Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo sẹo và tái sinh cây kỷ tử in vitro (Lycium barbarum)

Với những lý do trên đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo sẹo và tái sinh cây kỷ tử in vitroLycium barbarum” được thực hiện.. Tính toàn năng của tế b

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _ ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT SU ANH HUONG CUA CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN KHA NANG TAO SEO

VA TAI SINH CAY KY TU in vitro

(Lycium barbarum)

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : TRAN VAN PHO

Mã số sinh viên : 19126133Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đúc, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT SU ANH HUONG CUA CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN KHA NANG TAO SEO

VA TAI SINH CAY KY TU in vitro

(Lycium barbarum)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TÔN TRANG ÁNH TRAN VAN PHO

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và gia đình đã nuôi dạy conkhôn lớn, luôn khích lệ, động viên trên con đường thực hiện ước mơ Cảm ơn sự hy sinh lớn lao của ba mẹ.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Nhà trường Trường Đại học NôngLâm TP.HCM, thầy cô Ban Chủ Nhiệm Khoa và các thầy cô trong Khoa Khoa học

Sinh học đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, tạo mọi điều kiện cho em

học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện đề tài trong những năm tháng học tại

trường.

Trân trọng cảm ơn ThS Tôn Trang Ánh đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡcon trong quá trình thực hiện đề tài Cảm ơn cô vì đã luôn ân cần chỉ dạy, hướngdẫn và luôn vị tha với những sai lầm trong tuôi trẻ của con

Cảm ơn ThS Nguyễn Thị Quyên đã giải đáp thắc mắc, giúp đỡ em trong quá

trình thực hiện đề tài tại phòng mô

Xin gửi lời cảm ơn đến Chị Lê Thị Kim Yến (K44) đã cho em kế thừa đề tài

và hướng dẫn khi em gặp khó khăn

Chân thành cảm ơn các Bạn Phạm Nguyễn Thanh Phương, Hồ Thị ThanhThiên đã hết mình hỗ trợ tôi trong lúc thực hiện đề tài và viết khóa luận tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các Em Kiều Trọng Vinh (K46), Lê GiaThịnh (K46), Đỗ Tiến Đạt (K47), La Chí Dan (K47) Cảm ơn các em đã gắn bó,

đồng hành cùng anh trên chặn đường làm đề tài đầy gian nan, thử thách này

Cảm ơn toàn thé bạn bè, các em trong phòng Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vậttrường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã có những hỗ trợ trong lúc tôi thực hiện đềtải.

Xin chân thành cảm ơn!

il

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Tran Văn Phố, MSSV: 19126133, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Công nghệSinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa

luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu tráchnhiệm trước hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày 28 thang 12 năm2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Trần Văn Phố

iii

nồng độ BA kết hợp 2,4D 0,1mg/L đến khả năng tái sinh chỗồi cây kỷ tử in vitro sau 6

tuần nuôi cấy cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung BA2,5mg/L và 2,4D 0,Img/L với số chồi trung bình 1,95 chéi, chiều cao trung bình3,23cm, số lá trung bình 3,4 lá Ghi nhận kết qua các chổi thu được trên môi trườngnày đều khỏe mạnh, màu xanh đậm Thí nghiệm nhân nhanh chồi khảo sát nồng độ

BA kết hợp IAA 0,2mg/L cho kết quả nhân chồi tốt nhất khi sử dụng môi trường MS

có bổ sung BA 2,0mg/L và IAA 0,2mg/L với số chỗi trung bình là 2,53 chồi, chiều

cao trung bình 2,43cm, số lá trung bình 5,2 lá Khi khảo sát kha năng tạo rễ bằng

NAA của cây kỷ tử in vitro kết quả tốt nhất là NAA 0,5mg/L với số rễ trung bình 5,3

rễ, chiều dài rễ trung bình 3,03cm

Từ khóa: Tái sinh cây kỷ tử từ mô sẹo, Lycium barbarum, Cây ky tử.

iv

Lycium barbarum is a precious medicinal herb with many outstanding uses in health care and beauty Most parts of the plant contain secondary compounds, especially gooseberries contain many polysaccharides, substance that has been recognized for its anti-aging, oxidative ability, reduction of DNA damage, anti- inflammatory, anti-toxic The project "Investigating the influence of growth regulators on scarring and regeneration of in vitro gooseberries (Lycium babarum)" was conducted to bring about a new research direction to create a large-scale in vitro production process Jn vitro scarring experiments, after 6 weeks of culture, when supplemented with 2.4-D 1.0mg/L combined with BA 0.5mg/L gave the best value with a rate of 97.67% and the average fresh weight was also the best 1.40g The scar tissue collected in this environment shows signs of regeneration When investigating the influence of a combined BA concentration of 2.4D 0.Img/L on the ability to regenerate buds in vitro after 6 weeks of culture, the best bud regeneration results were obtained on MS media supplemented with BA 2.5mg/L and 2.4D 0.1mg/L with

an average number of shoots of 1.95 buds, The average height is 3.23cm, the average number of leaves is 3.4 leaves As a result, the shoots obtained on this medium are healthy, dark green The bud multiplication experiment surveying the concentration

of BA combined with IAA 0.2mg/L showed the best bud multiplication results when using MS medium supplemented with BA 2.0mg/L and IAA 0.2mg/L with an average number of shoots of 2.53 buds, an average height of 2.43cm, an average number of leaves of 5.2 leaves When examining the ability of in vitro plants to root with NAA, the best result was a NAA of 0.5mg/L with an average number of roots of 5.3 roots,

an average root length of 3.03cm.

Keywords: Goji tree regeneration from scar tissue, Lycium barbarum.

MỤC LỤC

Trang

TC | Di OK c8: 002022DNGEIUEHGEEEDNGEEEELAEEGEEEIIERGEEGIEEEDEGDSTEHEEGBGJBEEESEDE2EGB110030020/b/đE22W00720H86: 73000 VIDANH MỤC CÁC CHỮ VIET TẮTT - 25+ SSSE2EE2EEEE1231215211211212212 21 2e xe ixSee 5 000v uvnmn QDQDQDDỘDẦ., xDANH SÁCH BANG j ssssesssessssessssesssessssessssessnecssecsssccsnecsssecsssecsuecesseesuesesnecensesteeesess xi

9›09/9)/6008/9527.10005 — H ÔỎ |

1.1 Đặt vấn đề -s-SscsS22E2121121121112112111 2112111 011211121211121211101211 E11 erree 11.2 Mục tiều của để tÃI ces siccscvs sien vseurwnsussusesscvavcenveecsesnysenvaecssevernnssssvecsnexssnetesescenvasssves 11.3 NGi.dùng thực hiện se HỈ HH6 05.2016 06002008066 1CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU 252 22222S2S22E22E22E2E22E2222222222222ze2 32.1 Tổng quan về cây kỷ tử -2-22- 22222212232221221211221211221 2112212212112 21 Xe 3

"11 ae 30n c1 TTH)/00aczznipnhboisriobosinilaasanreariie===e ằ_ỶẽỶnớnnẽằ 3eee | 32.1.4 Điều kiện sinh thái +-©22+222+222++222x 1222112211222 4

2.2 Công dụng và giá trị của cây kỷ tử đối với con người - -¿ 5c+5c+2 5

Wp ii cac? ?a rỶrrrrrnnnorrrtrroirntoortrorrorrnarorarnysee 52.2.2 Giá trị kinh té eseeceecceecseecsseesssesnecesvecssscesneccnneesnscesnecesnecsnecesneecueessescnneeeneeenneees 52.3 Giới thiệu về kỹ thuật và các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 62.3.1 Nuôi cây đỉnh sinh trưởng -2-©2222222222221222122E22312212231221221 22122121 6S715, Noe 26 7 hại piilTbsaesaaeeeoragyoorttottiistgtogtoniteGofIE\SGESGI355090010800/0000089/0 10g01) 6

2.3.3 Nuôi cấy mô SẹO: 2 2: ©22©222222222122112211221127112711211121112111211211211 211.10 7

2.4 Những yêu tố anh hưởng đến quá trình nuôi cay mô tế bao thực vật 82.4.1 Dinh on .- 82.4.1.1 Các muối khoáng đa lượng và vi long -2-22©2++2++2z+2z++zzzzzz+zzez 8241.2, Bender eadien val ni [HDftseeeuosepeesoeeebgsoseoggigss0006044024/00080g15001000/g618080i0930 8

2 21:150/0)77109))010/272911711010I0 0“ ca cac 92.4.1.4 Các chất b6 sung - ¿22 522222221222222122112212211211211211211211211211211 21121 xe 9

2.4.2 Chất điều hòa sinh trưởng -©22-©222+22222EE+22EE22221222212732222122222 2 cee 9

VI

DAD L¿ IẬNSETđi:6xcaissti2xarctexRVSoicliGĐSESetriicdBniiNS383.qtùzr8E.2MEnttSL382100488I8g9sbSãEBSBilgdiaslesdgsodlBioidiISSgIS18uSiIGARSSASuG.SĐE 10 P00 8 11 2.4.2.3 Gibberellin cccccscccsscecsesseessesseessesseessessesseessessesssessesssessecsesssesseetsessesaeasecseeseess 123.85, PN BẴ NT xc rcs si aS ec aR 12E2 NHI ae 12

"W9 80.3 0 a4 132.5 Các bước trong nhân giống vô tính i wiff0 -2¿-2++2+22+2++2z+zz+zzzzzzzzzzse+ 132.5.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ, 2-22-5252 SS2 22222 2E 2E EECrerkerrerrerrerree 13

D52 Tu sf Tiện KMI NHoseesenneedreestortoogteinoonotiltgospsnili3HSS00830009910000010000001060.3 13

5.33, Eiil đoantriiil HÔI saessessesesetedskdorheihs9foynsgnpnlgsaHic2gkejoeS0200080000469020450001538X 14

2.6 Một số kiểu tái sinh trong nuôi cấy iN vifro . -2-©22572225+222+cczcsczsrscce 14

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU - 163.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2- 2 252+2E+2E+EE+EE22E2E22E2E2222E2E2E.zEze, l63.3, Vật liệu nghiÊn BỨNhoecesesaenbeordieenbidiitngoruoiayEtSSot0ixa.E07402181809403909014G0110908/86100000/001 16

3.3 Thiết bi, dụng cụ và hóa chất nuôi Cay ccccccccessessecsesssesstesessesssssesseestssseeaseesees 16

3.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy -2-2¿22+2+222++E++£E+2E++EE+E+zzxrrxrzrxeex l6

N00 0 ắ l63.4.2 Môi trường nuôÔi CAY « -ecnecnscreecnesnreenceonsnnenntennseassnansneeseennesarennenncansannsersensenaneonee 17

3:5: Phương phap ñEHIỆH GỮ ng ögöe seus 169151040103088g630)008953g55890300SES030U2GS34078E05i4030/01020S8: 173.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và

BA đến khả năng tạo sẹo trên lá cây Ky tử i wi#rO -. 2 2-52¿525225222sccscssczxcei 173.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và 2,4-

D (0,1mg/L) đến sự tái sinh chỗồi từ sẹo cây Kỷ tử in wi#o 55-5525525552 19

3.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và IAA

0,2mg/L đến sự nhân nhanh chồi cây Kỷ tử in vifro -2-22-75-552555cc: 203.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đếnquá trình tạo rễ cây Kỷ tử i Wif7O -:-2-52-52©52S22222E22E22223221221212212212112122121 2E cxxce, 21

CHƯƠNG 4: KET QUA VÀ THẢO LUAN sscsssessesssessesssessesssessessesssessessteesessseesees 23

4.1 Thi nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của chat điều hòa sinh trưởng 2,4-D và BAđến khả năng tạo sẹo trên lá cây Ky tử im vi/ro -2-©2+©7222c2c2cxccrcrrerrerre 234.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và 2,4-D(0,1mg/L) đến sự tái sinh chỗồi từ sẹo cây Ky tử iw vifo -225525525555z55c2 26

Vii

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và IAAđến sự nhân nhanh chồi cây Kỷ tử in Vi/rO ©2-©22©225522222E22E22E22E222E2Ezxzxee 284.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến quá

trình tạo rễ cây Kỷ tir 70 VifFO -5-55-52-2222S22E22E22E2EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrrrrrrrrrrrrrree 30

CHƯỜNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NT eeeeeseeeseesboiekenisoroseieosegroshooe 33

5.1 Kết luận - ST 1 12112121121211121 1111111111 211111111112111121211121111121 112111 Ee xe 335.2 Kiến nghị - 2-52 222222221222122122112112211211221211211221121111211211212211212121 2 ee 33TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-2 SS+S22ESEE£EE2EEEEEEE2E21112112111711 111121111111 ce, 34

Vili

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình:2.1 4J70/m DAafbDoriiffT VO1 Gua CHI, sssscsaosiesesiiediiBLiaglluGAditgiED8S83E3.003888363EE3GEUESE8 C08 3Hình 4.1 Hình thái sẹo sau 6 tuần nuôi cấy 2- 2-©2222222222EE22E222222xzzxrcrxees 25

Hint 4.2, Tĩinh thi chối a6 tdi 1g sosssssseondeesoesesetsogttcsooicz2iOSEESDgE050 27

Hình 4.3 Hình thái chồi sau 6 tuần han - 2 ¿2 2+222E+SE2E22E£EE2E22E222222222xze, 29Hình 4.4 Hình thái rễ sau 4 tuần nuôi cấy -22©-222sz2zzzzszzszzszzsczcsers -3 Ï

DANH SÁCH BANG

TrangBảng 3.1 Thành phần môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụngtrong Chi TEhH1Ệ sec s6 se611101181116542350) g1531581348359508840383355953539348550115E1L810640148163160439858535 17Bang 3.2 Nong độ 2,4-D va BA 0,5 mg/L sử dụng trong quá trình tạo sẹo 19Bảng 3.3 Nong độ BA và 2,4-D 0,1 mg/L sử dung trong quá trình tao sẹo 20Bảng 3.4 Nồng độ BA va IAA 0,2mg/L sử dụng trong quá trình nhân nhanh chdi .20

Bảng 3.5 Nồng độ NAA sử dụng trong tô: tàuh: tant Tốc xeossadesstonoitrgitrtiiiitgiliogtgiseosk 21

Bang 4.1 Anh huong cua chat diéu hoa sinh truong 2,4-D va BA 0,5mg/L dén su tao

seo từ lá cây Kỷ tir in vitro sau 6 tuần nuôi cấy -2- 2+ 22222++2x22z2zxczxzzrxee 23

Bảng 4.2 Hình thái sẹo do ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và 0,5

0122080570007 24Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và 2,4-D (0,1mg/L) đến sự táisinh chổi từ sẹo cây Ky tử in vitro sau 6 tuần nuôi cấy 2: 2222222z+2zzz2zze: 26Bảng 4.4 Hình thái chồi sau tái sinh do ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA

"tối ON GPG) BRD) tưontengnhhiGH5503310580080836033633EA32LISSESSBESSBNSVRENHSGSSBSESiSGS2SSAGENBGIGDXSSESRGORHNĐH.ESBESGSSE038 27Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và IAA (0,2mg/L) đến sựnhân chỗi cây Kỷ tử in vitro sau 6 tuần nuôi cấy, -¿ 2- 22©2z+2++2z++zz+zz+zzzzex 28Bảng 4.6 Hình thái chồi do ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và IAA

Bang 4.7 Anh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến sự tạo rễ cây Ky tử inVilro su (all UG! CAV isccw eaters ceeeren ume 31

xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Kỷ tử là một loại dược liệu quý, hầu hết các bộ phận thân, lá, rễ, quả của đều chứa

nhiều dược chất đặc biệt là quả Trong quả có chứa nhiều polysaccharides, một loại

dược chất đã được chứng minh về khả năng chống oxy hóa, điều chỉnh miễn dịch,chống viêm, chống độc và nhiều thành phần dinh dưỡng, hóa được khác Chính vì thế

mà từ xưa đến nay, quả kỷ tử được ưa thích và sử dụng rộng rãi trên thị trường thế

giới Được ví như là “tinh hoa của đất trời”, chúng được sử dụng như một loại thựcpham va là một vị thuốc Đông y giúp nâng cao sức khỏe con người và đặc biệt đối vớiphái nữ, kỷ tử càng được ưa chuộng hơn bởi những ảnh hưởng tích cực mà chúng manglại đối với làn da của phái đẹp (Zeng và ctv, 2019) Vấn đề được đặt ra là hiện nay việctrồng và nhân giống loại cây này bằng phương pháp gieo hạt sẽ làm giảm sản lượng

theo từng mùa do cây con không đồng nhất về di truyền, tốn nhiều thời gian, công sức

Nhân giống kỷ tử bằng phương pháp nuôi cấy mô tái sinh trực tiếp cũng đã đượcnghiên cứu (Lê Thị Kim Yến, 2022) nhưng vẫn mang đến một số hạn chế như hệ sốnhân giống thấp, mat nhiều thời gian, dé phát sinh biến dị khi cấy truyền nhiều lần và

khó thực hiện khi sản xuất trên quy mô lớn Với những lý do trên đề tài “Khảo sát ảnh

hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo sẹo và tái sinh cây kỷ tử in vitro(Lycium barbarum)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và BA thích hợp đến quá

trình tạo seo từ lá cây kỷ tử in vitro.

Xác định được nồng độ BA và 2,4-D đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây kỷ

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và BA đến khả năng tạo

mô sẹo từ nguồn nguyên liệu lá cây ky tử in vitro

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và 2,4-D đến khả năng tái sinh chỗồi

từ mô sẹo.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và IAA đến khả năng nhân nhanhchéi của cây kỷ tử in vitro

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng tạo

rễ của cây ky tử in vitro

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

Quốc ở các tỉnh như Quảng Đông, Quảng Tây, Cam Túc, Vân Nam, Ninh Hạ, Thanh

Hải Ở Việt Nam, cây được trồng ở nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Lào Cai, Lai Châu,Yên Bái và một số khu vực khác như Đà Lạt, Lâm Đồng Đối với SaPa thuộc tỉnhLào Cai thì câu kỷ tử là một trong những đặc sản ở nơi đây Chúng có nhiều tên gọikhác nhau như củ khởi, câu khởi, kỷ tử, khởi tử, địa cốt tử Goji là tên gọi của loàicây này ở Trung Quốc, ở Hàn Quốc được gọi là gugija và được gọi là kuko ở Nhật Bản(Đào Văn Quang, 2021).

2.1.3 Dac diém hinh thai

Thân: Ky tử là một loại cây bụi than gỗ rung lá, cây của chúng mọc đứng, cao từ

0,5 - 1,5m Cành phân nhiều nhánh nhỏ và cong, có cái gai ngắn ở kẻ lá

La: Màu xanh lục, có hình mũi mác hoặc có khi là dau tròn, mọc ở trên chôi hoặc

xếp xen kẽ dài khoảng 55mm, một số tạo thành cụm tối đa ba lá có chiều đài 25mm.

Hoa: Có màu hồng tím, thường mọc theo nhóm từ 1 - 3 bông ở nách lá Cuốngcủa hoa thường dài từ 6 - 15mm Mỗi bông có khoảng 5 - 6 cánh hoa, có chiều dai mỗicánh là 9 - 12mm, chiều rộng là 3 - 5mm, cánh hoa có hình tam giác xuyên tâm vớimàu tím ở mặt trên và màu trang ở mặt dưới của các cánh hoa Mỗi hoa thường sẽ có

5 nhị và 1 bầu nhụy dai từ 3 - 8mm, vòi nhụy dai từ 8 - 11,5mm, các cuống sẽ daihơn so với bao phan Hoa thường ra vào tháng 6 đến tháng 9

Qua và hạt: Là quả mong có màu cam hoặc đỏ sam, có hình dạng như quả trứngthuôn dài, hay hình elip khoảng 6 - 20mm, đường kính 3 - 10mm Bên trong có cái hạt màu vàng, thân det dài khoảng 2mm, rộng 1cm nén với 1 phôi cong Tùy vào kích

thước hay giống cây mà số lượng hạt có sự khác nhau và nằm trong khoảng 10 - 60 hạt

Quả mềm có vị bùi, ngọt và đẳng Quả thường được thu hoạch vào khoảng tháng 8 đếntháng 10 hằng năm (Lê Văn Giỏi, 2013)

2.1.4 Điều kiện sinh thái

Ánh sáng: Là loài cây sống lâu năm, khi còn là cây con thì cây kỷ tử chịu bóng,nhưng từ năm thứ 3 trở đi thì cây cần được chiếu sáng đầy đủ dé đảm bao cho sự sinhtrưởng và phát triển của cây

Nhiệt độ: Là cây có khả năng thích ứng tốt, cây có thé sống trong điều kiện nhiệt

độ từ 15°C - 35°C, nhiệt độ tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển là 20°C - 27°C.Đối với cây dùng với mục đích lấy rau thì yêu cầu nhiệt độ thấp, đối với cây lẫy quả

thì yêu cầu về biên độ nhiệt độ ngày đêm cao và đất đai phù hợp Tại SaPa cây phát

triển tốt trong mùa Đông và mùa Xuân

Độ âm: Kỷ tử là một loại cây ưa ẩm, nhưng với tính thích nghi cao nên không

cần tưới nước quá thường xuyên mà chỉ cần giữ cho đất luôn có đủ độ ẩm dé cây sinh

trưởng và phát triển, tránh tình trạng tưới quá nhiều nước làm ngập úng hoặc tưới quá

ít ảnh hưởng xấu tới cây

Đất đai: Cây có khả năng thích ứng cao, có thể trồng được ở nhiều khu vực khác

nhau như miền núi, trung du và đồng bằng Cây thích ứng với đất pha cát, đất phải

thoáng nước, không bị ngập úng và có tầng canh tác sâu Đối với đất khi gieo trồng thì

cần phải tơi xốp, giàu dinh dưỡng và thoáng nước tốt (Lê Văn Giỏi, 2013)

2.2 Công dụng và giá trị của cây kỷ tử đối với con người

2.2.1 Đối với sức khỏe

Các bộ phận của cây kỷ tử đều có chứa các hợp chất mang tính dược liệu Vỏ rễ,

quả và lá của cây ký tử chứa nhiều polysaccharid, flavonoid, carotenoid (zeaxanthin và

B-carotene), alkaloid, amide, phenolics cerebroside, coumarin, anthraquinones,peptide, lignanoids, steroid, acid hữu cơ, tinh dau, anthocyanins, ÿ-sitosterol,glycolipid, betaine (0,09%) va các vitamin như riboflavin, thiamine va axit ascorbic.

Trong đó thành phan chức năng chính mang nhiều hoạt đông dược lý nhất trong cây ky

tử là L barbarum polysaccharides Polysaccharide của cây kỷ tử đã được các nhà khoahọc chứng minh là có đặc tính chống lại các tác động lão hóa và oxy hóa, chống

apoptotic, giảm tổn thương DNA, điều chỉnh lại chức năng miễn dịch giúp chống

viêm, chống độc và chống nhiễm độc, giúp bảo vệ chống lại các ton thương gan vàgiảm mức đường huyết

Nhờ phân tích các thành phần bên trong qua cây ky tử, y học hiện đại đã nghiên

cứu được các công dụng to lớn mà loại quả này mang lại Sử dụng quả của cây kỷ tửgiúp điều chỉnh, hỗ trợ cho hệ thống miễn dich của cơ thé, giúp tăng cường kha nănghoạt động của hệ thong nội tiết co thé, hỗ trợ điều chỉnh sự rối loạn lipid trong máu,

điều hòa lượng máu trong cơ thể và giãn mạch, giúp làm chậm hoặc làm giảm quá

trình hình thành mảng xơ vữa trong huyết quản, đây nhanh sự tạo huyết bên trong tủyxương Có công dụng mạnh mẽ trong việc bảo vệ gan hoạt động khỏe mạnh, đâymạnh khả năng tái sinh của các tế bào gan Đặc biệt chúng đã được chứng minh vềkhả năng ức chế các tế bào ung thư cũng như ngăn ngừa phóng xạ trong cơ thê, đốivới phái đẹp nó còn có công dụng tuyệt vời hơn khi giúp làm chậm quá trình oxy hóa

của cơ thé, giúp con người trẻ dep hon (Zeng va ctv, 2019)

2.2.2 Giá trị kinh tế

Ky tử là một loài cây có giá trị dinh dưỡng cao vừa có thé dùng làm thuốc vừa cóthé dùng làm thực pham sử dụng hằng ngày hay thực phẩm bé sung Sử dụng loại quả

này giúp nâng cao sức khỏe cũng như sắc đẹp của con người Quả kỷ tử được sử dụng

phô biến ở rất nhiều nơi trên thế giới nhờ công dụng tuyệt vời mà nó mang lại và ở

Việt Nam, nhu cầu sử dụng loại quả này là rất lớn, lượng tiêu thụ quả kỷ tử hàng năm ở

nước ta ngảy cảng tang cao, giá bán của loại quả này trên thị trường hiện nay cũng khacao Theo trang báo điện tử đài tiếng nói Việt Nam năm 2018, hạt kỷ tử của Việt Nam

có giá bán đắt gấp 10 lần ở Đức, qua đó cũng có thê thấy được giá trị không hề nhỏ màchúng mang lại đối với hai bên cung cầu trên thị thường hiện nay Việc trồng thu lấyquả với quy mô lớn ở nước ta hiện nay vẫn chưa có Do đó, việc nghiên cứu phát triểngiống cây này với quy mô lớn là rất có tiềm năng (Nguyễn Hương, 2018).

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật và các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cay mô tế bào thực vật được phát triển dựa trên tính toàn năng của tế nào

thực vật Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệthóa (trừ một số loại tế bào đã được biệt hóa sâu như ống mạch mao dẫn) có khả năngthé hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thé trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển

theo chu kì giống như sự phát triển phôi dẫn đến hình thành cây hoàn chỉnh

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật làmột kỹ thuật có ảnh hưởng và ý nghĩa vô cùng lớn đối với việc nghiên cứu lý luậnsinh học cơ bản, đồng thời đóng góp nhiều lợi ích một cách trực tiếp cho thực tiễn

đời sống và sản xuất

2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương thức sinh trưởng đề đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tếbào và mô thực vật là nuôi cay đỉnh sinh trưởng (gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên)

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ

chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chatkích thích sinh trưởng thích hợp.

Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát

triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ détrở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyền ra đất dần dần thích nghỉ và phát triểnbình thường.

2.3.2 Nuôi cấy hạt phấn

Hạt phan ở thực vat được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành môsẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.

Nuôi cấy tế bào đơn:

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc cótốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn Tếbao đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt dé tăng sinh khối

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải lên trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bồ sung auxin, tế bào đơnphát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin — auxin

thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.3.3 Nuôi cấy mô sẹo:

Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân

hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấyphôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Mô sẹo là một khối tế bảo

không có t6 chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiệnđặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoa sinh trưởng thực vật) Các tế bào thuộc

các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên

Nhìn chung sự tạo mô sẹo in vitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các

tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi

Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn dễ dàng phânchia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây

cỏ hay dây leo.

Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chỗồi hay rễ) quá trình này được các

cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với màu sắc của mô sẹokhông giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác

nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh

Nong độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tô

có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường mô sẹo được hình thànhtrên môi trường giàu auxin; có thé dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc cóthể kết hợp với cytokinin tùy từng loại cây Hàm lượng hormon nội sinh và chiều dichuyền của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo Vìvậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ

ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy

Với một số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh

hưởng rất lớn Mô seo là một khối tế bào phát triển vô t6 chức, hình thành do sự phảnphân hóa tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện

diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiệnmôi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.

Nuôi cấy mô sẹo được áp dụng đối với các loại thực vật không có khả năng nhângiống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tuy nhiên tế bào mô sẹo khi cấy chuyềncàng nhiều lần thì mức độ biến dị soma càng lớn (Dương Công Kiên 2002)

2.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Dinh dưỡng

2.4.1.1 Các muối khoáng đa lượng và vỉ lượng

Các yếu tố thiết yêu trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật bên cạnh C, H

và O là các nguyên tố đa lượng: N, P, K, Ca, Mg và S Đối với cây trồng, các chấtkhoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ Mg là một phần của phân tửdiệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào Nitơ thường bổ sung vào môi trường dưới dangnitrat, amoni, nitrit hoặc axit amin Tổng lượng nitrat và amoni có thé bé sung vao

môi trường lên đến 60 Mm (Gamborg va ctv, 1976) Ngoài ra, các nguyên tố vi

lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzyme cần thiết cho hoạt độngsong của tế bào (Nguyễn Văn Hồng, 2009) Các chat vi lượng cần thiết cho sự phát triểncủa tế bào và mô thực vật bao gồm sat , mangan, kém, bo, đồng và molypden Sắtthường là vi chất dinh dưỡng quan trọng nhất Phần tử được sử dung lam citrate hoặcmuối tartarate trong môi trường nuôi cấy, tuy nhiên, có một số van đề với các hop chatnày là khó hòa tan va dé kết tủa của chúng sau khi chuẩn bị môi trường (Saad và

Elshahed, 2012) Đã có những thử nghiệm đề giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng

axit ethylene diaminetetraacetic (EDTA) -iron chelate (Fe-EDTA).

2.4.1.2 Nguồn cacbon và năng lượng

Khi nuôi cay in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,

do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bảo.Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay là đường saccarose, một số trường hợp

sử dung glucose va fructose thay thé cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydratcacbon so với nhu cầu của thực vật (Saad và ctv, 2012) Trong môi trường nuôi cấy tế

bào thực vật, ngoài sucrose, thường được sử dụng làm nguồn carbon ở nồng độ 2-5%,

cacbohydrat khác cũng được sử dụng, gồm lactose, galactose, maltose và tinh bột.Chúng được báo cáo là kém hiệu qua hơn so với sucrose hoặc glucose (Nguyễn VănHồng, 2009)

2.4.1.3 Các vitamin và axit amin

Vitamin có chức năng xúc tác trong các phan ứng enzyme Vitamin được coi làquan trọng đối với tế bào thực vật là thiamine (B1) Các vitamin khác, axit nicotinic

(B3) và pyridoxine (B6), được thêm vào môi trường nuôi cấy tế bào, vì chúng có thể

làm tăng đáp ứng của tế bào Hầu hết dung dịch vitamin được cho vào môi trườngtrước khi hấp khử trùng; tuy nhiên, đối với các nghiên cứu về từng vitamin cụ thể, thìvitamin nên được lọc khử trùng.

2.4.1.4 Các chất bố sung

Môi trường có thé được bổ sung các chất hoặc chiết xuất tự nhiên như chat thủy

phân protein, nước cốt dừa, chiết xuất men, chiết xuất mạch nha, chuối xay, nước cam

và nước ép cà chua, dé kiểm tra tác dụng của chúng trong việc tăng cường tăng trưởng

Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cây có thể có tác dụng có lợi hoặc cóhại Than hoạt tính hoạt động dựa trên sự hấp phụ của các hợp chất ức chế từ môi

trường, sự hấp phụ của chất điều hòa sinh trưởng môi trường nuôi cấy hoặc làm sam

màu của môi trường Sự hiện diện 1% than hoạt tính trong môi trường đã được chứngminh là làm tăng phần lớn sự thủy phân của sucrose trong quá trình hấp tiệt trùng gâyaxit hóa môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá

môi trường Nồng độ thường sử dụng từ 6 — 8g/1 (0,6 — 1%) tùy theo hãng sản xuất.Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môitrường thường từ 5,6 - 6,0 Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 thì thạch sẽ khó đông

và cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng (Nguyễn Quang Thạch, 2008)

2.4.2 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay hormone sinh trưởng là các hợp chất hữu

cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tong hợp nhân tạo).Chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Tuynhiên, các hormone sinh trưởng chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không

tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất Nó không thé dùng đề thay thé chất dinh

dưỡng Hormone sinh trưởng gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lêntrao đổi chất của tế bảo, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm Trongthành phần môi trường nuôi cấy, các hormone sinh trưởng làm việc như chiếc chìa khóađóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp các hoạt

chất Tác dung của hormone sinh trưởng liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng

tong hop enzyme trong co thé thực vật, hoạt hóa các bộ phận của phân tử DNA Mỗi

một hormone sinh học đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật,

để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là

một mà là vài chất Tùy mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực mà sự kếthợp của các chất này có thê khác nhau Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ sử dụngauxin và cytokynin (Dương Công Kiên, 2002).

2.4.2.1 Auxin

Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thé tích của tế bào, kích thích sự

hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả

Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự

phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vaitrò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự

phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chinh khác đảm

bảo cho sự tạo thành khối tế bảo đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng như indolaceticacid (IAA), naphthyl acetic acid (NAA), 2,4-D dichloropenol acetic acid (2,4-D), indol butyric acid (IBA).

Indolacetic acid (IAA) là tinh thé màu trắng, khó hòa tan trong nước Dễ danghòa tan trong dung môi hữu cơ như etanol và ete Nó dé bị oxy hóa dưới ánh sáng détrở thành màu đỏ hồng, hoạt tính sinh lý của nó cũng bị giảm đi Axit axetic indoletrong thực vật ở trạng thái tự do hoặc ở trạng thái liên kết Sau đó hầu hết là phức hợpeste hoặc peptit Hàm lượng axit axetic indol tự do trong thực vật rất thấp, khoảng 1-

100 microgam trên kg trọng lượng tươi, tùy theo vi tri và loại mô mà hàm lượng củacác mô hoặc cơ quan có sức sống như điểm phát triển và hạt phan nhiều hơn Côngthức phan tử CioH»NO2 Auxin có nhiều tác dụng sinh lý, có liên quan đến nồng độcủa nó Nồng độ thấp có thé thúc day sự phát triển, nồng độ cao sé ức chế sự phát triển

và thậm chí giết chết thực vật Tác dụng ức chế này liên quan đến việc liệu nó có thé

tạo ra ethylene hay không Tác dụng sinh lý của auxin được biểu hiện ở hai mức độ Ở

cấp độ tế bào, auxin có thể kích thích sự phân chia của tế bào cambium, kích thích sựkéo dài tế bao của cành và ức chế sự phát triển của tế bào rễ Thúc day sự phân hóa

của tế bào xylem và tế bào phloem Thúc day quá trình cắt rễ tóc và điều chỉnh hình

10

thái của mô sẹo Ở cấp độ cơ quan và toàn bộ cây, auxin hoạt động từ cây con đến quátrình chín của qua Auxin kiểm soát sự ức chế ánh sáng đỏ có thé đảo ngược của quatrình kéo dai hypocotyl ở cây con, khi axit indole acetic chuyên đến mặt dưới của chôi,

nó tạo ra hiện tượng địa dưỡng nhánh, khi axit indole acetic chuyền sang mặt sau củachồi, nó tạo ra hiện tượng quang hướng nhánh Axit axetic indole gây ra ưu thế ngọnlàm chậm quá trình già đi của lá Auxin được thoa lên lá sẽ ức chế sự rụng, auxin thúc

đây sự ra hoa, gây ra sự phát triển của trái từng phần và làm chậm sự trưởng thành của

trái.

Naphthyl acetic acid (NAA) là một hợp chất hữu cơ dạng rắn không màu, hoàn

tan trong dung môi hữu cơ, có công thức CioH7CH2CO2H Nó có một nhóm

carboxylmetyl CH2CO2H liên kết với “vị tri 1” của naphthalene Là một loại hormone

thực vật thuộc nhóm auxin với khả năng kích thích sự tạo rễ Trong nông nghiệp NAA

thường được sử dụng trong quá trình nhân giống, lá hoặc thân được cắt ra và kích

thích ra rễ Nó còn được áp dụng với các loại hormone khác dé định hình sự phát triển

của mô thực vật trong nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên việc sử dụng hormone điều hòasinh trưởng NAA có thé gây độc tố cho cây và động vật

2,4-D dichloropenol acetic acid (2,4-D) là hợp chất hữu cơ với công thức hóa học

C§H6CI2O3 Đây là hợp chất phổ biến nhất trong số các hoạt chất sử dụng trừ cỏ

Nhưng trong nuôi cấy mô tế bảo thực vật thì 2,4-D được sử dụng như một auxin vớitác dụng kích tạo sẹo (Dương Công Kiên, 2002)

2.4.2.2 Cytokinin

Bao gồm các nhóm chất như 6-benzylaminopurin (BAP), kinetin (KI), Zeatin(Z), thidiazuron (TDZ) Cytokynin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bao

cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự

tạo chổi, đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy Cytokynin có hiệu quả rất rõtrên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokynin cần thiết nhưng chúngkhông có hiệu quả nêu vắng mặt auxin Trong một tỷ lệ giữa cytokynin và auxin thì có

kích thích tạo chéi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hon auxin thì kích thích tạo

chồi, và ngược lai, auxin cao hơn cytokynin thì kích thích tạo TỄ Trong cơ thể thực vật

cytokynin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích thích

quá trình trao đổi chat Tóm lại, cytokynin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự

II

phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuậnlợi cho nuôi cấy.

6-Benzylaminopurine (BAP) có công thức hóa học là C¡aH¡¡Ns, có dang bột kếttinh màu trắng, khó tan trong nước, tan ít trong ethyl alcohol và ôn định trong dungdịch axit, kiềm Thuộc nhóm cytokinin, BAP giúp kích thích sự ra hoa và sự phát triểncủa quả bằng cách kích thích sự nhân chia tế bào Nó còn là một loại enzyme ức ché,

được ứng dung vào việc kéo dài thời gian lưu trữ hoa qua BAP được sử dung rất phổbiển trong nuôi cấy mô thực vật, chúng thường được kết hợp với 2,4-D hoặc NAA dé

cho giai đoạn nhân chồi (Dương Công Kiên, 2002)

Sự kết hợp của auxin va cytokinin:

Ty lệ auxin/cytokinin < 1 tăng cường qua trình tao chdi

Ty lệ auxin/cytokinin = | can bang hai qua trinh tao rễ và tao chồi

Tỷ lệ auxin/cytokinin > 1 tăng cường quá trình tạo rễ2.4.2.3 Gibberellin

Gibberellin là nhóm phytohormone thứ hai được phát hiện sau auxin Từ nhữngnghiên cứu bệnh lý “bệnh lúa von” do loài nam ký sinh ở cay lúa Gibberella fujikuroi(nắm Fusarium moniliforme ở giai đoạn dinh dưỡng) gây nên Hiện nay đã phát hiện

ra trên 50 loại gibberellin và ký hiệu là Al, A2, A3, A52 Trong đó gibberellin A3(GA3) là acid gibberellic có tác dụng sinh lý mạnh nhất

2.4.3 Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như thờigian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Cường độ chiếu sáng thường

sử dụng 40 +2 umol.m?.s"! Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 —

18 giờ/ ngày (Nguyễn Văn Hồng, 2009)

Trong nuôi cay mô sẹo, ban đầu mau cay được dé trong bóng tối khoảng 2 tuần,sau đó mô sẹo được dé sáng với cường độ chiếu sáng thường sử dụng 25 + 5 umol.m'

?,s1, Tùy từng loại cây mà thời gian chiếu sáng khác nhau nhưng trung bình dao động

tam 8-10 giờ/ ngày (Lương Thị Lệ Thơ, 2019)

2.4.4 Nhiệt độ

Nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình

sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độcho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài

12

cây là 25°C (Nguyễn Văn Hồng, 2009).

2.4.5 Chất lượng mẫu

Tuổi của mẫu vật: mô càng non tuổi sinh lý thì càng có khả năng phan ứng invitro nhiều hơn Trong nhiều trường hợp, mô càng già sẽ không hình thành sẹo vikhông còn khả năng tái sinh (Dương Công Kiên, 2000).

Mùa vụ: các mùa trong năm có thể ảnh hưởng đến sự nhiễm và phản ứng của

mẫu vật trong nuôi cấy mô Mẫu được lay vào mùa xuân khi những chồi ở trang tháităng trưởng mạnh mẽ, phản ứng nhanh hơn những chồi ngủ không hoạt động Khi mùa

của năm trôi qua từ mùa xuân, mùa hè và mùa thu cho tới mùa đông, mẫu vật nóichung không đáp ứng tốt dé nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2000)

Chat lượng cây: ưu tiên lấy các mẫu vật từ cây khỏe mạnh hơn là cây thiếu dinh

dưỡng, thiếu nước hoặc cây có triệu chứng bệnh

Mục tiêu: tùy thuộc vào phản ứng mong muốn từ nuôi cấy tế bao mà có sự lựa

chọn mô mẫu vật khác nhau Nếu việc nhân giống dòng vô tính là mục tiêu, thì mẫu vật

thường là chồi ngọn hoặc chéi bên Đối với sự kích thích sẹo, các phần của lá mầm, trụdưới lá mầm, thân, lá hoặc phôi thường được sử dụng Những mẫu vật tuyệt vời cho sự

kích thích sẹo là các mô của cây con từ các hạt nảy mầm vô trùng hoặc các phát hoachưa trưởng thành Mô lá từ hạt nay mam vô trùng là một nguồn mô tốt dé tách tế bào

trần Dé tạo ra các cây đơn bội hoặc sẹo, bao phấn hoặc phan hoa được nuôi cấy.

2.5 Các bước trong nhân giống vô tinh in vitro

2.5.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc can thận các cây mẹ (câycho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai

đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp

với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ

lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro (Mai XuânLương, 2005).

2.5.2 Tạo vật liệu khởi đầu

Giai đoạn khử trùng mẫu dé đưa vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần dam

bảo các yêu cau: ty lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tai và sinh trưởng tốt Về mặtnguyên tắc thì các tế bào sống đã phân hóa đều có kha năng phan phân hóa dé trở lại

trạng thái trẻ hóa và tái lập khả năng phân chia (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy

13

Tiên, 2006) Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là: Dinh sinh trưởngthân, rễ; Chồi bên; Tượng tang; Vay củ (như ở Tulip, Iris); Chồi ngọn; Nhu mô lá, nhu

mô vỏ thân hoặc cành; Chỗi nảy từ củ

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy và xử lý mẫu Ngoài

ra còn tùy thuộc vào mục đích đối với từng loại cây khác nhau dé nuôi cấy cho phù hợp.Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất làđỉnh chéi ngọn, đỉnh chỗồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh

lá Kohter (1975) đã kết luận rằng sử dụng chồi ngọn dé nhân nhanh in vitro đối vớimăng tây là thích hợp Trong khi đó, Morel và ctv (1952) cho rằng sử dụng mầm đối với

khoai tây hay chỗi nách, chồi đỉnh ở dứa là tối ưu cho kỹ thuật nhân nhanh in vitro Mau

cần phải khử trùng trước khi đưa vào nuôi cấy để loại bỏ các vi sinh vật bám trên và bên

trong bề mặt mẫu cây Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao, đồngthời chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ giúp đạt được tốc độ tăng trưởng nhanh

Các chất khử trùng thường sử dung là: HgCh 0,1% xử lý trong 5 - 10 phút, NaOCl hoặc

Ca(OCD; 5 - 7% xử lý trong 15 - 20 phút, H2O2, dung dịch Br (Dương Công Kiên, 2003).2.5.3 Giai đoạn nhân choi

Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát sinh hình thái và tăng nhanh sốlượng chồi trên một don vi mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các conđường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bat định và tạo phôi vô tính Vật liệu khởi đầu invitro được chuyên sang môi trường nhân nhanh thường có bé sung chất điều hòa sinh

trưởng thuộc nhóm cytokinin dé tái sinh nhiều chéi từ một phần mô ban dau Vấn đề là

phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp dé có hiệu quả caonhất Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 27°C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánhsáng 2000 - 4000 lux, ánh sáng tim là thành phần quan trọng dé kích thích phân hóachéi (Weiss và Jaffe, 1969)

Ở giai đoạn này mau cấy chịu tác động bởi nhiều yếu tô đến khả năng nhân chỗinhư môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng của từng loại dịch chiết hữu cơ,

lượng đường, lượng agar bé sung Bên cạnh đó, một yếu tố quan trọng khác cũng cầnđược quan tâm chính là mẫu cấy ban đầu

2.6 Một số kiểu tái sinh trong nuôi cấy in vitro

Nhờ vào tính toàn năng, khả năng phân hóa và tái phân hóa của tế bào mà mỗi bộphận (rễ, thân, lá, hoa, cuống hoa, chồi nách), ké cả tế bào đơn bội (hạt phan, noãn

14

chưa thụ phấn) của cây đều có thé tái sinh thành cây mới hoàn chỉnh Sau đây là một sốkiểu tái sinh trong nuôi cấy in vitro mà hiện nay đã được áp dụng rộng rãi và mang lạinhiều thành công cho công tác giống cây trồng (Vũ Văn Vụ, 2009): nuôi cấy tái sinh

cơ quan; nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng; nuôi cấy tái sinh thông qua con đường tạo

mô sẹo; nuôi cay lớp mong té bao; nudi cay tao phdi v6 tinh; nudi cay tế bào đơn bội;nuôi cay té bao tran (Protoplast)

15

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Thí nghiệm được nghiên cứu từ ngày 01/07/2023 đến ngày 01/12/2023

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Nuôi cấy Tế bào Thực vật- Khoa Khoa học Sinh học,Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu cây kỷ tử in vitro được cung cấp bởi phòng Nuôi cấy Tế bào Thực Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chi Minh Từ

vật-những cây ky tử in vitro có đủ rễ, thân, lá chọn vật-những lá không quá non cũng không

quá già, to đồng đều đề bồ trí thí nghiệm 1

Tu mô sẹo ở thí nghiệm l tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm còn lại

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nuôi cấy

Thiết bị, dụng cụ: Đề tài sử dụng thiết bị và dụng cụ có sẵn tại phòng thí nghiệm

Nuôi cấy Tế Bào Thực Vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP

HCM

Hóa chất, môi trường nuôi cấy: Hóa chất được cung cấp bới phòng thí nghiệmNuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông LâmTPHCM.

3.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy

3.4.1 Điều kiện nuôi cấy

Cường độ chiếu sáng:

Trong nuôi cấy mô sẹo ban đầu mẫu được dé trong tối khoảng 2 tuần, sau đó mẫu

sẽ được dé sáng với cường độ 25umol.m2.s! + 3,75, chiếu bằng đèn huỳnh quang,công suất 18 w/bóng

Trong nuôi cấy chồi cường độ chiếu sáng thường dùng 46,25umol.m2.s! + 3,75,chiếu bằng đèn huỳnh quang, công suất 18 w/bóng

Thời gian chiếu sáng: 16h/ngay, kiểm soát tự động bằng timer hẹn giờ

Âm độ trung bình: 55%

Nhiệt độ phòng nuôi cay: 25°C +2°C

16

3.4.2 Môi trường nuôi cấy

Bảng 3.1 Thanh phần môi trường MS cơ bản (Murashige va Skoog, 1962) được sửdụng trong thí nghiệm.

H;BO; 6,2

Vi luong KI 0,83

Na,»MO, 0,25

CoCh.6H,0 0,025 CuSO,.5H,O 0,025 Fe-EDTA Na;EDTA.2HạO 37,3

FeSO,4.7H,O 27,8

Myo-Inositol 100

Vitamin i ea sử

Pyridoxine HCl 0,5 Nicotine acid 0,5 Thiamine HCl 0,1

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hướng của chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D

và BA đến khả năng tao sẹo trên lá cây kỷ tử in vitro

Tạo mô seo từ lá kỷ tử in vitro bằng môi trường MS kết hợp với BA và 2,4-D

với nồng độ BA được cố định 0,5 mg/L và 2,4-D được sử dụng từ 0 đến 3 mg/ L Thí

nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức và

3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức 3 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu Tổng số mẫu: 7*3*3*5=

315 mẫu

17