact of silver nanoparticles and growth regulators on the process of callus formation and somatic embryogenesis in Gerbera jamesonii in vitro, for

application in micropropagation Young in vitro leaf samples were cultured on MS

medium supplemented with 2 mg/L 2,4-D, 1 mg/L BAP, and AgNPs (0 — 3 ppm) Leaf callus was proliferated in MS medium with 2 mg/L 2,4-D and 1 mg/L BAP, then transferred to MS medium supplemented with various concentrations of BAP, NAA, or silver nanoparticles to induce embryogenesis Results showed that the presence of silver nanoparticles in the culture medium caused damage to the callus, with the rate of browning and death of the sample increasing with the concentration of silver nanoparticles For leaf samples, the MS medium supplemented with 0.5 mg/L BAP and 0.1 mg/L NAA achieved the highest rate of embryogenic callus formation at 25.0% The addition of silver nanoparticles to the culture medium improved the rate of embryogenic

callus formation and reduced contamination For shoot apex samples, the MS medium

supplemented with 3 mg/L BAP, 0.2 mg/L NAA, and 2 ppm silver nanoparticles promoted the process of embryogenic callus formation and the development of complete somatic embryos after 18 weeks of culture.

Keywords: AgNPs, BAP, embryogenic callus, Gerbera jamesonii, NAA.

IV

MỤC LỤC

LOI CAM 09 iXÁC NHẬN VA CAM DOAN v.esccssssssssessesessesscsesecsveeesecsscevsucseceesucesssvsecssessecsseeeeees ii

1.2.Mục tiêu của đề tải s5 s21 1112121 151511115112121111121212111112 11a 3

1.5:NÑGï dung: HIẾT svasssopsseaesegioidEiiGiilobvöosttläftlvlBoilDuiidRisoilA-BlnGAl\1gBAAGI08089/03.080) 3

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-22-©2222z222222E+22E+22E+22E+szsceex 42.1.Tổng quan phương pháp nuôi cay mô, tế bào thực vật -:- 4

Ss ee 4

2.1.2 Co sở của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật . -: 5- 42.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 2 2 2 2522522 52.1.4 Một số hạn chế thường gặp trong nuôi cấy mô - 2: 2222222222222 62.1.4.1 Hiện tượng thủy tính thỂ 2 2+S2SE2S22E2E2212E2212212512121211212122221 2e 6

PP VÄji (u00 240i 6

2.1.4.3 Hóa nâu mẫu cấy, hóa nâu môi trường 2 2 2222222+Ez2z2zzzzzzzzz2 72/2,Giữi thiếu ve cây hora đồng LIỀN wrccorecancrcmmmscom nconnnisnnusmninemanmmnnas 8

2,2:l„ GIG thiệU CHUNG: sesesseessseesesenresucenenneanaseersseaseeeasesseriaanemnesteurmeemeneeesenes 8

2.2.2 Phân bó - 2 2+222E22E1221211211211211211211211211211211211211211211211211211211211212 1 xe 82.2.3 Đặc điểm thực vat của cây hoa đồng tiển 2-2222 222E22zz2Ezzzzczxe2 82.2.4 Điều kiện sinh trurOng c.cccccscessecosssseeesesessecessesseesensessseessessesseestseteeeeeeeeees 92.2.5 Những nghiên cứu về cây hoa đồng tiền - - 5-5252 52222c+cscccz 92.3 Giới thiệu về nano bạc 5-2 S2 + E323 SE5E5125 2111151512111 1211111 1111111111 te 10

2.3.1 GiGi thiGu CHUNY 1n 10

2.3.2 Một số cơ chế hoạt động của nano bạc trong vi nhân giống 112.3.2.1 Khả năng kháng khuân 2-©22©22222222EE2EE22E122212221221221 2E, 112.3.2.2 Khả năng ức chế sinh tổng hợp khí ethylene 2-22 22 55222zz25222 112.3.3 Một số nghiên cứu về AgÌNPs - 2¿©22¿2222EE2221222122212212221222 2222 12CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22- 22222E+S22E22E2£z22zcx2 14

Seiko LOL Stat fgHI1EH GIỂU:ssosssiassosesiasbsiiesoobdistidttdgggguiniS5.20016G03036100/085896cãI5036:2300090886300806 14 3.2 Vat lidu nghién COU 01 14

2 ee 14

25:20: MOI TRƯỞIHÍỞöxstoteg0 6000003099155 36 58560980386885S838SSESGEEHGVSRGHIGSSSEESHSESSESSS.SHBI-GSINSESJHGEHEESSSEERRE 14

171 #ïï 0H an be Bueeeoeaadaasusontdoronthinepittf0ginu00020001009160070030600000603E 14

3:5 Phirong: pla pa Sh 60 GÍNssscsssssseecsoitstbiiinilSicdLsl04L016462863501g003388đi0gi310LSb:g'S-G/B5482180G00163638E 14

3.3.1 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự cảm ứng tao mô sẹo 143.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến sự hình thành mô sẹo

HÔI HỒ syxtsnngci51236014E2ESlNSEGHEEJBIGBSS0ISSSSNSgSSGÄ4SSSNB.SSH.SONGGEENHHEHGÙEGEAHHNESSNSSEĐ9H38198880 15

3.3.3 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa 163.3.3.1 Khảo sát tác động của nano bạc đến hình thành mô sẹo phôi hóa từ lá in vi/ro L63.3.3.2 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ choi

THỊNH 07) WALEED cíaggiecsessbavsnessissSncbbrgeesiskasdsbsrBinoiikieguorsisgeslliodseberiieoissngErbdcibsigouEskeblitsbsbgscbixkagri 17

ea ee 17CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2©-2+c2+E2E+E+Errrrxrrxee 184.1.Khao sát tac động của nano bạc đến sự cảm UNG TO SEO sncwnssawrnnscncnnemennmeie 184.2.Khao sat anh hưởng BAP va NAA đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa 214.3 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô seo phôi hóa 234.3.1 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ lá in

4.3.2 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa và phôi

vô tính từ chOi đỉnh i7: VifO +2 22222122123 E23 E51 E5E21E21 1115515512151 exer 57CHUONG 5 KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ, 2 2+2 +E+EE£E2E£EE2EE2EEEeExrErrxrrx 32

ee 325.2 Để Te) 2-2222 22222221221211211221211211211211211211211211211211211211211211 1121.1121 xe 32TÀI LIEU THAM KHẢO ©2¿©2¿+222222E22E22E22522522512122112112112112122122222 e2 33

PHU LỤC 2¿22+SS2S2E12211211221121122171121111121111211111121 122112 ee 36

VI

: Benzyl adenine : Benzyl aminopurine : Cộng tác viên

: Hệ số biến động

: Deoxyribonucleic Acid

: Các hat nano sắt

: Hydrochloric Acid : B-indole acetic acid

: B-indole butyric acid

: Môi trường Murashige va Skoog (1962)

: o-Naphthaleneacetic acid : Ribonucleic acid

: S-adenosyl-L-methionine

Vii

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Nong độ chất điều hòa sinh trưởng BAP (mg/L) va NAA (mg/L) được bổ

sung vào môi trường ở thí nghiệm hình thành mô sẹo phôi hóa - 15

Bang 4.1 Tác động của nồng độ AgNPs đến sự cảm ứng mô sẹo - - 19Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA đến việc tạo mô sẹo

eM | | ee 21Bang 4.3 Tác động của AgNPs đến quá trình hình thành mô sẹo phôi hóa 25Bảng 4.4 Tỉ lệ mô seo phôi hóa sau 8 tuần nuôi cấy từ chéi đỉnh in vitro 28

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh hoa đồng tiền - 22-22 S2 2SS22E22EE22EE22EE2EE22EE22212222222eczrree 8Hình 4.1 Hình thái mô sẹo tạo thành từ mẫu lá sau 6 tua oo ees eeeseeeeeeeeeeeeeeeeee 20Hình 4.2 Hình thái mô sẹo tạo thành từ mẫu lá sau 8 tuần -2- 2 2+s+=zz52 20Hình 4.3 Hình thái mô sẹo phôi hóa sau 8 tuần nuôi cấy - 2 5255225522 23

Hình 4.4 Hình thái mô sẹo phôi hóa sau 4, 6, 8 tuần nuôi cấy —— 26

Hình 4.5 Hình thái mẫu và phôi vô tính phát triển từ mô sẹo chồi đỉnh 29

1X

CHUONG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện tại, ở Việt Nam ngành trồng trọt vẫn đang chiếm một tỷ trọng lớn trong nềnkinh tế Vì vậy, việc sản xuất và chọn giống cây trồng ngày cảng trở nên quan trọngtrong chuỗi sản xuất nông nghiệp Đề đáp ứng được nhu cầu ngày cảng cao về số lượng

và cả chất lượng, năng suất giống cây trồng của thị trường thì công nghệ nuôi cay mô tếbào thực vật (kỹ thuật nuôi cấy in vitro) đã được ưa chuộng, tin cậy sử dụng trong cácquy trình sản xuất, chọn lọc giống cây trồng

Hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) từ lầu luôn được ưa chuộng nhờ vào sự đa dạng

về màu sắc và được sử dụng sử dụng đa dạng mục đích như hoa cắt cành, hoa chậu Hoađồng tiền là một trong những loài hoa được trồng thương mại mang lại giá trị kinh tếcao cho ngành hoa Việt Nam Hoa đồng tiền cũng mang ý nghĩa là cầu mong cho sựmay man, tin tưởng và thịnh vượng đây cũng là một lý do mà hoa đồng tiền được ưadùng trong các dịp quan trọng như lễ, tết Chính vì vậy, nhu cầu hoa đồng tiền phục vụcho thị trường rất lớn, thúc đây việc gia tăng sản xuất loài hoa này Theo thống kê củaCục Trồng Trọt, trong vòng 10 năm (2005 — 2015) diện tích trồng hoa ở Việt Nam đãtăng hơn 2,3 lần, giá trị sản lượng tăng 7,2 lần (Nguyễn Thị Tần và ctv, 2018)

Diện tích gieo trồng lớn dé đáp ứng nhu cầu lớn của thị trường kéo theo nhu cầu

về nguồn giống cũng tăng lên Hiện nay, nguồn giống cây trồng được sản xuất số lượnglớn bằng kỹ thuật nhân giống in vitro đã gần như đáp ứng được yêu cầu về chọn lọcgiống cây trồng của thị trường Nguồn giống đồng đều, năng suất cao, hệ số nhân giốngnhanh, cây giống luôn được giữ những đặc tính di truyền từ cây mẹ và được trẻ hóathường xuyên, sạch bệnh, phát triển khỏe mạnh là những đặc điểm mà ngành công nghệnuôi cay mô tế bào thực vật mang lại và định hướng phát triển

Nhung trong quá trình nuôi cấy in vitro giống hoa đồng tiền thường gặp phải nhữngvan đề tiêu cực trong quá trình thực hiện nuôi cấy, do tác động của nhiều yếu tố bìnhkín như dư thừa các chất điều hòa sinh trưởng, độ âm cao cũng như sự tích lũy khíethylene (Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2018) Nhưng quá trình thực hiện kỹ thuật nuôi cấy

in vitro cũng gặp không ít những khó khăn Theo Ha Thị Mỹ Ngân và ctv (2019), đã

nêu ra một số hiện tượng bắt thường hay gặp trong quá trình vi nhân giống thực vật như

thủy tinh thể; hiện tượng vàng và rụng lá: sự nhiễm vi sinh vật; hoại tử chồi đỉnh, rễ vàmẫu mô nuôi cay; hóa nâu mẫu, môi trường nuôi cấy v.v Những van đề, hiện tượng nêutrên ảnh hưởng xấu đến kết quả và mục dich của quá trình nuôi cấy in vitro hướng đến.

Bên cạnh đó, công nghệ nano cũng là một trong những phương pháp ứng dụng vào

dé khắc phục các van dé bất thường trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Các hạt nano kim loại có tác động tích cực lên các tế bào thực vật được chứngminh thông qua tăng sự nảy mầm và phát triển thực vật; tăng cường hoạt động sinh lý

dé cải thiện khả năng hấp thụ ánh sáng, tăng trọng lượng tươi và tăng trọng lượng khô,thúc day quá trình chuyền hóa năng lượng, thúc day stress chống oxy hóa, cải thiện quátrình quang hợp: hạn chế sự rụng các cơ quan sinh sản của thực vật; tăng sản lượng vànăng suất cây trồng (Nair và ctv, 2010)

Nano bạc (AgNPs) là một trong những vật liệu nano bac kim loại rất được ưachuộng và phô biến trong nhiều lĩnh vực nói chung và trong nuôi cấy in vitro nói riêng.Bởi các công dụng mà nó có thê mang lại cho các nghiên cứu khoa học trong lĩnh vựcnuôi cay mô tế bao thực vật như khắc phục hiện tượng thủy tinh thể, vàng vả rụng látrong quá trình nuôi (Kumar và ctv, 2009); tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triểncủa cây trồng với ưu điểm tăng tiếp xúc, bám đính lên bề mặt tế bào, dẫn tới hiệu quảtác động cao (Dương Tấn Nhựt và ctv, 2015); có khả năng khử trùng bề mặt tốt màkhông có tác động xấu lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy (Dương Tấn Nhựt

và ctv, 2018); Có thé giúp loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm có hại cho mẫu như: vi khuẩn,nam v.v trong vi nhân giống thực vật trên nhiều đối tượng (Spinoso-Castillo và ctv,2017); AgNPs là một chất kháng khuẩn tốt

Vì những lý do trên đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc và một số chất điềuhòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii)” nhằmxác định ảnh hưởng của nano bạc và các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo sẹocây hoa đồng tiền, từ đó xác định ảnh hưởng của nano bạc lên các quá trình tiêu cực xảy

ra trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định sự ảnh hưởng của nano bạc đên sự cảm ứng mô sẹo, hình thành mô sẹo

phôi hóa và xác định được môi trường nuôi cây có bô sung nông độ chât điêu hòa sinh

trưởng thích hợp dé phát triển mô sẹo phôi hóa từ mẫu lá non hoa đồng tiền in vitro

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sat tác động của nano bạc đến sự cảm ứng tạo mô sẹo

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP va NAA đến sự hình thành mô

sẹo phôi hóa.

Nội dung 3: Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan phương pháp nuôi cấy mô, tế bao thực vật

2.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng dé chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng

in vitro các bộ phận tach rời khác nhau của thực vat Kỹ thuật nuôi cay mô dùng cho ca

2 mục đích nhân giống va cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các san pham hóa sinh,bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguôồn gen quý v.v

Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn được gọi là vi nhângiống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi

cay mô dé nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có

kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong cácloại bình nuôi cấy khác

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micro propagators) dùng thuật ngữ nhângiống in vitro, nuôi cây mô thay đổi cho nhau dé chỉ mọi phương thức nhân giống thựcvật trong điều kiện vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture)

2.1.2 Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nam 1838, hai nhà khoa hoc Matthias Jacob Schleiden (nhà thực vật hoc) và

Theodor Schwann (nhà động vật học) đã chính thức xây dựng học thuyết tế bảo, họcthuyết khang định rằng: mỗi cơ thé động thực vật đều bao gồm những thé tồn tại hoàntoàn độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bao Kỹ thuật nuôi cay tế bảo nói chung

và kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là có tínhtoàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa của tế bảo

2.1.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Theo Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rang mỗi tế bao bất kỳcủa một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá théhoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóamang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thê sinh vật đó Khigặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành cá thé hoàn chỉnh Do là

tính toàn năng của tê bảo.

2.1.2.2 Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Sự phân hóa tế bảo là sự chuyển các tế bao phôi sinh thành các tế bao mô chuyển

hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.

Sự phản phân hóa là khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,chúng không hoàn toàn mat khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ởđiều kiện thích hop, chúng lại có thé trở lại dạng tế bào phôi sinh, phân chia mạnh mẽ

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chếcác gen Tại thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thé, có một số gen được hoạthóa dé cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bi đình chỉ hoạt động

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

2.1.3.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô, bao gồm:

Các loại muối khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô bao gồm cácloại nguyên tố khoáng được chia ra làm 2 loại dựa theo hàm lượng sử dụng Đó là cácnguyên tố khoáng đa lượng với nồng độ trên 30 ppm trong thành phần dinh dưỡng như

N, P, K, S, Mg, Ca; với nồng độ sử dụng trong môi trường đinh dưỡng dưới 30 ppm nhưcác nguyên tố Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni được goi la nguyên tổ vi lượng

Các thành phần khác là nguồn carbon (thường dùng saccharose 2 — 3 %, trong một

số trường hợp đặc biệt có thé dùng glucose, maltose, galactose v.v.,), vitamin (BI, B2,B6 v.v.,), nhóm chất tự nhiên (nước dừa, dịch chiết nam men, dịch chiết khoai tây, dịchchiết chuối v.v.,), chất làm đông môi trường (agar v.v.,), chất điều hòa sinh trưởng

(auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, polyamine, jasmonic acid).

Trong môi trường nuôi cay mô tế bao thực vat, thành phan quan trọng nhất, quyếtđịnh đến kết quả của quá trình nuôi cấy đó là chất điều hòa sinh trưởng

2.1.3.1.1 Auxin

Auxin được gọi là hormone sinh trưởng được tổng hợp chính từ chồi ngọn, có tácdụng kích thích mạnh lên sự giãn của tế bảo, làm cho tế bào phình to lên chủ yếu theohướng ngang của tế bảo, sự giãn của các tế bào gây nên sự tăng trưởng của cơ quan vàtoàn thân, có tác dụng điều chỉnh tính hướng quang, hướng địa, hướng thủy, hiện tượng

ưu thế ngọn, sự rụng của lá, hoa, Một số chất thuộc nhóm auxin thường dùng: IAA

(auxin tự nhiên), IBA, NAA, 2,4-D.

2.1.3.1.1 Cytokinin

Cytokinin được tông hợp từ hệ rễ và có mặt trong các ARN vận chuyên Hiệu quảsinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia tế bào

mạnh mẽ Cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực

vật, đặc biệt là sự phân hóa chi Cytokinin là hormone hóa trẻ và có hiệu quả lên sự

phân hóa giới tính cái làm tăng tỉ lệ hoa cái của cây đơn tính Cytokinin còn có tác dụng

kích thích sự nảy mầm Một số loại cytokinin chính thường được dùng trong nuôi cay

mô là kinetin, zeatin, BAP, BA

2.1.4 Một số hạn chế thường gặp trong nuôi cấy mô

2.1.4.1 Hiện tượng thủy tỉnh thể

Các chéi được nuôi cấy in vitro trong điều kiện độ âm cao và dị dưỡng bên trong cácbình nuôi cấy kín thường sẽ xuất hiện bất thường về hình thái, sinh lý và hoạt động trao đốichat Do là nguyên nhân dẫn đến sự tích nước quá mức, sự mong nước hay hiện tượng trongvắt như thủy tinh của cây mà người ta hay gọi là hiện tượng thủy tinh thé hóa Thuật ngữ

“vitrification” là thuật ngữ chính đề cập đến một quá trình sinh lý, là thuật ngữ dùng đề diễn

tả sự biến đổi của mẫu dẫn đến hiện tượng thủy tinh thé (Kharrazi va ctv, 2011)

Hiện tượng thủy tinh thé là sự biệt hóa và hóa gỗ kém của mô, các tế bào trongnhững lá bị thủy tinh thé bao quanh bởi những vách mỏng va chứa nguyên sinh chấtnghèo dinh dưỡng với không bào lớn, hàm lượng lục lạp thấp Đối với một vài loài cây,

sự thuỷ tinh thé kéo theo sự khiếm khuyết của mô biểu bì Lớp lông sừng của lá cây bịthủy tinh thể mỏng manh hon so với những lá bình thường Thủy tinh thé còn làm chokhả năng định hướng của vi sợi cellulose trên vách tế bào bảo vệ lỗ khí giảm đi nên khảnăng đóng, mở khí không của chúng kém đi Những khí không dị thường cho thấy cónhững vết thương quanh lỗ khí và chúng không đáp ứng được với stress nước, ABAcũng như nồng độ CO> cao (Gaspar và ctv, 2002)

2.1.4.2 Tích lũy khí ethylene

Ethylene (CzH¿) là một hormone thực vật duy nhất ở dạng khí, tác động đến sựsinh trưởng, sự biệt hóa và sự già hóa của thực vật ở nồng độ thấp 0,01 wl/L Khí ethylenevừa được biết đến nhiều nhất với vai trò làm chín hoa quả (Chang, 2016) Vừa có ảnhhưởng đến nhiều quá trình sinh lý thực vật bao gồm: cảm ứng mô sẹo, phát sinh phôi,nuôi cấy huyền phù tế bảo, tái sinh chôi, hình thành rễ, sự rụng lá, ra hoa, lão hoá (Kumar

va ctv, 2009).

Tiền thân của con đường sinh tổng hợp ethylene là amino acid methionine.Methionine được chuyền đôi thành SAM (S-adenosyl-L- methionine) nhờ enzyme ACS(ACC-Synthase) và cần năng lượng ATP (Adenosine triphosphate) SAM được chuyểnđổi thành ACC (l-aminocyclopropane-l-carboxylc acid) và MTA(methylthioadenosine) - sản pham phụ của phản ứng được dùng dé tai sinh methioninetheo chu kỳ Yang tránh sự cạn kiệt methionine trong quá trình sản xuất nhiều ethylenebởi enzyme ACS Sau đó, ACC được khuếch tán đến các cơ quan, bộ phận khác nhautrong cây và được chuyền hóa thành ethylene nhờ enzyme ACO (ACC-oxidase) Được

mô tả bới Houben và Van de Poel (2019).

2.1.4.3 Hóa nâu mẫu cấy, hóa nâu môi trường

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, khi nuôi cay một số thực vật cũng thường xuyênxuất hiện hiện tượng hóa nâu mẫu cấy cũng như hóa nâu môi trường nuôi cấy Tìnhtrạng này có thé trở nên nghiêm trọng đến mức mẫu cấy chuyên mau nâu sẵm/đen, hoại

tử cuối cùng là chết

Có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự sản sinh phenol trong suốt quá trình nuôicay đã làm cho mẫu và môi trường bị oxy hóa nên dẫn đến bị hóa nâu (Bhojwani và ctv,

2013) Mức độ hóa nâu phụ thuộc vào loài thực vật nuôi cấy, kiểu gene, độ tuổi của mô

cấy (mô già hơn cho thấy khả năng bị hóa nâu cao hơn), mùa nuôi cấy (nhiều hơn vàomùa đông và mùa thu) và thành phần của môi trường

Trong quá trình oxy hóa của phenol, các sản phẩm của quá trình này có thể là độc

tố đối với thực vật nuôi cấy Tinh trạng hóa nâu xảy ra tại vi trí mặt cắt ngay khi mẫu

được cắt và phenol được sản xuất liên tục trong suốt quá trình nuôi cây Những phenolnay trở nên độc hại với mẫu cấy bằng cách liên kết ngược với những protein bằng liênkết hydro và quá trình oxy hóa của chúng tạo thành các quinone có hoạt tính cao, cácquinone nay sau đó được polymer hóa va oxy hóa protein dé hình thành các hợp chatmelanin được gọi là polyphenol có thể là độc tố đối với thực vật Các enzyme oxy hóaphenol cũng có thé bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, sự hiện điện của ánh sáng

và nhiệt độ cao làm tăng tỷ lệ hóa nâu bằng cách tăng hoạt động của các enzyme này.Trong tự nhiên, các hợp chất phenol được biết là đóng một vai trò quan trọng đối vớithực vật trong đáp ứng với sự mất cân bằng các hormone thực vật, ngăn chặn, khángbệnh và bảo vệ các mô bị tôn thương do nhiễm trùng Các phenol này không chỉ có vaitrò trong phòng thủ, bảo vệ mà còn có thể đóng vai trò như chất nguồn cho tổng hợp

một số hợp chất khác như carbohydrate, amino acid và một số protein trong quá trình

biệt hóa phát sinh hình thai của thực vật (Dobranszki va ctv, 2010).

2.2 Giới thiệu về cây hoa đồng tiền

2.2.1 Giới thiệu chung

Cây hoa đồng tiền tên khoa học là Gerbera jamesonii, có nguồn gốc ở Nam Phi.Vào năm 1980, Lrwin Lynch tiến hành lai tạo lần đầu tiên các giống đồng tiền với nhau

và đã tạo ra được nhiều giống cải tiến Hoa đồng tiền là một trong 10 loại hoa quan trọngnhất trên thế giới, được du nhập về Việt Nam và trồng lần đầu tiên khoảng từ nhữngnăm 1940 Theo hệ thống học thực vật, cây hoa đồng tiền được phân loại như sau:

đa dạng Các giống hoa vốn được mang về từ Hà Lan hoặc Trung Quốc và được trồngnhiều nhất ở Việt Nam tại thành phố Đà Lạt, Lâm Đồng

2.2.3 Đặc điểm thực vật của cây hoa đồng tiền

Cây hoa đồng tiền thuộc loại cây thân thảo họ cúc, có cấu tạo bao gồm: thân, lá,

rễ, hoa và quả Thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa phát triển từthân Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 — 45°, hình dang lá thay đối theo giống

và sự sinh trưởng của cây, từ hình trứng thuôn đến hình thuôn dài, lá dài từ 15 — 25 cm,

rộng 5 — 8 cm, có hình lông chim, xẻ thùy nông và sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung.

Rễ thuộc dạng rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống, ăn ngang và nổi phía trên mặtluéng, rễ thường vươn dai tương ứng với diện tích lá tỏa ra Hoa đồng tiền do hai loạihoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là loại hoa tự đơn hình đầu; Hoa hình lưỡitương đối lớn mọc ở phía ngoài xếp thành một vòng hoặc vài vòng nhỏ, do sự thay đổihình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa, rất được chú trọng; Trongquá trình hoa nở, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự từ ngoài vào trong

theo từng vòng một Quả thuộc dạng quả bế lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, 1 gam hat

có khoảng 280 — 300 hạt.

2.2.4 Điều kiện sinh trưởng

Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây Nhưng khicường độ ánh sáng tăng lên vượt quá chỉ số tới hạn thì cường độ quang hợp của cây bắtđầu giảm Vì vậy, vào mùa nắng nóng hoa đồng tiền phải được trồng dưới lưới đen che

để giảm bớt cường độ ánh sáng, giúp cây hoa đồng tiền sinh trưởng tốt, phục vụ chomục đích thương mại Độ ẩm dat từ 60 — 70%, độ âm không khí 55 — 65% thuận lợi chocây sinh trưởng Hoa đồng tiền thích hợp với đất xốp nhiều mùn, thoáng khí và có pH

từ 6 — 6,5 Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định đến sự sinhtrưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng của cây hoa đồng tiền Đa số các giống hoađồng tiền được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ dao động từ 15 — 25°C,

và nhiệt độ tới han hơn 30 — 40°C nếu nhiệt độ < 12°C hoặc > 35°C cây sẽ phát triểnkém, mau sắc hoa nhot nhạt, dan đến chất lượng hoa xấu (Ngô Hoài Nam, 2011)

2.2.5 Những nghiên cứu về cây hoa đồng tiền

Vào năm 2008, Hasbullah cùng các cộng sự đã có nghiên cứu nhằm tối ưu hóatăng trưởng và phát sinh cơ quan của Gerbera jamesonii Bolus ex Mook f in vitro dékhảo sát tiềm năng tái sinh bang các cơ quan như lá, cuống lá và rễ, đã ghi nhận đượccác kết quả chéi bat định thu được từ các mẫu cuống lá trên môi trường nuôi cay MS bồsung 2 mg/L BAP và 0,5 mg/L NAA; Mau lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổsung 2 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BAP cho kết quả tốt nhất trong việc tạo mô sẹo; Mẫu rễđược phát hiện không có khả năng tái sinh trong tất cả các thí nghiệm

Vào những năm gần đây, hoa đồng tiền vẫn được quan tâm và chú trọng nghiêncứu phát triển, có khá nhiều nghiên cứu về cây hoa đồng tiền bằng nhiều kỹ thuật nuôicây mô tế bào thực vật khác nhau và nhiều khía cạnh nghiên cứu khác dé hoàn thiện vàphát triển giống hoa đồng tiền

Theo Trịnh Thị Kim Binh và ctv (2021), đã thực hiện nghiên cứu nhân giống invitro hoa đồng tiền bằng kỹ thuật cắt lát mỏng tế bào va ghi nhận kết quả sự kết hợp tốtnhất giữa NAA va BAP ở mức độ 0,5 — 0,5 và 0,5 — 1 mg/L tốt nhất trong quá trình hìnhthành mô sẹo từ mẫu lớp mỏng cuống lá hoa đồng tiền in vitro, ngoài ra còn ghi nhậnkết quả môi trường 1/2 MS bồ sung 0,5 mg/L kinetin đảm bảo cho sự phát triển của chéi

bình thường từ mô seo lát mỏng tế bào hoa đồng tiền và môi trường 1/2 MS bồ sung 1mg/L NAA cho khả năng hình thành rễ và cây hoàn chỉnh tốt nhất.

Vào năm 2022, Phan Thi Thu Hiền có nghiên cứu trên giống hoa đồng tiền cánhvàng giống cô (Gerbera jamesonii Bolus), đã công bố môi trường MS bồ sung 3 mg/L2,4-D là nồng độ tối ưu hình thành mô sẹo phôi hóa từ nụ non có tỷ lệ cao nhất là67,78%, thời gian xuất hiện là 14,43 ngày; Môi trường tối ưu cho quá trình tái sinh chồi

từ mô sẹo phôi hóa là MS bổ sung 2 mg/L Kinetin, cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 73,33%;Trên môi trường MS bồ sung 2 mg/L IBA, cho tỷ lệ ra rễ dat cao nhất 80,00%

Sau khi các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu tạo ra được những cây giống hoa đồngtiền hoàn chỉnh trong môi trường in vitro, họ cần có một môi trường dinh dưỡng và giáthé phù hợp dé hoa đồng tiền có thé sống và phát triển trong môi trường tự nhiên Hiệnđang có nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch dinh dưỡng và giá thể lên sự sinh trưởng,phát triển của cây đồng tiền với môi trường trồng ở chậu trong nhà, sử dụng hệ thốngtưới nhỏ giọt Lê Văn Hòa (2020), đã công bố kết quả dung dịch dinh duéng Johnsongiúp gia tăng chiều cao cây, số rễ, chiều dài hoa, đường kính hoa và kéo dài độ bền hoa

nở (12,9 ngày) Giá thé phân rơm hoặc mụn xơ dừa + phân rơm (tỉ lệ 1:1) có sử dụng hệthống tưới nhỏ giọt giúp gia tăng chiều cao cây, số lá, số rễ, tổng số hoa/cây, chiều dài

phát hoa và đường kính hoa.

2.3 Giới thiệu về nano bạc

2.3.1 Giới thiệu chung

Vật liệu nano là một loại vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thướcnanometer Chúng có nhiều đặc điểm nổi trội như kích thước đặc biệt <100 nm, tỷ lệ bềmặt/thê tích lớn, có tiềm năng phản ứng cao, tạo ra hiệu ứng bề mặt Plasmon (Tran Thị

Thu Hương, 2018).

Theo Trần Thị Thu Hương (2018), hai tính chất chung của vật liệu nano là hiệuứng kích thước và hiệu ứng bề mặt Hiệu ứng kích thước làm cho vật liệu có nhiều điểmkhác biệt hơn so với vật liệu truyền thống Mỗi vật liệu đều được quy định bởi một độđài đặc trưng được gọi là kích thước tới hạn Hiệu ứng bề mặt là do nguyên tử trên bềmặt có nhiều tính chất khác biệt so với tính chất của các nguyên tử ở bên trong lòng vậtliệu nên khi kích thước vật liệu giảm đi thì hiệu ứng có liên quan đến các nguyên tử bềmặt, hay còn gọi là hiệu ứng bề mặt tăng lên Kích thước hạt càng bé thì hiệu ứng càng

10

lớn và ngược lai Sự thay đổi đặc biệt về diện tích bề mặt là nguyên nhân khiến vật liệunano có giá trị cao và ảnh hưởng đến các thông số quan trọng như độ phản ứng bề mặt.

2.3.2 Một số cơ chế hoạt động của nano bạc trong vi nhân giống

2.3.2.1 Khả năng kháng khuẩn

Các đặc tính kháng khuân của Ag bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag”.lon này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan — thành phần cấu tạo nên thành tếbào vi khuẩn - ức chế khả năng vận chuyền oxy vào bên trong tế bảo dẫn đến làm tê liệt

vi khuẩn Nếu các ion Ag được lấy ra khỏi tế bao thì khả năng hoạt động của vi khuẩnlại được phục hồi Sau khi Ag* tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào gây bệnh, nó sẽ

đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sulfhydryl-SH của phân tử enzyme chuyểnhóa oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bao vi khuẩn.Các ion Ag” còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích củagốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA (Shrivastava và ctv, 2007)

2.3.2.2 Khả năng ức chế sinh tong hợp khí ethylene

Bạc (Ag) được thêm vào môi trường nuôi cấy như một chất bồ sung đề điều tiết sựphat sinh hình thái, tăng trưởng và phát triển của cây trồng dưới dạng ion Ag” trongmuối nitrate (AgNOs) và sulfate bạc (AgSO¿) thông qua quá trình ức chế sinh tổng hợp

khí ethylene.

Một mat, Ag có thể ngăn ngừa sự tổng hợp khí ethylene và làm dao lộn vùng bámdính của ethylene Thụ thé ETRI có thé liên kết với ethylene thông qua một trung tâmhoạt động là tiểu phần có 1 ion đồng (Cu') Sự thay thé Cu" bằng Ag* khiến cho thy thékhông thể liên kết với ethylene và ngăn ngừa các tín hiệu ức chế của ethylene lên thựcvật Điều này có thé là do sự giống nhau về kích thước, cùng trạng thái oxy hóa của cảion Cu" va ion Ag” trong việc tạo thành phức chat với ethylene (Zhao va ctv, 2002)

Mặt khác, polyamine đóng vai trò quan trọng trong thực vật như phân chia tế bào,phát sinh hình thái, sinh tổng hợp protein, nhân đôi DNA và giúp cây đáp ứng lại cáctác nhân stress sinh học Ethylene, các polyamine và SAM có mối tương quan chặt chẽ

Cả ethylene và các polyamine đều có chung tiền chất là SAM cho sự sinh tổng hợp củachúng, do đó, việc sử dụng những chat ức chế sinh tổng hợp ethylene như AgNO3 sẽkhiến cho SAM không đi theo con đường sinh tổng hợp ethylene, cũng đồng nghĩa vớiviệc SAM được chuyên hóa thành các polyamine nhiều hơn và tiến trình phát sinh hình

thái được kích hoạt (Kumar và ctv, 2009).

11

2.3.3 Một số nghiên cứu về AøNPs

Trong lĩnh vực nuơi cay mơ tế bào thực vật hiện nay thì việc sử dụng va thêmnano vào trong quy trình và mơi trường nuơi cấy khơng cịn là xa lạ nữa mà nĩ được tậndụng rất phổ biến nhờ các cơng dụng hiệu quả mà nĩ mang lại Đặc biệt, hạt nano bạc(AgNPs) được sử dụng nhiều và rộng rãi hon do đặc tính kháng khuẩn tốt của chúng.Cũng cĩ rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng kháng khuẩn này trong quy trìnhkhử trùng trong quy trình nuơi cấy mơ Như Pirtarighatet và ctv (2019), đã cơng bố trongquá trình đánh giá hoạt tính diệt khuẩn của các nano bạc được sinh tổng hợp cho thấychức năng ức chế cả vi khuân gram âm và gram dương; Đồng Huy Giới va ctv (2017),

sử dụng nano bạc làm chất khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ Điệp vàng thu được kết quảnơng độ thích hợp nhất là 125 ppm trong thời gian xử lý là 45 phút, thu được tỷ lệ sống

là 72,13%.

Ngồi khả năng kháng khuẩn hiệu quả cao, nano bạc cịn được biết đến với khảnăng cải thiện sinh trưởng, phát triển của thực vật khi được bổ sung vào mơi trường nuơicấy Được ghi nhận qua các kết quả của các nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vậtkhác nhau như: Razzaq va ctv (2016), nghiên cứu trên cây lúa mì đã khang định các hạtnano bạc cĩ tiềm năng nhất định đề tăng tốc độ tăng trưởng và năng suất cây trồng;

Lương Thiện Nghĩa và ctv (2017), nghiên cứu trên cây hoa cúc Morifolium ramat cv

với một số hệ thống mơi trường, đã ghi nhận được khi thêm các hạt nano bạc vào hệthống mơi trường microponic (mơi trường kết hợp vi nhân giống và thủy canh), khơng

chỉ cải thiện khả năng sinh trưởng mà cịn làm giảm hiện tượng mọng nước; Một nghiên

cứu khác trên giống lan Hồ Điệp Vang (Phalaenopsis sp.) của Đồng Huy Giới và BùiThị Thu Hương vào năm 2017, đã cho kết quả khi bổ sung vào mơi trường nuơi cấynhân chéi Hồ Điệp vàng từ PLB 4 ppm nano bạc cho hiệu qua tạo chéi tốt nhất (92,53%),

hệ số nhân chdi là 2,97 lần; El — Mahdy và ctv (2019), đã nghiên cứu trên cây chuối chorằng nồng độ thấp hon của ca AgNPs va AgNO; cĩ tác động tích cực đến sự phát triểncủa cây con cũng như hàm lượng sắc tố, trong khi nồng độ cao hơn bắt đầu cĩ tác dụng

ức chế

Một nghiên cứu về với mục đích đánh giá tác động của nano bạc đến quá trình phátsinh hình thái trên vật liệu là các mẫu lá in vitro hoa đồng tiền của Bùi Thị Thu Hương

và ctv (2018), đã đưa ra kết qua chỉ ra rằng mơi trường MS cĩ bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D

và 10 ppm nano bạc là mơi trường thích hợp cho việc tao sẹo với tỉ lệ tạo mơ sẹo cao

12

nhất đạt 95,56%; Môi trường MS có bé sung 0,7 mg/L BA; 0,1 mg/L IAA và 4 ppmnano bạc cho hiệu quả tái sinh chéi từ mô sẹo tốt nhất (84,45%); Môi trường MS có bổsung 3 mg/L BAP + 0,1 mg/L a- NAA và 2 ppm nano bạc cho hiệu quả nhân nhanh chéihoa đồng tiền tốt nhất, hệ số nhân chồi đạt 8,22 lần.

13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 6/2022 đến tháng 12/2023, tại Phòng Sinh học tích hợpthực vật (PIB), Khoa Khoa Học Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguồn mẫu

Vật liệu được sử dụng là mẫu lá và chồi đỉnh hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii)

in vitro được nuôi cay tai Phong Sinh hoc Tich Hop Thuc vat (PIB), Khoa Khoa HocSinh Hoc, Truong Dai hoc Nong Lam TP Hồ Chí Minh

3.2.2 Môi trường

Thí nghiệm sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bé sung

30 g/L sucrose Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm 2,4-D, BAP, NAA(Himedia) và nano bạc (Docneem) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng

độ khác nhau, tùy vào mục đích thí nghiệm Nano bạc (nano silver) được sử dụng là

nano bạc nguyên chất, nồng độ 1000 ppm, kích thước khoảng 25 nano mét

Môi trường sau khi được pha và định mức bằng nước cất được điều chỉnh pH bằngNaOH 1N va HCL 1% đến pH = 5,7 + 0,1 thì bố sung thêm 8 g/L agar Sau đó môitrường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm, trong thời gian 20 phút

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Mẫu được nuôi cấy trong phòng tăng trưởng với nhiệt độ 25 + 2°C, độ âm trungbình 60 — 65 % Mẫu được nuôi cấy trong môi trường tối hoàn toàn và môi trường chiếu

sáng l6 giờ/ngày với cường độ 2500 — 3000 lux.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự cảm ứng tạo mô sẹo

Vật liệu: Mau lá từ cây hoa đồng tiền in vitro 8 tuần tuổi được nuôi cấy duy trì trênmôi trường MS bổ sung 1 mg/L BAP va 0,1 mg/L NAA

Mục tiêu: Xác định ảnh hưởng của AgNPs đến sự hình thành mô sẹo

Phương pháp thực hiện: Chọn những mau lá non từ các chồi hoa đồng tiền in vitrokhỏe mạnh 8 tuần tuôi, lay từ lá thứ 3 tinh từ chồi đỉnh, có kích thước tương đồng nhau,mỗi chồi lấy từ 2 - 3 lá non dé làm thí nghiệm Sau đó, cắt phiến lá tại vị trí phần gần

14

cuống lá thành mảnh có điện tích khoảng 0,5 cm? nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS

+ 2 mg/L 2,4-D + 1 mg/L BAP, bé sung AgNPs (0; 1; 2; 3 ppm), đặt trong tối Cay

chuyên định kỳ 4 tuần trên cùng môi trường nuôi cấy

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toànngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 15 mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi ở các mốc thời gian 4, 6, 8 tuần gồm: Tỷ lệ mẫu hình thành

mô sẹo (%), tỷ lệ mô sẹo bị hóa nâu/chết (%), hình thái phát triển của mô sẹo

Số mau hình thành m6 sẹo

Tỷ lệ mô sẹo hình thành (%) = x 100

Tổng số mau ban đầu

Số mô sẹo bị hóa nâu

x 100

Tỷ lệ mô sẹo bị hóa nau/chét (%) =————— =

h = Tổng số mau ban đầu

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến sự hình thành mô

sẹo phôi hóa

Vật liệu: Mẫu là các mô sẹo lá có màu vàng nhạt, mềm được nuôi cấy 6 tuần trongmôi trường MS bồ sung 2 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BAP

Bang 3 1 Nong độ chất điều hòa sinh trưởng BAP (mg/L) và NAA (mg/L) được bổ

sung vào môi trường ở thí nghiệm hình thành mô sẹo phôi hóa

Nghiệm thức BAP (mg/L) NAA (mg/L)

Mục tiêu: Xác định được ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến sự hình thành

mô sẹo phôi hóa.

Phương pháp thực hiện: Mẫu mô sẹo được nuôi cay trên môi trường MS bổ sungBAP (0,5 — 1,5 mg/L) kết hợp voi NAA (0,1 — 0,3 mg/L) Cay truyền định kỳ 4 tuầntrên cùng môi trường nuôi cấy Các nghiệm thức như trong Bang 3.1

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thiết kế gồm 9 nghiệm thức và được bố trí theokiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 12 mẫu

Các chỉ tiêu theo đõi được ghi nhận sau 8, 12 tuần nuôi cấy bao gồm tỷ lệ hìnhthành mô sẹo phôi hóa (%), hình thái phát triển của mô sẹo

Ty lệ mô sẹo phôi hóa (%) =- 2 S$9P*ô'56— 199

Tổng mô sẹo ban đầu

3.3.3 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa3.3.3.1 Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa

từ lá in vitro

Vat liệu: Cac mô seo từ lá in vitro có hình thái màu vàng nhạt, mềm được nuôi cay

6 tuần trong môi trường MS bồ sung 2 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BAP

Mục tiêu: Xác định được ảnh hưởng của nano bac bồ sung vao môi trường nuôicay đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa và hình thành chdi

Phương pháp thực hiện: Chọn những mô sẹo có cau trúc mềm, màu vàng nhạt.Chuyên những mô seo này lên môi trường cơ bản MS + 3 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA,

bồ sung thêm AgNPs (nồng độ 0; 1; 2; 3 ppm), các nghiệm thức được thé hiện rõ trongBảng 3.3 Tất cả các nghiệm thức đều được cấy truyền định kỳ mỗi 4 tuần trên cùng môi

trường.

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức và được bồ trí theo kiểu hoàntoàn ngẫu nhiên, với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 12 mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa (%), tỷ lệ mẫu bị hóa

nâu/chết (%), ty lệ mẫu bị nhiễm (%) trong thời gian 6, 8 tuần

Tỷ lệ mô sẹo phôi hóa (%4) = 2Mserphoinoa + 100

Tổng rnô sẹo ban dau

Số mô seo bị hóa nau

x 100

Ty lệ mô seo bị hóa nâu/chết (%) = = = =

Tổng m6 seo ban đầu

Số mô seo bị nhiễm

Tỷ lệ mô sẹo bị nhiễm (%) = x 100

Tổng mô sẹo ban đầu

16