DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá và mẫu củ cây bảy lá một hoa để tạo vật liệu khởi đầu
Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu đóng vai trò then chốt, giúp tạo ra nguồn mẫu sạch cho các thí nghiệm tiếp theo. Thông thường, các nguồn mẫu lấy ở ngoài điều kiện tự nhiên thường có các yêu tô như virus, vi khuan, nam, tuyến trùng, côn trùng v.v song bám bề mặt hoặc nội sinh trong mô. Với hầu hết các thí nghiệm, các nghiên cứu đã sử dụng chất sát trùng dé khử trùng bề mặt mẫu. Nếu việc khử trùng bề mặt không hiệu quả thì nam và vi khuẩn có thé lây nhiễm vào mẫu cạnh tranh dinh dưỡng và làm chết mẫu nuôi cấy in vitro. Nguyên nhân là do một số lượng lớn vi khuẩn và nấm hoại sinh trên mô cấy làm giảm hiệu quả khử trùng ban đầu.
Hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó chất khử trùng, thời gian xử lí, đặc điểm mẫu, tuổi mẫu, vị trí lấy mẫu là những yếu tố quan trọng. Ví dụ như vỏ cây san sùi thi rất khó để khử trùng bề mặt do nó ton tại nhiều kẽ dé mầm bệnh trú ấn — nơi mà chat sát trùng không chạm tới. Thông thường, mẫu được lấy từ:
Mô thực vật tiếp xúc hoặc gần đất; Cây sinh trưởng vùng rừng tự nhiên, trên những cánh
đồng thì thường là khó hoặc có khi không thé khử tring được.
Nhiều chất hoá học như thuốc khang sinh, HgCl›, thuốc diét nam cũng được sử dụng dé khử trùng bề mặt mẫu cấy. Nồng độ và thời gian khử trùng các chat này thì khác nhau và phụ thuộc vào loại và kích thước của mẫu. Mặc dù, nhiều nhà nghiên cứu cho rằng rằng chỉ các mô thực vật ở bên ngoài tiếp xúc với hoá chất mới được tây độc.
Điều đó là hiển nhiên, vì thé sự thành công của việc khử trùng chỉ có thé đạt được nếu mô khử trùng không chứa các yếu tô gây nhiễm.
Nghiên cứu nay đã thực hiện khảo sát điều kiện khử trùng như một tiền đề dé tạo vật liệu khởi đầu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về loài cây bảy lá một hoa trong điều kiện in vitro. Tuy nhiên các bộ phận của cây như lá, thân, củ về cơ bản có vị trí khác nhau, đặc điểm bề mặt khác nhau nên điều kiện khử trùng cũng phải khác nhau dé dat ti lệ mẫu sống sạch cao nhất. Cụ thé đối với củ, luôn bám nhiều bùn đất do sinh trưởng hoàn toàn trong đất, đây là bộ phận được xem là khó khử trùng nhất ở hầu hết các loại mẫu. Thân cây bảy lá một hoa nhẫn, xốp, dé hút nước và lá của loài này mỏng,
21
không có lớp cutin day bảo vệ, dé thắm nước qua các lỗ khí không và bị hư hại sau khi khử trùng. Vì thế nên thí nghiệm này thực hiện riêng lẽ với từng loại mẫu cấy, thời gian và nồng độ các chất khử trùng cũng khác nhau cho phù hợp với từng loại mẫu cay. Kết
quả thí nghiệm được trình bảy trong Bảng 4.1 và Bảng 4.2.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùng mẫu
thân, lá và củ
` Thời gian xử lí (phút) Tỉ lệ mẫu
Nghiệm Nông độ javel
sông sạch
thức (%) Mau thân, lá Mẫu củ ae
Al 10 15 0
— A2 ~ 20% 15 20 0 AB 20 25 0
A4 10 15 0
AS — 30% 15 20 0 AG 20 25 0
A7 10 l5 0
max 40% l5 20 0
— A9 ~ 20 25 0
Kết quả thu được từ thí nghiệm trên cho thấy sau khi thực hiện khảo sát khử trùng bằng javel qua ba lần lặp lại hầu như không thu được mẫu sống sạch. Đối với mẫu thân và mẫu lá khi khử trùng với javel nồng độ thấp 20% trong các khoảng thời gian ngắn như 10 phút hay tăng lên 15, 20 phút đều không thu được mẫu sống sạch, 100% mẫu nhiễm nắm trước khi ghi nhận chết mẫu. Tương tự với mẫu củ cây bảy lá một hoa khử trùng bằng javel 20% cũng nhiễm nắm toàn bộ mẫu. Khi tăng nồng độ javel khử trùng lên 30% hay 40% cho kết quả giống nhau là đều không thu được mẫu sạch và thời gian càng tăng tỉ lệ mẫu chết càng nhiều, khi xử lí javel đến 25 phút hầu như các mẫu đều hóa nâu và chết. Qua thực nghiệm cho thấy javel chưa phải là chất khử trùng tối ưu đối với vật liệu nghiên cứu này. Vì thé, thí nghiệm đã được bố trí thêm các khảo sát khử trùng bằng HgCh.
Hiệu quả thí nghiệm khử trùng bằng HgCh nồng độ 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian 3, 5, 7, 9 phút đối với mẫu lá, thân và 10, 12, 14, 16 phút đối với mẫu củ được
22
thé hiện trong (bảng 4.2 va bảng 4.3).
Đối với thí nhiệm khử trùng HgCh 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian 3, 5, 7, 9 phút đối với mẫu lá thì không thu được mẫu sống sạch. Qua quá trình theo dõi mẫu sau khử trùng 3 ngày bat đầu có hiện tượng mat điệp lục tố, hóa nâu và chết dần sau 7 ngày theo dõi (hình 4.1 (c)), một phần còn lại bị nhiễm nam và nhiễm khuẩn (hình 4.
(a) va (b)) cho nên ở thí nghiệm khử trùng HgC]› 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian
3, 5, 7, 9 phút đối với mẫu lá không thu được tỉ lệ mẫu sống sạch. Về cơ bản lá của loài bảy lá một hoa yếu, khó bảo toản trạng thái sống tốt sau quá trình khử trùng. Nguồn mẫu lá thu từ điều kiện tự nhiên chưa phải là nguyên liệu lí tưởng đề bắt đầu một quy trình nhân giống in vitro loài cây nay.
Bang 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ HgCh và thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùng mẫu
thân cây bảy lá một hoa sau 7 ngày theo dõi
Tỉ lệ mẫu Nghệm Nồngđộ Thờigian Tỉ lệ mẫu Ti lệ mẫu :
s sông sạch thức HgCh (%) (phút) nhiềm (%) sạch (%) (%)
0
AI 3 62/5+217 37,5%+421,7 20,8P°+14,4
A2 5 75,04 + 0,0 20,8° + 7,2 12,5°+ 0,0 0,1%
A3 7 37,58 4125 62,5%+412,5 29,2472 A4 9 4.2°+ 7,2 95,8 + 7,2 45,8 + 7,2 A5 3 45,8°+19,1 54,2%4+191 29 220°+ 19]
A6 5 458*P+144 542°°+144 33,32°+ 72
0,2%
A7 7 250°+125 75,0%+412,5 45,8%+144
A8 9 8,4° + 14,4 91,7*+ 14,4 58.32+ 72
Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thong
kê p — value < 0,05.
Xét về thí nghiệm khử trùng HgCl; 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian 10, 12, 14, 16 phút đối với mẫu thân. Tỉ lệ mẫu sống sạch phụ thuộc vào thời gian và nồng độ chất khử trùng. Xét hai nhân tố nồng độ và thời gian, không có ý nghĩa về mặt thông kê.
Tuy nhiên xét riêng về đơn nhân tố thời gian thì có ý nghĩa về mặt thống kê. Tỉ lệ mẫu sống sạch ở nộng độ 0,2% trong thời gian 9 phút có tì lệ mẫu sống sạch cao nhất so với
23
các nghiệm thức còn lại trong thí nghiệm. Đối với mẫu thân khi sử dụng kết hợp hai chất khử trùng là javel 15% trong 10 phút khử trùng lần 1 giống nhau ở tat cả nghiệm thức và sau đó kết hop với HgC]s 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian 10, 12, 14, 16 phút khử trùng lần 2. Khi sử dụng với HgCl; 0,1% trong thời gian 5 phút thi thu được tỉ lệ mẫu sống sạch chỉ đạt 12,5%, thấp nhất trong các nghiệm thức khảo sát. Thời gian xử lí càng tăng và nồng độ HgCl tăng thì tỉ lệ mẫu sống sạch cũng có xu hướng tăng theo. Tỉ lệ này tăng dần lên đến 58,3% đối với nghiệm thức sử dụng với HgC1› 0,2% thời gian 9 phút. Cụ thé là, nghiệm thức với HgCl› 0,1% có tỉ lệ mẫu sống sạch thấp nhất là 12,5%
trong thời gian 5 phút và cao nhất là 45,8% khi xử lí trong thời gian 9 phút. Còn nghiệm thức với HgCl› 0,2% có tỉ lệ mẫu sống sạch thấp nhất là 29,2% và khi tăng thời gian lên đến 9 phút xử lí HgCl thì tỉ lệ mẫu sống sạch đạt cao nhất 58,3% cũng là điều kiện khử trùng mẫu thân cây bảy lá một hoa tốt nhất mà thí nghiệm này ghi nhận được.
Xét chung về ảnh hưởng của chất khử trùng giữa javel và HgC1; với thời gian xử lí mẫu thân cho thấy được tỉ lệ mẫu sống sạch cao nhất (58,3%) thu được ở nghiệm thức dùng HgC]; 0,2% trong 9 phút. Tỉ lệ này có sự thay đổi lớn và cho ra kết quả khá tốt so với thí nghiệm khử trùng mẫu thân bằng javel hoàn toàn không thu được mẫu sạch.
Đối với mẫu củ, thí nghiệm khử trùng HgC1; 0,1% và 0,2% ở các khoảng thời gian 10, 12, 14, 16 phút thu được kết quả khá tốt về số lượng mẫu sống sạch. Tỉ lệ mẫu sống sạch phụ thuộc rất nhiều vào thời gian và nồng độ chất khử trùng. Xét sự khác biệt của hai nhân tố nồng độ và thời gian, không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên xét riêng về đơn nhân tổ thời gian thì có ý nghĩa về mặt thống kê. Tỉ lệ mẫu sống sạch ở nồng độ 0,2% trong thời gian 16 phút có tì lệ mẫu sống sạch cao nhất so với các nghiệm thức
còn lại trong thí nghiệm. Khi khử trùng với HgC]¿ 0,1% trong thời gian 10 phút thì cho
tỉ lệ mẫu sống sạch là 40% và tăng dần lên đến 93,3% khi xử lí HgCl› 0,2% thời gian 16 phút. Cụ thé hơn, nghiệm thức HgCh 0,1% có tỉ lệ mẫu sống sạch thấp nhất là 40%
trong thời gian 10 phút và cao nhất là 86,7% khi ngâm mẫu trong thời gian 16 phút. Đối với nồng độ HgC1› 0,2% có tỉ lệ mẫu sống sạch thấp nhất là 60% trong thời gian 10 phút và cao nhất là 93,3% khi ngâm mẫu lâu hơn trong 16 phút.
Xét chung về ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu củ cho thấy được tỉ lệ mẫu sống sạch cao nhất được thể hiện ở nghiệm thức A8 khử trùng với HgCl; 0,2% thời gian 16 phút đạt 93,3% sau 7 ngày theo dõi mẫu. Tuy nó không có nhiều ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức A7 khử trùng bằng HgCh
24
0,1% thời gian 16 phút đạt 86,7%, nhưng trong thực tế có thé ứng dụng nghiệm thức A8 như một nhiệm thức tốt nhất. Việc sử dụng HgC1› như một chất khử trùng trong lần thứ 2 kết hợp với javel 15% 20 phút khử trùng lần 1 đã đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất so với thí nghiệm thực hiện khử trùng mẫu củ bằng javel ở các nồng độ đã khảo sát.
Bang 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ HgCh và thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùng mẫu
củ cây bảy lá một hoa sau 7 ngày theo dõi
` - - Tỉ lệ mẫu
Nghiệm Nongdd Thòigian Tỉ lệmầẫu Tỉ lệ mầu
B sống sạch
thúc HgCh (%) (phút) nhiễm (%) sạch (%)
(%)
BI 10 600242173 40,0°417,3 40,0°+17,3
B2 12 33,3°% 4153 66,7%°+415,3 66,78 + 15,3
0,1%
B3 14 50,0%+ 10,0 50,0%+410,0 50,0°+ 10,0 B4 16 13,3 + 5,8 86,7% + 5 8 86,7 + 5,8 B5 10 40,0 +20,0 60,0°+20,0 60,0°°+ 20,0 B6 12 33,37 +458 66,7%458 66,72°+5 8
0,2%
B7 14 33,37 4153 66,7%°+415,3 66,74 15,3
B8 16 6,7° + 5,8 93,3°+5,8 93,3°+ 5,8
Trong cùng một cột các chữ cái khác nhan biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thong kê p —
value < 0,05.
Sự tác động của hai chất khử trùng và thời gian khử tring phù hợp anh hưởng rat lớn đến nguồn vật liệu khởi đầu cây bảy lá một hoa. Nếu chỉ có một chất khử trùng là javel thực hiện với nồng độ thời gian thấp nhất thì cho ra tỉ lệ mẫu sống sạch thấp hoặc hoàn toàn không cho ra kết quả, nếu khử trùng javej với nồng độ tăng thời gian tăng sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu như chết đi kèm theo đó mẫu vẫn bị nhiễm khuẩn, nam. Từ đó cho thấy không có sự hiệu qua của viêc sử dụng một chất khừ trùng là javel khi tăng giảm nồng độ và thời gian. Nếu kết hợp giữa hai chất khử trùng javel và HgCl; khi tăng giảm nồng độ và thời gian thích hop, thì cho ra hiệu quả khử trùng tốt đối với mẫu cây bảy lá một hoa.
25
Hình 4.1. Kết quả khử trùng mẫu lá cây bảy lá một hoa sau 7 ngày theo dõi (a) mẫu lá nhiễm khuẩn, (b) Mẫu lá nhiễm nam, (c) Mẫu lá mat điệp lục có hiện tượng chết.
26
4.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo sẹo và tạo rễ
từ than va củ cây bảy lá một hoa
Bảng 4.4. Tỉ lệ hình thành mô sẹo và rễ từ lát cắt củ cây bảy lá một hoa sau 8 tuần Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu hình
Nghém 2,4-D NAA IBA TDZ . tạo sẹo (%) thành rễ (%) thức (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
Cl 0,5 - - - C2 | - - - C3 1,5 - - - C4 - 0,5 - - CS - | - - C6 - 15 - - C7 - 2 - - C8 - 255 - - C9 - - 0,5 - C10 - - 1 - Cll - - 1,5 - C12 - - 2 - C13 - - 2,5 - C14 0,5 - - 0,2
oO S
®œbe
c©| C| C| C| C| C| C| C| C| Ss co; C| CC eo; o7 oOo; oo; co] G| cC| CUO] CO SO] CUO
£0&
- không bô sung vào môi trường nuôi cay
27
Đối với thí nghiệm tạo sẹo và tạo rễ trên lát cắt mẫu thân. Sau quá trình nuôi cay và theo d6i sau 8 tuần nuôi cấy một số lat cắt mẫu thân có hiện tượng hóa nâu, hầu như chết và không có hiện tượng tạo sẹo và tạo rễ (hình 4.5 (b)). Sau 16 tuần theo đối thì tat cả các mẫu đều có hiện tượng hóa nâu và chết (hình 4.5 (c)).
Trên môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) hoặc IBA(0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) hay 2,4-D (0,5; 1,0; 1,5 mg/L) riêng lẻ đều không ghi nhận được sự hình thành mô sẹo hay phát sinh rễ bất định. Điều nay cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng đã đề cập ở đây chưa phù hợp với xu hướng phát triển của mẫu cấy.
Trong nuôi cây mô việc kết hợp giữa auxin và cytokinin là cần thiết cho sự phân chia tế bào. Cytokinin tác động đến hai quá trình phân chia tế bào: phân bào và phân nhân (Bùi Trang Việt, 2000). Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin giúp kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào dé tao seo. Cytokinin và auxin hỗ trợ lẫn nhau trong sự tăng trưởng nhưng cũng có đối lập giữa giúp tạo chồi (cytokinin) và giúp tạo rễ (auxin). Vì vậy, cả hai con đường phát sinh hình cơ quan gián tiếp hay trực tiếp thông qua mô sẹo, việc kết hợp giữa cytokinin và auxin sẽ quyết định chiều hướng phát sinh hình thái.
(Miller va Skoog, 1965) đã chứng minh rang quá trình tạo rễ hay chồi của mô sẹo thuốc lá tùy thuộc vào tỉ lệ auxin/cytokinin trong mô trường nuôi cấy. Ngoài ra yếu tố tao vết thương cũng cảm ứng hình thành mô sẹo và vận chuyên các hormone thực vật nội sinh, từ đó các chất này sẽ kích thích cảm ứng hình thành mô sẹo. Bên cạnh đó khi tạo vết thương còn làm tăng sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh. Điều này có thé thấy các mạch tiếp xúc với 2,4-D và TDZ. Sau quá trình nuôi cay và theo dõi trong 8 tuần lát cắt mẫu củ bảy lá một hoa đã có sự hình thành cảm ứng tạo sẹo trên môi trường nuôi cấy là (MS có bé sung 2,4-D 0,5 mg/L và 0,2 mg/L) (hình 4.4 (c,d)). Và sau 8 tuần đã có sự hình thành và phát triển mô sẹo với tỉ lệ hình thành mô sẹo là 8,3 % (bảng 4.2). Dưới sự tác động của các yêu tố tạo vết thương và chất điều hòa sinh trưởng đã tạo ra sự phát sinh hình thái mô sẹo trong 8 tuần theo dõi. Sau 8 tuần nuôi cấy, mẫu củ cảm ứng hình thành mô sẹo và xuất hiện mô sẹo (hình 4.4 (c,d)). Các lát cắt mẫu củ vẫn còn sông, sẹo chủ yếu hình thành ở vết cắt. Các mô sẹo to được hình thành, có dạng nốt, mềm, có màu trắng được cấu tạo từ các khối nhỏ liên kết với nhau. Đúng với nhận định của (Vũ Văn Vụ và ctv, 2009) khi nuôi cấy các bô phận của thực vật trên môi
28
trường nuôi cay khác nhau tao mô seo, thi mô seo được tạo ra có màu sắc khác nhau.
Thường thi mô sẹo có mau trắng, hơi xanh hoặc vàng .
Trên môi trường MS có bé sung NAA ở các nồng độ (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) và MS có bổ sung IBA(0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) không có sự hình thành va phat sinh mô sẹo (hình 4.4 (a,b)). Điều nảy cho thấy nếu có sự kết hợp giữa auxin va cytokinin thì sẽ có cảm ứng hình thành mô sẹo bắt đầu con đường phát sinh hình cơ quan gián tiếp hay trực tiếp thông qua mô sẹo. Việc kết hợp giữa cytokinin và auxin sẽ quyết định chiều hướng phát sinh hình thái phù hợp với kết quả của Bui Trang Việt báo cáo năm 2000.
Sự hình thành mô sẹo liên quan đến sinh lý của mô cấy, liên quan tới việc sử dụng auxin riêng lẽ hay hết hợp với cytokinin. Một số công trình nghiên cứu khác cũng cho rằng môi trường có bồ sung auxin kết hợp với cytokinin thì chi tỉ lệ mẫu tạo mô seo và khối lượng tươi cao hơn so với môi trường bồ sung auxin đơn lẻ (Đỗ Quốc Trường, 2012).
Ti lệ hình thành mô sẹo cao hay thấp phụ thuộc vào việc phối trộn giữa auxin và
cytokinin.
Hầu hết các loại thực vật, sự hình thành rễ bat định đều xuất phát từ auxin. Auxin cần thết cho sự phân chia tế bào trong sự phát sinh hình thái thực vật. Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyền của auxin có vai tro trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (Bùi Trang Việt, 1998; Berleth va cs, 2001). Trong môi trường chỉ có auxin cụ thể là NAA trong thí nghiệm này thì mô nuôi cấy chỉ hình thành rễ. Vì vậy trong kĩ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kì quan trọng và bắt buộc (Vũ Văn Vụ, 1999). Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tông hợp được), axit amin (như arginin) và nhất là các hợp chất ortho - diphenolic (như axit cafeic, axit chlorogenic) (Bùi Trang Việt, 2000). Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều yếu tố môi trường và các yếu tố nội sinh (Sorin và ctv, 2005).
Auxin và ethylen được xem là chất kích thích hình thành rễ trong khi cytokinin va
gibberellin thì ngược lại (Pop va ctv, 2011).
Auxin kích thích sự tạo rễ và hoạt hóa cơ quan có vai trò thết yếu trong cảm ứng tạo rễ. việc sử dụng auxin đề cảm ứng tạo rễ đã được nhiều công trình nghiên cứu và ứng dung rất phô biến trên nhiều đối tượng. Tuy nhiên mỗi loại và nồng độ auxin còn phụ thuộc vào dối tượng cần nghiên cứu. Trong thí nghiệm này chat điều hòa sinh trưởng được sử dụng là NAA va IBA để cảm ứng tạo rễ. kết quả cho thấy được chỉ có một
29