Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma cây bạch trầm hương (Aloysia virgata)

LỜI CẢM ƠNTrong quá trình thực hiện Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinhtrưởng đến khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma cây Bach Tram Hương Aloysiavirgata” em đã nhận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

KHAO SAT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN KHA NANG TAO MO SEO VA PHAT SINH PHOI SOMA

CAY BACH TRAM HUONG (Aloysia virgata)

Ngành hoc Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên

Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC: PHAM NGUYEN THANH PHƯƠNG: 19126138

: 2019-2023

TP Thu Đức, 03/2024

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SAT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG DEN KHA NANG TAO MO SEO VA PHAT SINH PHOI SOMA

CAY BACH TRAM HUONG (Aloysia virgata)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TÔN TRANG ÁNH PHAM NGUYEN THANH PHƯƠNG

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinhtrưởng đến khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma cây Bach Tram Hương (Aloysiavirgata)” em đã nhận được nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ

Trước hết em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Khoahọc Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện học tập vàrèn luyện tốt dé em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi đến ThS Tôn Trang Ánh sự biết ơn và kính trọng Cảm ơn cô đã tậntâm trao đôi, góp ý, truyền đạt kiến thức chuyên môn va đồng hành cùng em trong suốtquá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Quyên và các bạn sinh viên Phòng Nuôi

cay mô tế bào thực vat đã hỗ trợ, giúp đỡ để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã ủng hộ cả về vật chất và tình thần,động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Pham Nguyễn Thanh Phuong, MSSV: 19126138, Lớp: DH19SHA thuộcngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan:Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin

trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách

nhiệm trước Hội đồng về cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 thang 02 năm 2024

Người việt cam đoan

Phạm Nguyễn Thanh Phương

ll

TÓM TẮT

Bạch Tram Hương (Aloysia virgata) là loại cây bụi thân gỗ, có giá trị làm cảnhthường được trồng trong khuôn viên sân vườn hoặc trong chậu Bạch Trầm Hương đượcnhiều người yêu thích và tìm kiếm vì thích hợp với khí hậu nhiệt đới, cho hoa quanh

năm từ khi cây còn nhỏ và có mùi thơm ngọt dịu như mùi hạnh nhân dễ khuếch tán, hoa

ra nhiều thành chùm đẹp mắt Ngoài giá trị làm cảnh cây có chứa các thành phần đượcliệu hỗ trợ trong Đông y và y học hiện đại như điều trị các chứng khó tiêu, thấp khớp,hen suyễn, an than Vì có hương thơm đặc biệt nên Bạch Tram Hương còn có thé đượcdùng dé sản xuất nước hoa

Nghiên cứu này được tiến hành đề khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinhtrưởng đến khả năng tạo sẹo và phôi soma cây Bạch Tram Hương Thí nghiệm khảo sátnông độ chất khử trùng Ca(OC1) với mẫu lá cây, kết quả thí nghiệm cho thấy sau 2 tuầnnuôi cấy khi khử trùng ở nồng độ 15% trong 15 phút là thích hợp nhất, tỷ lệ mẫu sốngsạch có khả năng tái sinh đạt 64,93% Khi khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năngtạo mô sẹo, sau 6 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo sẹo đạt cao nhất trên môi trường MS bổ sung2,0 mg/l 2,4-D là 76,70% Sau 6 tuần nuôi cấy môi trường bô sung 2,0 mg/l 2,4-D kết

hợp với 0,25 mg/l NAA cho sự tạo mô sẹo tốt nhất với tỷ lệ tạo sẹo đạt 89,05% Mô sẹođược nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,4 mg/l TDZ va 1,0 mg/1 2,4-D tốt nhấtcho phát sinh phôi, sau 4 tuần nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi đạt 52,56% và số phôi trung

bình là 7,89 phôi/mẫu

Từ khóa: Aloysia virgata, mô sẹo, phôi, 2,4-D, NAA, TDZ.

il

Bach Tram Huong (Aloysia virgata) is a woody, ornamental shrub that is often grown in garden premises or in pots Bach Tram Huong is favored and sought after by many people because it is suitable for tropical climate, produces flowers all year round from the time the tree is young and has a sweet aroma like the smell of almonds that is easy to diffuse, flowers in beautiful clusters In addition to its ornamental value, the plant contains medicinal ingredients that support in Oriental medicine and modern medicine such as the treatment of indigestion, rheumatism, asthma, sedation Because of its special fragrance, Bach Tram Huong can also be used to produce perfumes.

This study was conducted to investigate the influence of growth regulators on callus formation ability and somatic embryos of Bach Tram Huong Experiment investigating the concentration of disinfectant Ca(OCl)2 with plant leaf samples, the experimental results showed that after 2 weeks of culture when sterilization at 15% concentration for 15 minutes is most appropriate, the percentage of clean living samples capable of regenerating reached 64.93% When investigating the effect of 2.4-D on callus formation ability, after 6 weeks of culture, callus formation rates were highest on

MS media supplemented with 2.0 mg/l 2.4-D was 76.70% After 6 weeks of culture, 2.0 mg/1 2.4-D was supplemented with 0.25 mg/l NAA for the best callus tissue formation with a callus formation rate of 89.05% Callus tissue cultured on MS media with the addition of 0.4 mg/l TDZ and 1.0 mg/1 2.4-D was best for embryogenesis, after 4 weeks

of culture the embryogenesis rate reached 52.56% and the average number of embryos was 7.89 embryos/sample.

Keywords: Aloysia virgata, callus, somatic embryogenesis, 2.4-D, NAA, TDZ.

IV

MỤC LỤC

Trang

OES kuaeergeargrrrrrryểrrggtryattrrtrgigteyayaatryggaeyrasyoasgprssweg iRAG NHẬN VA CAM DOAN vececcerccesicesemeremmveneinnnnnonmenne navacaewenmmnensl ii

an iii

ABSTRACT oocceccssssssessssssessesssessessussissssssessnssnsssetinssisssessietisssssisssssssesessessessetssessesseeses iv MỤC LỤC 2.552 52 S1 2E22E122122112112211211211111211 1111211112112 21211 Vv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮTT -222+222E22EE+2E2EE2EE22EE22E2222222222222xee vii

DANH SÁCH CÁC BẰNG ercccecccre:creeunermrenormenncemierennneeennneenes viii

fete | ee ixCHƯƠNG 1 MO ĐẦU -.- 2-52 2S2E22E22122122121221121212121211212121212121 21 re |Ih ỐC 11.2 Mục tiêu đề tài: -2- 222221 2221221211212212112121211211121121121211212121121211121 1e re |

LS INOVGUNG ti ICN? nero ree 2

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU 2-52 +S2SS2EE2E£EE£EEEE£EEEEEEEEEEEErErrxrrxee 32.1 Tổng quan về cây Bạch Trầm Huong - csccsccsesssessesssessessessessesssessessesseeseesses 3

2 Misdie ant lơại PHHG Vat gas gian lõi RE HH GGGSER ĐfSEEbVJARLSENNGSagllkdlftjiBisSiEtifuSMitogbsbafisgpftagiGimcssa 3

2.1.2 PRA D6 a 32.1.3 Đặc điểm thực vật học -2- 222221 2322221221211212112112121121121112111112 221 re 32.1.5 Giá trị kinh tế và giá trị được liệu -22- 2+ ©2+©2z+2xtEzetrrerrerrrerrrrrrrrxee 5

2.16 Cas HEIST CU, HIẾN QUAM soxssssesessrrsiiienooiaatiESE.838001385850101033455814803E00030110910.93 180 5

2.2 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô thực Vat ees eesecsessessessesseesesseeseeseeseeneess 62.2.1 Khái niệm và cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật - 62.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật -2¿-2¿22zz+2z+zz+zzz>x2 72.2.3 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bao thực vật -2-2- 82.2.4 Sự hình thành và phát triỀn mô sẹo -2- 2-2 22E2SE+2E£EE22E22E22EZE.zEzxezed 9

2.2.5 Sự phát sinh và biệt hóa mô của phôi vô tính - 5<++-<£++e<<+ecezxx 10

2.2.6 Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cay mô tế bảo thực vật -2- + s+cs+zzzszrxzes 112.2.7 Tình hình nghiên cứu in vitro về chỉ AlOysid cccccccccccesscsseesseectessesstesseeeeeseeees 13CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5 c5ccccccccccreerrciee 153.1 Thời gian và địa diém nghiên cứu - 2+ 22©2++22++2E++£EEtEExvErxrrrrrrrrsrrrres 15

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên CỨU ce cece +52 *S2*22*+2E*2E£2E£erErrrrrerrrke 15

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2 2¿+22221+2E+22E2211251221221122122112112211211211212 xe 153.2.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy -:- 2+ 2¿+2++22++22++2z++trxstrxzzrrsrrree 153.2.3 Thiét bi va dung cu thi nghigm nw eee 153.2.4 Điều kiện 2060 C89 cnncusssansimenoumonsnnmmanmammvennmmannmmnmanmnen 16

3:3;.Phươneg:phấp nghiỀn gỨU: -<ss-xscsesesosiedetstsdsdetsbdgistointogaupsuigijindbcdSLE0I3UGG10200a9310g667046 16

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dich Ca(OCI)2 khử trùngmau lá cây Bạch Trầm Hương -2- 2222 ©222S22EE2SE2EE£EEE2EE2EE2EE2EEEEEZEErrxrrrrrrer 163.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nồng độ 2.4-D lên sự hình thành

mô sẹo từ mẫu lá vô trùng cây Bach Trầm Hương - 2-2 52+22222+2E+2zzzzzze2 173.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với nồng độ NAAlên sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá vô trùng cây Bach Tram Hương - 173.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo phôi soma

từ mô sẹo của lá cây Bạch Trầm Hương 2-2-2222 ©2222E22E2EEcEErrxrrrrerer 18

31 Phương pháp sử 19 86 TẾ ceeeeeeseeneseseenoebcooooieihgtsti/21s03-0609009100001001890300000:0E 19CHƯƠNG 4 KẾT QUA VÀ THÁO LUẬN eeisiiieeieiiiekisreceske 204.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ca(OC])a khử trùng mẫu lá cây Bạch Trầm

4.2 Khao sát ảnh hưởng của nồng độ nồng độ 2,4-D lên sự hình thành mô seo từ mẫu

lá vô trùng cây Bach Trầm Hương - 2 2 ©22221+2E22EE2EE22E2221221222E221 222v 24.3 Khao sát anh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với nồng độ NAA lên sự hình thành

mô seo từ mẫu lá vô trùng cây Bạch Trầm Hương -2 22©22222255+225z+2 254.4 Khao sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến kha năng tạo phôi soma từ mô sẹo của

là cây Bạch Trâm HữƠHDscsoceesuenskiiikootiSddogii kinh gÀI1S5G31034045015616140011003400000g01613.5086 28CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ . - 22©2222xccreErxerrrrrrrerrrres 315.1 Kết luận 2-2-2 Ss 2122122122121221221111111111111111111111111111111 21111 ereg 31

210 aaỪ, 31MIG 2 TST || 3, ¡8 3 TP ẻẺố.ố ốẻ 32

PHỤ LỤC

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

24-D : 2,4-dichloropenol acetic acid

ANOVA : Analysis of Variance

Ctv : Cộng tác viên

cv : Correlation of Variance

IAA : indol acetic acid

IBA : indol butyric acid

MS : Murashige va Skoog

NAA : a-naphthylacetic acid

TDZ : Thidiazuron

vii

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

; Trang Hình 2.1 Cây Bạch Tram Hương (Aloysia virgata) - ¿- 555 +++<<+v+eexseeeeeesers 3

Hình 4.1, Các trạng thấi miẫu gau khÍ HÙNG se cnnccscnsnsaironcencarsncenesnonsenenienennarnanesianvovese 21

Hình 4.2 Mô sẹo bổ sung 2,4-D sau 6 tuần nuôi cấy =5 23Hình 4.3 Mô sẹo bồ sung 2,4-D kết hợp NAA sau 6 tuần nuôi cấy - 26Hình 4.4 Hình dạng phôi sau 4 tuần nuôi cấy 2- 2 2222222222z22zz2z+2zxze 29

1x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bach Tram Hương (Aloysia virgata) là loài thực vật thuộc họ Cỏ roi ngựa

(Verbenaceae) gồm khoảng 90 chi và gần 2000 loài Trong đó, chi Aloysia được ứng

dụng rộng rãi trong y học cổ truyền, y học hiện đại và làm cảnh Bạch Tram Hương hỗtrợ điều trị các chứng khó tiêu, hen suyễn, thấp khớp, động kinh, rối loạn lo âu

Bạch Trầm Hương có xuất xứ từ Argentina, du nhập đến Việt Nam trong nhữngnăm gần đây Xuất phát từ tính tò mò về mùi hương, vẻ đẹp và hình dáng lạ mắt màBạch Trầm Hương đang được tìm kiếm khá sôi nổi trên thị trường Bên cạnh đó, BạchTrầm Hương còn đang được chú ý nghiên cứu về các hoạt chất (16R)-16,17,18-trinydroxyphyllocladan-3-one và (16R)-16,17-dihydroxyphyllocladan-3-on chống tramcảm, rối loan cảm xúc (Cristina Wasowski va ctv, 2011)

Ở nước ta, nguồn cây giống được ươm trồng chủ yếu ở miền Trung và miền Nam.Các nhà vườn nhân giống Bạch Trầm Hương chủ yếu bằng phương pháp giâm cành.Tuy nhiên, phương pháp này có hệ số nhân giống thấp, cây dé bị thoái hóa, dé nhiễmbệnh, đồng thời tốn nhiều thời gian, công sức và không đủ cung cấp số lượng giống nếu

trồng trên quy mô lớn do đó nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những phương

pháp tốt nhất hiện nay dé giải quyết những khó khăn ké trên Nuôi cấy in vitro được ứngdụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam với nhiều loài thực vật khác nhau Đối với cácloài cây thân gỗ việc nhân giống in vitro theo phương pháp cutting khó có hệ số nhângiống cao, vì vậy việc nuôi cấy tạo mô sẹo, phát sinh phôi soma sẽ giải quyết khó khăn

kể trên Phương pháp này có thé tạo ra quan thé cây con đồng nhất về mặt hình thái, ditruyền và hệ số nhân giống cao có khả năng sản xuất một số lượng lớn

Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên đề tài “Ảnh hưởng của chất điều hòasinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma cây Bạch Trầm Hương

(Aloysia virgata)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu đề tài:

Xác định được nồng độ dung dịch Ca(OC]); khử trùng thích hợp nhất

Xác định được nồng độ 2.4-D thích hợp để tạo mô sẹo

Xác định được nồng độ 2,4-D kết hop với nồng độ NAA thích hợp dé tạo mô sẹo.Xác định được nồng độ TDZ thích hợp đề phát sinh phôi soma từ mô sẹo cây Bạch

Tram Huong.

1.3 Nội dung thực hiện:

Nội dung 1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo sẹo từ mẫu

lá cây Bạch Tram Hương

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Ca(OC])z khử trùng mẫu

lá cây Bạch Tram Hương

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng hình thành môsẹo từ mẫu lá vô trùng cây Bạch Trầm Hương

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với nồng độ NAAlên khả năng hình thành mô sẹo từ mẫu lá vô trùng cây Bạch Trầm Hương

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo phôi soma từ

mô sẹo của mau lá cây Bach Trâm Hương.

N

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về cây Bạch Tram Hương

Loài : Aloysia virgata

Tén Tiéng Viét: Bach Tram Huong

Tén Tiéng Anh: Sweet Almond Bush

Hinh 2.1 Cay Bach Tram Huong

(Aloysia virgata): (a) Cây; (b) Hoa; (c) Mat sau lá; (d) Mat trước lá.

2.1.2 Phân bố

Aloysia virgata là loài cây thân gỗ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, Argentina Hiện nay

đã du nhập đến nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam Ở nước ta Bạch Tram Hươngđược trồng nhiều ở Đà Nẵng, Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp (Đàm Trung, 2023).2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Bạch Tram Hương là cây thân gỗ, thân cây mảnh, mau nâu nhạt nếu dé cây pháttriển tự nhiên có thể cao hơn 4 m và tán rộng hơn 3 m Thân cây phân nhánh nhiều, cành

mảnh Thân non có màu xanh xám và có lớp vỏ mịn, khi già thân có xu hướng hóa gỗ

vỏ nhám màu xám sam

Lá Bạch Tram Hương có màu xanh đậm hình trứng, có nhiều gân nỗi rõ, mép córăng cưa, mọc đối nhau dọc theo cành Hai mặt của lá có một lớp lông mịn

Hoa Bạch Tram Hương có màu trắng thường mọc thành chuỗi dài, hơi rủ Hoa nở

quanh năm, có mùi thơm ngọt, dịu nhẹ (Đàm Trung, 2023).

2.1.4 Cách nhân giống và chăm sóc

Hiện nay ở nước ta các tài liệu chính thức nghiên cứu nhân giống về giống cây nàyvẫn chưa có, hầu hết việc trồng cây Bạch Trầm Hương đều là nhờ vào kinh nghiệm lâu

năm của những người nông dân Theo Toàn (2023), nhân giống Bạch Trầm Hương bằng

các hình thức sau:

2.1.4.1 Nhân giống bằng hạt

Chuẩn bị đất trồng: Cây Bạch Trầm Hương không kén đất, nhưng đất trồng cần tơixốp, thoát nước tốt Có thê trộn đất với trau, xơ dừa, tro trau dé tăng độ tơi xốp và thoátnước cho đất

Ngâm hạt: Ngâm hạt Bạch Trầm Hương trong nước ấm khoảng 24 giờ trước khigieo Điều này giúp hạt nhanh nảy mầm

Gieo hạt: Gieo hạt Bạch Trầm Hương vào đất, lấp đất phủ kin hạt Giữ ầm cho đất

cho đến khi hạt nảy mầm

Chăm sóc cây con: Khi cây con cao khoảng 10 em, có thê tiến hành cấy cây convào chậu hoặc trồng trực tiếp xuống đất

2.1.4.2 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành

Chuẩn bị cành giâm: Chọn cành giâm dài khoảng 15 - 20 em, có nhiều lá Cànhgiâm nên lấy từ cây mẹ khỏe mạnh, không bị sâu bệnh

Cắt cành giâm: Cắt cành giâm, loại bỏ lá ở phần gốc Chẻ đôi một đoạn thân cây,đặt cành giâm vào phần thân đã chẻ Dùng dây buộc chặt cành giâm vào thân cây

Chăm sóc cành giâm: Đặt cành giâm ở nơi râm mát, tưới nước giữ âm cho đất Sau

khoảng 1 - 2 tháng, cành giâm sẽ ra rễ và phát triển thành cây mới

2.1.4.3 Cách chăm sóc

Cây Bach Tram Hương là loài cây dé trồng, dé chăm sóc Cây có thé chịu đượcđiều kiện khô hạn, nhưng tốt nhất nên tưới nước thường xuyên, đặc biệt là vào mùa khô.Nên tưới nước vào sáng sớm hoặc chiều mát tránh tưới nước ban đêm, khiến cây bị úng

Cây nên được trồng trên đất mùn, thoát nước tốt (pH 6,5 - 7,5) Cây van có thésinh trưởng trên đất nghèo dinh dưỡng va đất phén

Cây Bạch Trầm Hương không cần bón phân nhiều Có thể bón phân cho cây định

kỳ 1 - 2 tháng/lần, sử dụng phân hữu cơ hoặc phân chuồng hoai mục

Cây Bạch Trầm Hương có thê bị sâu bệnh tấn công, đặc biệt là sâu cuốn lá Nênthường xuyên kiểm tra cây dé phát hiện sớm và xử lý kịp thời khi cây bị sâu bệnh

2.1.5 Giá trị kinh tế và giá trị dược liệu

2.1.5.1 Giá trị kinh tế

Bach Tram Hương được trồng dé trang trí sân vườn Vì có thé phát triển thành bụilớn, cho hoa quanh năm nên được nhiều người ưa thích Giá bán của cây Bạch TrầmHương giao động từ 250.000 đến 2.800.000 vnđ/cây Giá bán của cây phụ thuộc vào

kích thước, ngoại hình bên ngoài và chậu đi kèm với cây.

2.1.5.2 Giá trị dược liệu

Bạch Trầm Hương có tác dụng điều trị tiêu chảy, thấp khớp, khó tiêu và làm chấtdưỡng âm (Pascual và ctv, 2001)

Vandresen và ctv (2010) đã phân lập được 14 hợp chất hóa học từ lá cây BạchTram Hương (Aloysia virgata) và thử nghiệm hoạt tinh kháng khuẩn đối với 4/14 hợpchất bao gồm hoffmaniacetone va acetate của nó, phenylethanoid verbascoside,arenarioside Kết quả cho thấy phenylethanoid verbascoside, arenarioside có hoạttinh chống lại Staphylococcus aureu, Micrococcus luteus gây phù nề với tỷ lệ ức chếkháng viêm đáng kẻ

Cristina Wasowski và ctv (2011) đã phân lập được hai diterpens trong cây Bạch

Tram Hương (Aloysia virgata), hai hợp chat này có khả năng điều chỉnh sự lo lắng, đóngvai trò quan trọng trong việc điều chế thuốc giảm lo âu

Năm 2022, Maria Luisa Kennedy va ctv xác minh được tính an toàn của các hop

chất chiết xuất từ cây Bach Tram Huong (Aloysia virgata) Apv(50, 100, 200, 400mg/kg) Kết quả cho thay các hợp chất này ảnh hưởng đáng kể đến hành vi va thời gianngủ, cũng như khả năng giảm lo âu và không gây chết trên chuột

Khi đánh giá tiền lâm sảng các hợp chất verbascoside, hoffmaniaketone, nepetinchiết xuất từ hai loài Aloysia cho kết quả khả quan, có tác dụng chống tram cảm trên

chuột sau 7 ngày theo dõi (Teresa Taboada và ctv, 2022).

2.1.6 Các nghiên cứu liên quan

Dương Tan Nhựt va ctv (2012) đã khảo sát ảnh hưởng của TDZ và 2,4-D lên khanăng phát sinh phôi vô tinh từ mẫu lá Dâu tây “Mỹ Hương” (Fragaria sp.) Kết quả chothấy ở nghiệm thức có chứa 1,0 mg/l TDZ kết hợp với 0,2 mg/1 2,4-D cho sự hình thànhphôi là cao nhất (48,83 phôi/mẫu) Cây có nguồn gốc từ phôi sinh trưởng và phát triển

bình thường ở điêu kiện vườn ươm.

Năm 2016, Liu và ctv thực hiện nghiên cứu tạo sẹo trên Orostachys fimbriata Kếtqua thu được ở thí nghiệm khi bổ TDZ vào môi trường thúc day sự hình thành seo ở láOrostachys fimbriata cho cảm ứng tạo sẹo tốt nhất khi bé sung 0,5 mg/l TDZ đạt 100%.

Năm 2018, El-Banna đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lênkhả năng tạo mô sẹo trên cây Aloysia triphylla (cùng chi Aloysia) cho thay môi trường

MS bồ sung 1,5 mg/l 2,4-D có tỷ lệ tạo sẹo cao nhất đạt 91,7%

Khuất Thị Mai Lương và ctv (2019) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào déduy trì, lưu trữ và phát triển các giống sâm Ngọc Linh, sâm Lai Châu, sâm Vũ Diệp, tamthất hoang Môi trường MS + 0,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo từ môchồi mam và MS + 1,0 mg/1 2,4-D thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo từ mô củ các mẫusâm nghiên cứu Tỷ lệ phôi soma tạo thành cao nhất trên môi trường MS bổ sung 1,0

mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,5 mg/1 TDZ trên mẫu sâm Ngọc Linh, sâm Lai Châu và

sâm Vũ Diệp Riêng đối với mẫu tam thất hoang nồng độ TDZ giảm xuống 0,3 mg/l đạthiệu quả tạo thành phôi soma cao nhất

Khi khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sự tạo sẹo từ lá cây Nhàu Kết qua

thu được khi bổ sung riêng lẻ 2,4-D ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần đều cảm ứngtạo seo 100%, ở nghiệm thức bồ sung 1 mg/l 2,4-D cho cảm ứng seo và phát triển nhanh

hơn các nghiệm thức còn lại (Nguyễn Hoàng Nhật Trinh và Lương Thị Lệ Thơ, 2019)

2.2 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

2.2.1 Khái niệm và cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp nhân giống đượcthực hiện bằng nuôi cấy mô cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trường đinhdưỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và được kiểm soát Vì vật liệu nuôi cay thuong ratnhỏ và thực hiện trong môi trường nhân tạo nên phương pháp nhân giống này còn đượcgọi là vi nhân giống hay nhân giống in vitro (Ngô Xuân Bình và ctv, 2003)

Cơ sở khoa học của nuôi cay mô tế bao thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào.Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tễ bào bất kỳ của một

cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cơ thé hoànchỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích

hợp, mỗi tế bào đều có thê phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh (Ngô Xuân Bình và

ctv, 2010).

Sự phân hoá và phản phân hoá cũng là cơ sở quan trọng trong nuôi cấy mô tế bao

Co thé thực vật trưởng thành là một thé thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng,tất cả các loại tế bào đó đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh và được tạo nên bởi quátrình phân hóa Đó là sự chuyên các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá,đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể (Vũ Văn Vụ, 2005)

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các mô chức năng chúng không hoàn toànmất đi khả năng phân chia của mình Nếu tách một tế bào hoặc một nhóm tế bảo ra khỏi

cơ thể và nuôi cấy chúng trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại quaytrở lại dạng tế bào phôi sinh ban đầu và lại có khả năng phân chia mạnh mẽ và phân hóa

dé tái sinh cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là phản phân hoá (Phan Hữu Tôn, 2005).2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Ngô Xuân Bình (2010), có một số phương pháp nuôi cấy mô thực vật sau:2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Phương pháp thuận lợi có thé đạt được mục tiêu trong nuôi cay mô tế bào thực vật

là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên) Sau khi

vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng saumột thời gian nuôi cấy nhất định, phát triển thành một chổi hay nhiều chdi, tiếp tục vươn

dài thành thân, lá, ra rễ dé trở thành các cây hoàn chỉnh

2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy nhiều auxin, mô sẹo được hình thành Môseo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng Trong môi

trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc

độ điều chỉnh thích hợp Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất hỗ trợtách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trongmôi trường đặc biệt và tăng sinh khối Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thốngnuôi cay vi sinh Với các chất phù hợp được bồ sung vào môi trường, tế bào có khả năng

sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid) Sau một thời gian nuôi cấy kéo

dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bàođơn được phát triển thành từng cụm tế bao mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thé

tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp.

2.2.2.4 Nuôi cấy tế bào trần

Tế bảo trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duytrì đầy đủ các chức năng sẵn có Khi mat thành tế bào, hai tế bào trần có khả năng dunghợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng Quá trình dunghợp tế bào trần có thê thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài Ở trạng tháikhông có màng tế bào bao bọc, tế bào trần đễ dàng hấp thu các ADN ngoại lai mang cácđặc điểm di truyền khác nhau từ đó có thể cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất vàchất lượng cây trồng

2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phan

Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường đinhdưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóatạo thành cây lưỡng bội Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trongviệc tạo ra các dòng, giống thuần chủng ở các cây tự thụ phan vì đã rút ngắn được thờigian tạo ra giống mới

2.2.3 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.3.1 Giai doan chuẩn bị

Giai đoạn này được xem như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi

cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bồ tự nhiên hoặc ra khỏi các khu khảo nghiệm

dé chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh và tạo điều kiện chủ động

về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy Trong điều kiện cần thiết có thể tác động cácbiện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống hoặc thụ phan nhân tạo cho những loài rất khó thụphan trong điều kiện tự nhiên (Đoàn Thị Mai va ctv, 2011)

2.2.3.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động

Giai đoạn khử trùng mẫu dé đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Kết quả của giai đoạnnày phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy và xử lý mẫu Ngoài ra còn tùy thuộc vào mục đíchđối với từng loại cây khác nhau đề nuôi cấy cho phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn đúng

mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chéi ngọn, đỉnh chồi náchsau đó là đỉnh chéi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá Mẫu cần phải khử trùng

trước khi đưa vào nuôi cấy để loại bỏ các vi sinh vật bám trên và bên trong bề mặt mẫucay Chon đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại ty lệ sống cao, đồng thời chọn môitrường dinh dưỡng thích hợp sẽ giúp đạt được tốc độ tăng trưởng nhanh Các chất khử

trùng thường sử dụng là: HgC]; 0,1% xử lý trong 5 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OC]; 5 7% xử lý trong 15 - 20 phút, HaOa, dung dich Brom (Duong Công Kiên, 2003).

-2.2.3.3 Giai đoạn tạo chéi và nhân nhanh choi

Trong giai đoạn này, vai trò của chất điều hoà sinh trưởng là cực kỳ quan trọng désản sinh ra lượng chồi tối đa mà vẫn dam bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệunuôi cấy (Trần Thị Lệ và ctv, 2008)

2.2.3.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh

Tạo rễ là giai đoạn quan trọng dé có được cây con hoàn chỉnh Khi tạo rễ cần loại

bỏ các chất kích thích tạo chôi, phân chia chéi và thay vào đó là một số auxin kích thíchtạo rễ Tuỳ theo loài cây mà sử dụng loại và nồng độ auxin cho phù hợp Thông thườngcác chất IBA, NAA, IAA với hàm lượng từ 1 - 5 mg/1 thích hợp trong quá trình kíchthích tạo rễ cho nhiều loài cây thân gỗ Một số trường hợp đặc biệt nếu chéi tạo đượcquá nhỏ và ngắn, có thé sử dụng 1 - 5 mg/l GA3 và một số hợp chất hữu cơ như nướcdừa non Bồ sung vào môi trường dé đạt tiêu chuẩn cây con trước khi chuyền sang khuhuấn luyện (Đoàn Thị Mai va ctv, 2011)

2.2.3.5 Giai đoạn đưa cây ra đất

Giai đoạn cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trìnhnhân giống in vitro và là bước quyết định kha năng ứng dụng quá trình này trong thựctiễn sản xuất

2.2.4 Sự hình thành và phát triển mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bảo không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quanphân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởngthực vật) Các tế bào thuộc mô hoặc cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phảichịu sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên Sự phản phân hóa này rất quan

trọng, quá trình này cho phép một tế bào trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (Nguyễn Đức

Lượng, 2002) Sự trẻ hóa này giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi somatrong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987)

Nhìn chung, sự tạo mô seo in vitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình Dau tiên,

sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bàonhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi Tiếp theo, sự phân chia các tế bào tượng tầngđược thực hiện Cuối cùng, các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) sẽ bị xáo trộn(Hunault, 1979) Màu sắc của các mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôicay khác nhau, hay các bộ phận khác nhau va chúng thường có màu vàng, trắng, nâuhay trắng xanh Tùy từng loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong môitrường nuôi cấy là những yếu tô ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Môsẹo thường được hình thành môi trường giàu auxin, có thể dùng auxin riêng lẻ hoặc kếthợp với nhau hoặc kết hợp với cytokinin tùy từng loại cây Hàm lượng hormone nội sinh

và chiều di chuyên của các hormone này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự tạo môsẹo Vì vậy, nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi

cay sé anh huong đến sự tao mô seo dẫn đến các phản ứng khác nhau của mẫu cay (Tran

Văn Minh, 2003) Trong quá trình phát triển mô seo thường xuất hiện hai loại tế bào Tếbao của mô sẹo xốp, có không bào to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng Tế bào của mô sẹorắn, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc Mô sẹo cay chuyén cang nhiéu

thi kha nang tai sinh cang giam.

2.2.5 Su phat sinh và biệt hóa mô của phôi vô tính

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh trưởng hay phôi thể hệ cũng chỉ là một kháiniệm dé mô tả một cau trúc lưỡng cực bắt định bao gồm cực chéi và cực rễ, mà dướiđiều kiện thích hợp có thích hợp có thê phát triển thành cơ thể có chức năng hoàn chỉnh(Dương Tan Nhựt, 2007) Phôi vô tính có thé hình thành từ một tế bao đơn hay một cụm

tế bào Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởngthành và phát triển thành cây con (Maheswran và ctv, 1986)

Phát sinh phôi vô tinh là quá trình từ một hay một nhóm tế bao sinh dưỡng có théphát triển thành cấu trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính và không có liên kết mao mạchvới té bào gốc ban dau Đối với phôi thực vật hai lá mầm thì sau giai đoạn tiền phôi sẽ

là giai đoạn phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình thủy lôi, phôi trưởng thành và giaiđoạn phôi hai lá mầm như phôi hữu tính Phôi của thực vật một lá mầm sẽ trải qua giai

đoạn hình câu, bao lá mâm và lá mâm Sự tạo cơ quan phôi một lá mâm cơ bản giông ở

10

cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số điệt tử (một hay là hai) hay tính đối xứng của phôi(một hay thay vì hai mặt phẳng đối xứng như ở hai lá mam) (Dương Tan Nhựt, 2007).

Sự hình thành phôi vô tính thông qua hai con đường là trực tiếp và gián tiếp Trongcon đường hình thành phôi vô tính trực tiếp, các phôi được hình thành trực tiếp từ mộthoặc một nhóm tế bào mà không qua quá trình tạo mô sẹo Trong trường hợp này vẫn

có sự hình thành mô sẹo trên bề mặt mẫu nuôi cay nhưng mô seo tang sinh không dang

kể và xuất hiện trước sự hình thành phôi Nếu mô cấy có các tế bào phôi hợp tử đã cósẵn chương trình biéu hiện của các gen, thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bao là

đủ dé hình thành phôi (Dương Tan Nhựt, 2007) Phát sinh phôi gián tiếp là quá trìnhphôi vô tính được phát sinh thông qua mô sẹo và thông thường mô sẹo sẽ tăng sinh đồidào trước khi được cảm ứng hình thành phôi Những tế bào đã phân hóa, không còn khảnăng sinh phôi thi chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp đưới sựcảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập đi vào con đường sinh phôi (BùiTrang Việt, 2002; trích bởi Dương Tan Nhựt và ctv, 2007)

2.2.6 Yếu tố ảnh hướng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.6.1 Điều kiện vô trùng

Trong toàn bộ quá trình nuôi cay in vitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối.Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp

2.2.6.2 Dung dịch khử trùng

Dé khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường sử dụng các dung dịchnhư: HgCh, NaCIO (hypoclorit natri); Ca(OC1)2 (hypoclorit canxi); H2O2 (oxy già) Cồndùng dé khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

2.2.6.3 Sự nhiễm mẫu

Môi trường hoá học nuôi cấy mẫu rất giàu các chất hữu cơ và vô cơ nên cũng ratthuận lợi cho nắm bệnh và vi khuẩn phát triển (Dương Công Kiên, 2002) Mẫu cay đượcsống trong điều kiện môi trường tự nhiên nên có rất nhiều mầm bệnh, nguồn bệnh cóthé tiềm ấn ngay trong mau cấy, trong bình cấy, ống nghiệm, môi trường nuôi và dụng

cụ cay Mặc du trước khi cấy mẫu được khử trùng nhưng chỉ tiêu diệt được các vi sinhvật nam, còn mẫu cấy bị nhiễm vi rút thì rất khó loại trừ Vì vậy khi sử dụng mô phânsinh đỉnh sinh trưởng dé nuôi cay do vùng này chưa bị vi rút xâm nhiễm cũng như chưa

phân hoá mô dân truyền nên mâu cây vừa sạch vi rút và vi khuân Có thê sử dụng một

11

số chất kháng sinh dé diệt vi khuẩn và nam, song cũng chính các chất này có thé gây hạicho mẫu cấy (Đoàn Thị Mai và ctv, 2009).

2.2.6.4 Vật liệu nuôi cấy

Vàề nguyên tắc mọi tế bào của mô chuyên hoá như thân, rễ, lá, chồi Trên cơ thé

sinh vật đều có khả năng làm vật liệu nuôi cấy Tuy nhiên, thực tế cho thấy tuỳ từng loại

tế bào và các loại mô khác nhau mà mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Vật liệunuôi cấy ở giai đoạn non tốt hơn giai đoạn già, mức độ tinh khiết càng cao thì hiệu quảnuôi cấy thành công càng cao Khi lấy mẫu làm thí nghiệm nuôi cấy cần chú ý đến cácyếu tố như mùa vụ lay vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây me, VI tri lay mẫu trên cây

mẹ và dòng cây mẹ (Trần Thị Lệ và ctv, 2008)

2.2.6.5 Chất điều hòa sinh trưởng

Nhóm Auxin: là Phytohocmon đầu tiên được phát hiện vào năm 1934, có tác dụngkích thích sinh trưởng, kéo dai tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liênquan đến làm chuyên đổi và mềm hóa màng tế bào Các auxin được bổ sung vào môitrường nuôi cây nhằm thúc day sự sinh trưởng và dan nở tế bào, tăng cường quá trìnhsinh tổng hợp và trao đổi chất Auxin kích thích sự hình thành rễ bất định theo cơ chế,

nó hoạt hóa các tế bào vùng xuất hiện rễ để tạo nên mầm rễ bắt định, sau đó các mầm rễsinh trưởng dài ra thành rễ bat định Ngoài ra auxin còn tham gia các phản ứng sinh phôi

vô tính (Bhojwani S.S, 1983) Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô

là: IAA (Indol axetic acid), NAA (Naphthyl acetic acid), 2,4-D (2,4-Dicloro phenoxy

axetic acid) và IBA (Indol butyric acid) Nồng độ auxin dùng trong nuôi cấy dao độngtuỳ từng chat và đối tượng nuôi cay nhưng thường trong khoảng 0,001 - 10 mg/l

2,4-D là một auxin tổng hợp thường được sử dụng dé kích thích sự hình thành

calogene, bởi vì một trong những đặc điểm chính của nó là có khả năng kích thích sựphân chia tế bào cũng như kích thích sự hình thành mô sẹo thậm chí tại nồng độ thấp.Chất điều hòa sinh trưởng này được chứng minh là có hiệu quả trong quá trình chuyểnhóa RNA bằng cách kích thích sự địch mã RNA thông tin có khả năng mã hóa tạo proteincần thiết cho sự sinh trưởng và do vậy, nó thúc day sự tăng sinh tế bào hỗn độn, nghĩa

là sự hình thành mô sẹo (George, 1984).

Cytokinin: là nhóm Pytohocmon được phát hiện thứ ba vào năm 1963 Cơ quan

tong hop cytokinin ở thực vật là hệ thống rễ và một số cơ quan non đang sinh trưởng

12

Cytokinin có tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, hiệu quả này có được là do nó kíchthích sự tổng hợp acid nucleic, protein và có mặt trong RNA vận chuyền Kích thích sự

phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chéi bat định từ mô seo và cơ quan Việc sử

dụng tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hoá của mô

theo hướng tạo rễ, tạo chéi hay mô seo Cytokinin còn là hoocmon hóa trẻ, nó ức chế

quá trình phân hủy, tăng quá trình tông hợp đặc biệt là tong hợp protein, acid nucleic vàđiệp lục (Lê Trần Bình và ctv, 1997) Nó có tác dụng kìm ham sự gia hóa và kéo daituôi thọ của cây Theo Das (1958) và Nistach (1968) cho rằng chỉ khi có tác dụng đồngthời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dan đến quátrình phân chia tế bào

Thidiazuron (TDZ) là một cytokinin được sử dụng thường xuyên trong các nghiên

cứu nuôi cấy in vitro dé tái sinh chồi ở nhiều loài cây khác nhau Gần đây, TDZ cònđược sử dụng để tạo phôi soma, tạo chéi bat định (Deepa va ctv, 2018) TDZ con kichthích sự tổng hop cytokinin nội sinh va ức chế sự phân hủy bởi enzyme oxy hóacytokinin TDZ khá bền vững trong môi trường nuôi cấy (Murthy và ctv, 1998)

Gibberellin: đã có 126 chất Gibberellin được biết đến thuộc nhóm Gibberellin acidthông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lánon, một số cơ quan non đang sinh trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non.Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt, thân cây, phá ngủcác phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự

ra hoa của một số loài thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây Ngoài các chất

có tác dụng kích thích trên còn có các chất có tác dụng ức chế sinh trưởng, phát triểnkhác như ABA, Etylen cũng gây ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của một sốcây trồng trong nuôi cay in vitro (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.7 Tình hình nghiên cứu in vitro về chi Aloysia

El-Din và ctv (2011) đã nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Aloysiatriphylla từ chỗồi đỉnh và đốt thân Các đốt thân có hiệu quả hơn so với chỗi đỉnh trongviệc tái sinh chỗồi trên môi trường MS bồ sung BAP 0,1 mg/l Trong số ba loại cytokininkhác nhau (BAP, Kin, TDZ), BAP 0,5 mg/1 được cho là tạo chồi có hiệu quả nhất Tầnsuất nhân chồi bị ảnh hưởng rõ rệt bởi số lần cấy chuyền, tỷ lệ nhân chdi cao nhất dat

13

100% cũng như số lượng chéi/mau cao nhất (11,5 chồi) thu được ở lần cấy chuyền thứ 4,sau đó suy giảm Tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất là 92% trên môi trường MS bồ sung 0,5 mg/1 IBA.

Khi thực hiện nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Lippia citriodoraMosavi (2012) đã thu thập mẫu hạt từ đồng ruộng và khử trùng bề mặt bằng HgCh 0,1%trong 6 phút Quá trình tái sinh chéi đạt cao nhất trên môi trường MS bồ sung 1,0 mg/1IAA (3,85 cm) sau bốn tuần nuôi cấy Chiều cao chéi cao nhất trong giai đoạn nhânnhanh là 5,18 em trên môi trường 0,5 mg/l IAA kết hợp với 2,0 mg/l Kn

Fentahun và ctv (2017) đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Aloysiatriphylla Tỷ lệ cây con sống sạch sau khi khử trùng mẫu đốt thân bằng 0,5% NaClOtrong 10 phút là 88% Tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 84,1% trên môi trường bổ sung1,5 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh chéi hiệu quả nhất là 2,0 mg/l BAP đạt 9,23 chéi/mau Ty lệ tao rễ đạt 100% và chiều dai rễ dai nhất đạt 3,1 cm trên môi trường bổ sung1,0 mg/l IBA Trong điều kiện thuần hóa cây ở nhà lưới, ty lệ cây giống sống sót là 70%.Kết quả trên cho thấy hiệu quả khả quan của quy trình vi nhân giống

Năm 2020, El-Sadat và ctv đã xây dụng quy trình vi nhân giống từ mẫu chồi đỉnhcây Aloysia citrolodora L Giai đoạn nhân chéi đạt cao nhất trên môi trường MS bổsung 3,2 mg/l BA Môi trường bổ sung 0,5 mg/l IBA va 1,0 g/l A.C là môi trường hiệuqua cho sự hình thành rễ Cây in vitro được trồng thành công trên giá thé Than bùn +Vermiculite (1:1) với tỷ lệ đạt 91% trong điều kiện nhà lưới

14

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Tháng 8 năm 2023 - Thang 3 năm 2024.

Địa điểm thực hiện: Phòng Nuôi cay mô tế bao thực vật (BIO203) - Khoa Khoahọc Sinh học, Trường Dai hoc Nông Lam Thanh phố Hồ Chi Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu ban đầu dùng làm mẫu nghiên cứu là cây Bạch Trầm Hương 6 tháng tuổiđược thu thập từ nhà vườn quận 12, TP Hồ Chí Minh Sau đó, được chăm sóc và xử línắm bệnh trong 2 tuần tại khu thực nghiệm phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, KhoaKhoa học Sinh hoc, Trường Đại học Nông Lam, TP Hồ Chí Minh

Khi cây đã 6n định, tại phần thân cây chưa hóa gỗ, chọn các lá ở vị trí số 4 của

chồi Bach Tram Hương, tiến hành lay mẫu

Lá sau khi lây được tiễn hành khử trùng làm vật liệu bố tri thí nghiệm 1 Sử dụngnông độ tôi ưu nhất ở thí nghiệm 1 làm cơ sở tiễn hành bố trí các thí nghiệm tiếp theo.3.2.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Các hóa chất sử dụng: xà phòng, cồn, Javel, Tween 20, các chất khoáng đa lượng,

vi lượng, vitamin, các chất hữu cơ, đường, agar Ngoài ra còn sử dụng các chất điều hòa

sinh trưởng auxin, cytokinin.

Môi trường nuôi cấy: Môi trường dinh dưỡng MS (Musakige va Skoog, 1962) bổ

sung 30 g/l đường saccarose, 6,5 - 8 g/l agar.

Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là: 5,7 - 5,8 Hap khử trùngbang autoclave ở áp suất 1 atm, 121°C trong 20 phút

3.2.3 Thiét bi va dung cu thi nghiém

Thiết bị: tủ cấy vô trùng, cân phân tích, máy do pH, nồi hap khử trùng

Dụng cụ: dao cấy, kẹp, đĩa petri, đèn cồn, chai thủy tĩnh 500 ml, ống đong,

micropipette, đũa thủy tinh và các dụng cụ cần thiết khác trong phòng nuôi cay mô

15

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy

Các nghiệm thức tạo mô sẹo đề trong điều kiện tối hoàn toàn, nhiệt độ 25 + 2°C,trong thời gian 4 - 6 tuần và cho ra sáng với thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày và cường

độ ánh sáng yếu 1000 - 1500 lux

Các nghiệm thức phat sinh phôi soma dé trong điều kiện sáng với cường độ chiếusáng 3000 - 6000 lux và thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Ca(OCI); khửtrùng mẫu lá cây Bạch Trầm Hương

Các bước tiến hành:

Lua chọn mẫu lá sạch khỏe làm sạch dưới vòi nước chảy, dùng xà phòng loãng 2%ngâm mẫu (30 phút) Sử dụng bông thấm lau dọc theo chiều gân lá, sau đó tia lại bằngnước sạch, chuyền vào tủ cấy Sau khi chuyền vào tủ, tién hành rửa mẫu bằng cồn 70°(30 giây) Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu

tố với các nồng độ Ca(OCl)2 5% - 25%, 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại,mỗi lần lặp lại 3 bình, mỗi bình 3 mẫu Tổng số mẫu cho thí nghiệm là 135 mẫu Mẫu

sau khi khử trùng được nuôi cây trên môi trường MS.

Bang 3.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ Ca(OC])z đến khả năng khử trùngmẫu lá cây Bạch Trầm Hương

Nghiệm thức Nông độ Ca(OCD; (%)

AI 5 A2 10 A3 15 A4 20 A5 25

Cac chỉ tiêu theo dõi sau 2 tuân nuôi cây:

Số mẫu sạch

—x]00

Tỷ lệ mẫu sạch (%) = — =

Tông sô mâu

SO mau sạch tái sinh

Ty lệ sạch tái sinh (%) = x 100

Tổng số mẫu sạch

16