DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP
3.1. Thời gian va địa điểm nghiên cứu
Đề tai bắt đầu thực hiện từ 8/2022 đến 12/2022.
Địa điểm thực hiện đề tài tại phòng 301 Sinh học Tích hợp Thực vật (PIB), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Nguồn mẫu
Nguồn mau cây bay lá một hoa (Paris vietnamensis) 2 năm tuôi được thu thập từ vùng núi Tây Bac (Phang Sô Lin — Sin Hồ - Lai Châu). Vật liệu nuôi cấy được sử dung
trong nghiên cứu nay là lá, thân, củ.
Hình 3.1. Cây bay lá một hoa được sử dụng trong nghiên cứu (a) Cay bảy lá một hoa thu nhận ở Phăng Sô Lin — Sin Hồ - Lai Châu; (b) Mẫu lá dài khoảng 7 em và rộng khoảng 5 em ; (c) Mẫu đoạn thân dài khoảng 5 cm; (d) Mẫu củ.
15
3.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Môi trường được sử dụng trong ngiên cứu này là môi trường MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962) thêm 30g đường va 8 g/l agar. Tùy vào mục đích thí nghiệm
mà môi trường nuôi cấy được bồ sung các chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D; NAA; TDZ) ở nhiều nộng độ khác nhau đề đạt được kết quả tốt nhất trong nghiên cứu. Môi trường được chứa trong chai thủy tinh có dung tích 500 ml mỗi chai 70 ml hoặc 10 ml môi trường trong mỗi ống nghiệm. Môi trường được điều chỉnh pH bằng 5,7 + 0,1 trước khi hap khử trùng bằng nỗi hap ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm, trong thời gian 20 phút.
Các mẫu cấy được đặt trong phòng tăng trưởng với điều kiện chiếu sáng 3.000 lux hoặc hoàn toàn tối, ở nhiệt độ 25 + 2°C, độ âm 60 — 65%.
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Tủ lạnh bảo quản hóa chất, tủ sấy, máy đo pH, cân phân tích, tủ cấy vô trùng, microwave, lò quay môi trường, nồi hấp (autoclave), máy nước cất.
Dụng cụ: Các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm như ống dong (50 ml; 100 ml; 250 ml; 500 ml; 1000 ml), chai thủy tinh (100 ml; 250 ml; 500 ml), ống nghiệm (d = 3cm), bình tam giác (25 ml; 250 ml; 500 ml), cốc thủy tinh (50 ml; 100 ml; 250 ml;
500 ml; 1000 ml), ca nhựa (50 ml; 100 ml; 250 ml; 500 ml, 1000 ml), bình định mức
(20 ml; 100 ml; 250 ml; 500 ml), dia petri, đũa thủy tinh, pipetman, dao cay, kéo, dia cay, pen cấy 25 - 30 cm, đèn cồn, bình xịt cồn, bông gòn và một số dụng cụ khác.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá và mẫu củ cây bảy lá một hoa để tạo vật liệu khởi đầu.
Mục tiêu thí nghiệm: Xác định điều kiện khử trùng thích hợp đối với mẫu thân, mẫu lá và mẫu củ cây bảy lá một hoa để tạo vật liệu khởi đầu.
Phương pháp: thực hiện với hai chất khử trùng là Javel và HgCl›
Khử trùng bằng Javel
Thực hiện bên ngoài tủ cấy vô trùng, các mẫu lá được cắt bỏ phần cuống lá (hình 3.1 (a)), mẫu thân được cắt đoạn 5 em (hình 3.1 (b)), mẫu củ được cắt sạch rễ (hình 3.
(c)). Sau đó thực hiện rửa dưới vòi nước chảy dùng cọ mềm quét nhẹ đất cát bám trên mẫu lá, thân và củ (tránh thao tác mạnh làm tổn thương mẫu), sau đó mẫu lá, thân và củ
được ngâm trong dung dịch xà phòng loãng trong 5 phút, rửa dưới vòi nước chảy, ngâm
16
dung dịch thuốc diệt nam 1% (mancozeb) trong thời gian (15 phút; 20 phút; 25 phút) tương ứng đối với mẫu lá, mẫu thân và mẫu củ, xả lại dưới vòi nước chảy.
Thao tác thực hiện bên trong tủ cấy, các mẫu được lắc cồn 70° trong 1 phút, rửa hai lần với nước cất vô trùng, được khử trùng lần thứ nhất với javel ở các nồng độ được
khảo sát trong thí nghiệm nay là 20%, 30%, 40% thêm vài giọt tween-80 trong các
khoảng thời gian khảo sát (10 phút; 15 phút; 20 phút) đối với mẫu thân và mẫu lá, (15 phút; 20 phút; 25 phút) đối với mẫu củ, rửa lại ba lần với nước cất vô trùng. Sau đó các mẫu được khử trùng lần hai với javel 10% trong 5 phút đối với tất cả các loại mẫu cấy.
Xa lại ba lần với nước cất vô trùng. Tiếp đến là ngâm mẫu trong kháng sinh ampicillin và tetracilin trong 30 phút. Sau đó các mẫu được thấm ráo bằng giây thấm vô trùng. Mẫu lá được cắt 2 cm”, mẫu thân cat thành đoạn 2 cm, mẫu củ cắt 2 cmỶ. Sau đó cây vào môi
trường MS.
Bảng 3.1. Bồ trí thí nghiệm khử trùng mau thân, lá va củ bằng javel Nông độ Thời gian xử lí (phút)
Nghiệm
javel (% - - thức Mẫu thân, lá Mẫu củ
v/v)
AI 10 15 A2 20% 15 20 A3 20 25 A4 10 15 AS 30% 15 20 A6 20 25 A7 10 liằ
A8 40% 15 20 A9 20 25
Khử trùng bằng HgCh có kết hợp javel
Thực hiện bên ngoài tủ cấy vô trùng tương tự các bước vừa trình bay ở phan trên.
Thực hiện bên trong tủ cay, các mẫu được khử trùng lần thứ nhất với javel 15% bổ sung tween-80 trong thời gian 7 phút đối với mẫu lá, 10 phút đối với mẫu thân, 20 phút
17
đối với mẫu củ. Sau đó khử trùng lần hai với HgCh ở hai nồng độ khảo sát là 0,1% và 0,2% (m/v) bồ sung vai giọt tween-80 trong các khoảng thời gian khảo sát (3 phút; 5 phút; 7 phút; 9 phút) đối với mẫu lá và mẫu thân hoặc (10 phút; 12 phút; 14 phút; 16 phút) đối với mẫu củ, rửa ba lần với nước cắt vô trùng (trong đó lần rửa đầu tiên ngâm khoản 1 phut). Tiếp đến là ngâm các mẫu lá, mẫu thân và mẫu củ trong kháng sinh ampicillin và tetracilin trong 30 phút. Sau đó các mẫu được thấm ráo bằng giấy thấm vô trùng và cấy vào môi trường MS. Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 7 ngày.
Bảng 3.2. Bồ trí thí nghiệm khử trùng mau thân, lá và củ bằng HgCl›
Nông độ Thời gian xử lí (phút) Nghiệm thức HgCl, (% - :
Mau Thân, lá Mau Củ v/v)
BI 3 10 B2 5 12
0,1%
B3 ? 14 B4 9 16 B5 3 10 Bó 5 12
0,2%
B7 7 14 B8 9 16
Bồ trí thí nghiệm: Thi nghiệm khử tring bang Javel gồm 9 nghiệm thức va khử trùng Javel kết hợp HgCls gồm 8 nghiệm thức. Các nghiệm thức thí nghiệm được bố tri theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 8 mẫu thân, lá hoặc 10 mẫu củ /1 nghiệm thức/1 lần lặp lại. Các mẫu được cấy vào 1 ống nghiệm (chai)
riêng lẻ (bảng 3.1 và bảng 3.2).
Chỉ tiêu theo dõi sau 7 ngày gồm: tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu sống sạch.
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = (số mẫu nhiễm) / (tổng số mẫu) x 100%
Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (số mẫu sạch) / (tổng số mẫu) x 100%
Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = (số mẫu sống sạch) / (tổng số mẫu) x 100%
18
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo sẹo và tạo rễ từ thân và củ cây bảy lá một hoa.
Mục tiêu đề tài: Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tạo sẹo và rễ từ lát cắt thân và củ cây bảy lá một hoa.
Phương pháp thực hiện: các mẫu thân và mẫu củ vô trùng được cắt lát có kích thước khoảng 0,5 mm - 1 mm. Các mẫu được cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA
(0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) và IBA(0.5: 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L), 2,4-D (0,5 ; 1; 1,5 mg/L) đơn
lẻ hoặc kết hợp với 0,2 mg/L TDZ.
Bang 3.3. Nong độ các chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo
seo va tao ré
Nghiệm thức 2,4-D(mg/L) NAA(mg/L) IBA(mgL) | TDZ (mg/L) Cl 0,5 - - P
C2 1 - - - C3 1,5 P : : C4 : 0,5 : : C5 : 1 B : Có : 1,5 : : C7 s 2 : , C8 : 2,5 : : C9 : . 0,5 : C10 : : 1 : Cll 5 . 1,5 . HE? , : Z z C13 : : 2,5 :
C14 0,5 - - 0,2
- không bồ sung vào môi trường nuôi cấy
Theo đõi quá trình phát triển của mẫu, ghi nhận sự cảm ứng tạo sẹo và rễ. Các chỉ tiêu ghi nhận sau 8 tuần gồm: Tỉ lệ tạo sẹo và tỉ lệ tạo rễ được tính theo công thức:
Tỉ lệ tạo sẹo (%) = (số mẫu tạo sẹo) / (tổng số mẫu cấy) x 100%
Tỉ lệ tạo rễ (%) = (số mẫu tạo rễ) / (tổng số mẫu cấy) x 100%
19
Bồ trí thí nghiệm: Các nghiệm thức thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 bình, mỗi bình 4 mẫu (bảng 3.3).
3.4. Xử lý thống kê
Số liệu được xử lý tính toán bằng phần mềm Excel, sau đó được xử lý thống kê bằng phân tích ANOVA 1 nhân tố sử dụng phầm mén Mintab 16. Các nghiệm thức được phân hạng theo Tukey’s HSD với P — Value < 0,05. Đối với số liệu phần trăm được xử
lý chuyền đổi theo công thức y = aresin jx trước khi dem đi xử lý thống kê ( với x la
số phần trăm trước khi xử lý thống kê ). Tuy nhiên nếu x có các gía trị 0 thì thay x bằng 1/4n, ngược lại nếu x có giá trị là 100 thì thay bằng 100 — 1/4n (với n là mẫu số khi tinh
tỉ lệ (%)).
20