Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung dịch nghiền hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro cây quế lan hương (Aerides odorata Lour.)

TÓM TẮTMục tiêu đề tai là xác định được môi trường nuôi cấy in vitro bổ sung dịch nghiềnhữu cơ củ đậu, cà rốt và chuối thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Quế lanhương Aerides

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHAO SÁT ANH HUONG CUA MOI TRUONG BO SUNG DICH NGHIEN HUU CO DEN SU SINH TRUONG VA

PHAT TRIEN IN VITRO CAY QUE LAN HUONG

(Aerides odorata Lour.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SAT ANH HUONG CUA MOI TRUONG BO SUNG DICH NGHIEN HUU CO DEN SU SINH TRUONG VA

PHAT TRIEN IN VITRO CAY QUE LAN HUONG

(Aerides odorata Lour.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS NGUYEN THỊ QUYEN NGUYÊN HOÀNG SƠN

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại họcNông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để em học tập rèn luyện và trau dồi kiếnthức, kỹ năng nghiên cứu dé em có thé thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn khoa họcThS Nguyễn Thị Quyên Cô đã dành nhiều thời gian, chia sẻ nhiều kiến thức bổ ích,trao đổi và giải đáp những thắc mắc cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu

Cô là người truyền cảm hứng, giúp em phát triển và nâng cao kỹ năng nghiên cứu

Em xin cảm ơn đến tất cả quý thầy cô Khoa Khoa học Sinh học đã tận tình hỗ trợ

và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em cảm ơn anh Phương, chị Yến, chi Như, chị Oanh, Chị Vi đã giúp đỡ, hỗ trợ vàgiải đáp những thắc mắc trong suốt quá trình em thực hiện đề tài của mình

Cảm ơn tất cả thành viên tại phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật BIO

203 đặc biệt đối với nhóm bạn Duyên, Phương, Nam, Lê, Hiền, Điệp đã hỗ trợ mìnhtrong thời gian làm đề tài tại phòng thí nghiệm

Lời cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã ủng hộ và tạo điều kiện dé con thực hiệnước mơ của mình Gia đình là nguồn động lực, chỗ dựa tinh thần dé con vững bướctrên con đường đại học và hoàn thành tốt bài khóa luận

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Nguyễn Hoàng Sơn, MSSV: 19126150, Lớp: DH19SHB thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: đây

là Khóa luận tốt nghiệp đo bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Ho Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viét cam đoan

NGUYEN HOANG SƠN

il

TÓM TẮT

Mục tiêu đề tai là xác định được môi trường nuôi cấy in vitro bổ sung dịch nghiềnhữu cơ củ đậu, cà rốt và chuối thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Quế lanhương (Aerides odorata Lour.) Thí nghiệm bắt đầu với việc khảo sát nồng độ chất khửtrùng Ca(OC])s trên mẫu quả Qué lan hương, kết quả ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy chothấy khi khử trùng ở nồng độ 15% cho tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất đạt 68,29% Đốivới thí nghiệm tiếp theo khảo sát nồng độ dịch nghiền hữu cơ củ đậu, cà rốt và chuối bốsung vào môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển chdi, sau 60 ngày nuôicấy khi sử dụng dịch nghiền củ đậu ở nồng độ 30 g/L cho chiều cao chồi và số lá đạt giátrị tốt nhất là 1,28 cm và 5,15 lá/mẫu Còn khi bổ sung 50 g/L dịch nghiền cà rốt thìchiều cao chồi và số lá có giá trị tốt nhất lần lượt là 1,34 em và 5,44 lá/mẫu Mặc khác,khi bé sung dịch nghiền chuối ở nồng độ 30 g/L thì cho chiều cao chi và số lá đạt giátrị tốt nhất 1,39 cm và 5,33 lá/mẫu Bên cạnh việc phát triển chiều cao va số lá thì khi

bồ sung các dich nghiền vào môi trường đều kích thích sự hình thành rễ ở các chỗồi Cuốicùng là khảo sát khả năng tạo rễ khi bổ sung 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tạo rễ đạt 4,15

ré/mau và chiêu dài ré đạt 2,15 cm.

Từ khóa: Quê lan hương, dịch nghiên hữu cơ, chuối, ca rot, củ đậu.

il

The objective of the project is to determine the in vitro culture environment

supplemented with organic mashed jicama, carrot and banana suitable for the growth and development of Que lan huong (Aerides odorata Lour.) The experiment started with investigating the concentration of Ca(OCl)2 disinfectant on Que lan huong fruit samples Results recorded after 60 days of culture showed that disinfection at a concentration of 15% resulted in a clean survival rate The highest reached 68.29% For the next experiment, we investigated the concentration of organic mash of jicama, carrots and bananas added to the medium to affect the growth and development of

shoots, after 60 days of culture when using mash of jicama in The concentration of 30

g/L gave the best value for shoot height and number of leaves of 1.28 cm and 5.15 leaves/sample When adding 50 g/L of carrot mash fluid, the shoot height and number

of leaves had the best values of 1.34 cm and 5.44 leaves/sample, respectively On the other hands, when adding banana mash fluid at a concentration of 30 g/L, the shoot height and number of leaves reached the best values of 1.39 cm and 5.33 leaves/sample Besides increasing height and number of leaves, adding mash fluid to the medium stimulates root formation in shoots Finally, the rooting ability was investigated when adding 0.5 mg/L NAA for a rooting rate of 4.15 roots/sample and a root length of 2.15 cm.

Keywords: Aerides odorata Lour., organic mash fluid, banana, carrot, jicama.

IV

MỤC LỤC

Trang

XÁC NHAN VA CAM ĐOAN -52 22221 22222122122112212221221211121121121121 xe ii

SE Tu hon nh n0 0n hư go tưng roi tinggr26sg030x3GL-nE/<GiiE00usgpgzEkixg2g73ã7E2n3b1E iti

ABSTRACT ooocccccssssssessssssesssessecsecssessessesssessesssessesssessessessiessssseasesavessessesssessesssaseseeeseeees iv MỤC LUC oo eccccsesscessessesssessesssessessesssessssssessessusssesssssessessnsssessesssessesssessesssseessesseseseeaneesees Vv

DANE SH CAC CBU VIET TAT vecsccecnccncmmacmmnnnsesmnasammamnaumaa viiDANA S468 CAC BANG dntose mere nn viiiDÁNH SẠCH ee ca, nho Hư or dg2dđểgZCecH<UE/38dÁ,g160227 6620 ixCHƯƠNG 1 MO DAU ioe eoceccescssceseseessessesssesesssesesssessssssssssssstitstsitssessessessesiesseseneseesees 11.1 Đặt vấn đề -s s c2 1 22121211212111121211212111111211101111112111211112121112111 1E ye |1.2 Mục tiêu đề tài: - 5-55-2222 E1 22121121121112112111211211112112121112211 21201121221 2

1.3 NOi dung thure Hime 11117 2

CRIOOING Be TONG CUA TAL 0:00 32.1 Gidi thigu vé Qué 3 00 in n

CO, _ song ren EE HE EGGGEE 0 GGEEtGGIONGGSLG3 008G E20Q01Q3ag n0

2.1.2 in 5 32.1.3 Đặc điểm thực vật học -2- 2+22S+2E222E2212112121211211121121112112111211 2112 xe 4

Re kh H2 0H 2 02H, 0 kg 20106//201100000707.207270 52.2 Kỹ thuật nhân giống i⁄ vifrO -2-©2+©22222222222322E122122112212231221221211211 22c xe 52.2.1 Giới thiệu về kỹ thuật chin eb 899 VŨ NO cca ccovencsmmnerccsrmmrencarrimnninicanianvens 52.2.2 Quy trình nhân giống i7 Vifr -¿22¿©222222222222221222122122122212212221221 212222 62.2.3 Môi trường nuôi cấy mô 2-22©22+2E+SEEE+EEE+EEEErEEEEEEEEEEEErrrkrrrrrrerrev 72.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 2-22 2+ 2222++EE22EE2EEEEEEEEEEEE2EEerkrrrrrrvee 92.2.5 Các hợp chất hữu cơ - 2-52 522E22E223221212112112112112112112112112112112121 222 10

2.3 Các nghiên cứu liên quan trong và ngoài nước - + 5< +<+<£++c+xcezeess 12

2.3.1 Nghiên cứu về Qué lan hương -2-©22222+2222E++2E+2EE2EE2EESEE2EEerxrrrrrrrres 12

2.3.2 Nghiên cứu trong NƯỚC 2221221 1221121 1311211 1 H1 HH TH HH HH 13

2.3.3 Nghiên cứu trên thé giới - 2 2©2222S22E22EE22E22EE22E22E12232221221222122222222 2e 14

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP + 2 +2+s+E+E+EzE£E£E+EzEzrzrrrs 153.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2- 2 222+2++2E2E++EE+2E+2EE2E+zzxrrxrrrrees 15

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - ¿+ + ++2£+x+*E*tztEerreEerrrkrrrkrrrrrke 15 Sols Vat WSU MOH CU GỮbsiss11020552G20401213809355G2G3SEERERISESESSLRBESEGSSSGBSSSHRGHIGHSEHEHESGIRESSE.0S0055E 15 3.2.2 Phương phap ie hien CW sxc.qscen wren meneame teem 15

3.3 XU LY 7:8 19CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2-22 522E22E22E22EEEE2E2E2EzEerree 204.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng nồng độ chất khứ trùng Ca(OCI)2 đến khả năng tái sinh

ga Quế lụt DHEsseeseeertsnonietondirdnngonisyig000.000E000n001600009001G0238G20g908.00101E000100518000000 8 204.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng Ca(OCI)s đến khảnăng tái sinh của Qué lan hương -+-2+©22+2++222++2E++22E+2EEEttrxrtrrrrsrrrrrrrree 204.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của môi trường bổ sung các dịch chiết hữu cơ đến sự sinhtrưởng và phát trién của chồi Qué lan hương - 2-2222 2222+2Ez+£E+22+zzzzzzzzzxz 224.2.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền củ đậu sự sinh trưởng vahif†:triểm chối: Quố Tan HN «.xsseseeseeceieeesinkasketbinasigieobinSSEEEu240303122,4010330.46G2010-kE040 224.2.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát anh hưởng của dịch nghiên cà rốt sự sinh trưởng và pháttrién 09 /1089)/:8:ốni ANH 244.2.3 Thí Nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối sự sinh trưởng vàphát triển chối Quế lam H0 HD seeesessesononistnristit06094000/0010001060/000340001/1310100146 000000 254.3 Nội dung 3: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tao rễ của Qué lan huong 264.3.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của Quế

Tan DUONG ee eee 27

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, 2: + 22522 22 2221212112121 21 xe, 30

A ee

| ene.TÀI LIEU THAM KHẢO -2- 2 525E22E22E2E22E12122112122112112112112112112112112121.2Xe2 31

PHỤ LỤC

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

2,4-D : 2,4D-dichlorophenoxy acetic acid

BA : 6-benzyladenine

Ctv : cộng tác viên

EDTA -FeEDLA : acid ethyacidlene diaminetetraacetic - iron chelate

IAA : Indole acetic acid

IBA : Indole butyric acid

LLL : lần lặp lại

NAA : Naphthalene acetic acid

NOA : naphthoxyacetic acid

PLBs : Protocorm like bodies

TDZ : Thidiazuron

Vil

DANH SÁCH CAC BANG

Trang Bảng 2.1 Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) -++s++sxc+ecexeexes 7

Bang 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Ca(OCI)2 lên kha năng tái sinh chồi

Cl cTc==———xrx=x——————— 16

Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ củ đậu đến quá trình sinh trưởng và phát sinh chdi 17

Bảng 3.3 Anh hưởng nông độ cà rốt đến quá trình sinh trưởng và phat sinh chồi 17

Bang 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chuối đến quá trình sinh trưởng và phát sinh chi 18

Bang 3.5 Ảnh hưởng nồng độ NAA và đến tạo rễ của Qué lan hương - 18

Bang 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Ca(OC)› đến kha năng tái sinh của Qué lan hương Bang 4.2 Ảnh hưởng của dịch nghiền củ đậu đến sự sinh trưởng và phát triển chồi Qué lạn hương sau 60) NP ay GuspscpnuzgcstiartioiogoigtcicbiaStisaBIDTSSEEEDGEASgg0EEG-,RSISSEREEDSSEMSEMRAIEồBSg-iGBABi 23 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt đến sự sinh trưởng và phát trién chồi Qué IE080x0i15g`:80000:1) T1 24

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến sự sinh trưởng và phát triển chồi Quế

lan,Hương Sa BO HAY Lá các böginubinggãggiếnguingoĩngỹ sees vapacese mete eee mean eens 25

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tao rễ của Qué lan hương sau 60 ngày 28 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của NAA đến hình thái rễ 2- 2-52 2S+2E+2E+2E22E22Ezzzzze2 29

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hirifftf.1 Chế [bạ TT seccdusugioiicoguufGEgit0SGig5SigiG04á30g88000013G1uc058g00xJ2ugi042g0gã08614,c-0u5ÃHình 4.1 Hạt Qué lan hương sau 60 ngày nuôi cấy :-©22¿©252+22++22vzsccscez 22Hình 4.2 Chồi Qué lan hương sau 60 ngày nuôi cấy -2¿©2+52+zcc++cszz 27Hình 4.3 Ré Qué lan hương 60 ngày nuôi cấy -2-©22222++22++2zz+cszz 29

IX

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Với sự phát triển vượt bậc của nền kinh tế, con người không chỉ nâng cao về nhucầu vật chất mà còn bổ sung thêm về kiến thức và tiếp cận những thành tựu khoa họccông nghệ mới Bên cạnh đó, con người còn chú trọng đến những giá trị tinh thần, nhữngniềm vui đơn giản trong cuộc sống Vì vậy, việc lựa chọn một loại cây, loại hoa đề trang

trí trong nhà hay xung quanh vườn sẽ mang lại cảm giác thư thái, dễ chịu sau một ngày

làm việc mệt mỏi Trong số đó, lan là loài hoa biểu tượng cho sự thanh cao, quý phái,vương giả trong thế giới hoa và mang nhiều ý nghĩa sâu sắc trong cuộc sống con người.Lan có nhiều loài, mỗi loài mang một nét đẹp riêng với màu sắc rực rỡ và hình dang độcđáo, cái đẹp của lan được thể hiện qua những đường nét tao nhã của cánh hoa và hìnhdạng của thân, lá nên được rất nhiều người yêu thích

Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là khuvực thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật Nhiều loài lanrừng không chỉ cho hoa đẹp, lâu tàn, màu sắc và hương thơm rất đa dạng mà còn có giátri về được liệu như các loài thuộc chi Coeogyne, Aerides, Cymbidium, Dendrobium,Paphiopedium va một số loài thuộc chi Anoectochilus, Dendrobium Trong những chilan này, Qué lan hương (Aerides odorata Lour.) thuộc chi Aerides (Giáng hương) là loàilan có nhiều ưu điểm như hình dáng, màu sắc đẹp, đải hoa đài, hương thơm đễ chịu vàđộc đáo nên rất được ưa chuộng trên thị trường làm hoa cắt cành và trồng chậu Khôngchỉ có giá trị thẩm mỹ, Qué lan hương còn có giá trị về kinh tế và giá trị được liệu Bởi

vì hương thơm loài lan này có mùi đặc trưng của qué và khó phai nên Qué lan hươngđược sử dụng dé tách chiết lấy tinh dau nhằm mục đích phục vụ cho ngành mỹ phâmcũng như tạo hương nước hoa (Nguyễn Văn Việt và ctv, 2016) Ngoài ra, một số nghiêncứu chỉ ra gần bên trong Qué lan hương có chứa nhiều hợp chat có gia trị được liệu cao.Tuy nhiên, Qué lan hương đang đối mặt với nguy cơ suy giảm do việc khai thác quámức dẫn đến cạn kiệt cùng với môi trường sóng bị thu hẹp do nạn phá rừng, cháy rừngngày càng nhiều và tỷ lệ hạt nay mầm trong tự nhiên thấp Năm 2017, Qué lan hương

đã được đưa vào danh mục Cites về các loài cần được bảo tồn do khu vực phân bồ trong

tự nhiên bị hạn chế (Phùng Thị Hà và ctv, 2023) Dựa vào tính toàn năng của tế bào dé

bảo tồn loài lan này thì công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp hiệu quả

và sử dụng phố biến trong nhân giống các cây trồng có giá trị với hệ số nhân giống cao

tạo ra số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, cây con được tạo ra sạch bệnh và

khỏe mạnh khắc phục được những khuyết điểm của các phương pháp truyền thống Cómột vài tác giả đã nghiên cứu về quy trình nhân giống Qué lan hương (Aerides odorataLour.) như Devi và ctv (2013) đã tạo được callus từ mảnh mô lá Qué lan hương và hìnhthành chồi từ callus; Nguyễn Văn Việt va ctv (2016) đã nghiên cứu thành công nhângiống Qué lan hương bằng kỹ thuật nuôi cay in vitro Tuy nhiên hiện nay trên đối tượngQué lan hương chưa có nghiên cứu cụ thể nào về việc bổ sung dịch nghiền hữu cơ vàomôi trường nuôi cấy in vitro Dịch nghiền hữu cơ là nguồn cacbon tự nhiên chứa nhiềuvitamin, chất xơ, hormone tự nhiên, protein và khoáng chất có tác dụng kích thích sựsinh trưởng và phát triển của cây (Nguyễn Thị Cúc và ctv, 2014) Do đó, đề tài “Khảosát môi trường bồ sung dịch nghiền hữu cơ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và pháttriển của chồi Qué lan hương (Aerides odorata Lour.) bang kỹ thuật in vitro” được thực

Xác định được nồng độ NAA thích hợp đến khả năng ra rễ của Qué lan huong

1.3 Nội dung thực hiện:

Nội dung 1: Khao sát nồng độ chất khử trùng Ca(OCl)2 đến khả năng tái sinh củaQué lan hương

Nội dung 2: Khao sát ảnh hưởng môi trường bổ sung dịch nghiền hữu cơ củ đậu,

cà rốt và chuối đến sự sinh trưởng và phát triển của ch6i Qué lan hương

Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA thích hợp đến khả năng tạo rễ Quế

lan hương.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về Quế lan hương

Loài : Aerides odorata

Tén goi khac : Qué thang 8, lan Qué trắng, Qué Hòa Bình

2.1.2 Nguồn gốc

Quế lan hương thuộc chi Lan Giáng hương (Aerides) một trong khoảng 21 loài lantrên thế giới và được tìm thấy đầu tiên bởi một nhà truyền giáo Joannis de Loureirongười Bồ Đào Nha, ông tìm thấy loài này ở Thừa Thiên Huế (Kocyan và ctv, 2008).Qué lan hương cùng họ với tam bảo sắc, đuôi cáo, sóc lào Loài này sống ở các vùngnhiệt đới 4m và cận nhiệt Châu A như Trung Quốc, Lao, Campuchia, Thái Lan Do có

bộ rễ phát triển nên cây đễ thích nghi với môi trường và có sức tăng trưởng mạnh Ở

Việt Nam Qué lan hương phân bố từ Bắc đến Nam: Tam Đảo, Yên Bái, Huế, đèo HảiVân, Nghệ An, Thanh Hóa, Sơn La, Tây Nguyên (Nguyễn Ngọc Tuan, 201 1).

có chấm tím nhỏ phụ thuộc vào chế độ sáng

Qué lan hương thuộc dạng lá đơn, thuôn dai, be lá ôm thân, phiến lá dài 20 — 30

cm, rộng 3 — 3,8 cm Mép lá nguyên, dau lá chia hai thùy không bằng nhau, hệ gân songsong, gân chính nổi rõ, các gân bên tạo thành đường song song với gân chính, chìmtrong phiến lá, màu nhạt hơn màu của phiến lá Màu mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới

Lá mọc cách nhau tạo thành hai dãy đối xứng qua thân

Hoa Qué lan hương tập hợp thành cum tao thành chùm, cụm hoa dài 20 — 42 cm,cong, rủ xuống, mỗi chùm mang 15 - 36 hoa Hoa có mùi hương của qué rat đặc trưng.Hoa khi mới nở có màu xanh cốm, rồi chuyên dần sang màu ngà vàng và cuối cùng là

màu trắng Hoa có đường kính nở căng 2,8 — 3,5 cm, đối xứng hai bên Đài và tràng có màu lục nhạt, dài 1,2 — 1,8 cm Cánh hoa dài 2,3 — 2,8 cm, mau trang, cuộn lại có hình

ống rộng, tận cùng chụm lại thành một cựa cong ra phía trước, màu xanh đậm hơn tràng,chia 3 thùy Hoa xuất hiện vào cuối tháng 7 — tháng 8, nở hoa tháng 9 và kết thúc ra hoađầu tháng 11 Thời gian ra hoa kéo dai 3,5 tháng, với 1 — 2 cụm hoa/cây

Ré Qué lan hương mọc ra từ mau thân, xen kẽ với lá và buông rủ trong không khí,hình thái rễ chia thành hai phần rõ rệt: phần rễ màu xám trắng chiếm hầu hết diện tíchcủa rễ và phần đầu rễ có màu xanh lục với những rễ dang phát triển hoặc có màu nâu đỏkhi rễ tạm ngừng sinh trưởng Qué lan hương thuộc kiểu rễ bì sinh (còn gọi là biểu sinh,

phụ sinh) (Phùng Thị Thu Hà và ctv, 2023).

Quả nang hình trụ ngắn phình ở giữa, có 3 — 6 đường nứt đọc Khi chính quả nở

ra, mảnh vỏ còn dính lại ở phía đỉnh và phía gốc Khoảng 5 — 6 tháng thì qua chín Hatlan nhiều, nhỏ liti, chưa phân hóa, xốp, không khí chiếm khoảng 76 — 96% thé tích của

vỏ hạt Trong tự nhiên, phần lớn hạt đều chết đo phải cần có nắm cộng sinh hỗ trợ chất

dinh dưỡng dé hạt nay mam, để nảy mam trong môi trường tự nhiên, hạt lan cần phải

gap một loại nam rễ đặc biệt và có thé phụ thuộc vào một loại nam khác ở giai đoạnsống tiếp theo Mối quan hệ cộng sinh giữa hoa lan và nắm đóng một vai trò thiết yêu

trong quá trình nảy mam của hạt và sự phát triển của cây con (Ngô Thị Nguyệt và ctv,

2013; Franceschi và ctv, 2019).

2.1.4 Điều kiện sinh thái

Nhiệt độ: cây phát triển mạnh trong môi trường am áp và âm ướt với nhiệt độ từ17°C đến 30°C

Độ ẩm: Qué lan hương cần độ âm cao khoảng 70% Cần phải tưới nước thườngxuyên, tưới vào sáng sớm hoặc chiều tối khi ánh nắng dịu

Ánh sáng: loài cây ưa nang nhưng ánh sáng phải vừa phải hoặc bóng ram Khi ánhnẵng quá nhiều lá cây sẽ vàng, ánh sáng ít lá cây có màu xanh đậm, không ra hoa

2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro

2.2.1 Giới thiệu về kỹ thuật nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng dé chỉ quá trình nuôi cấy vô tring in vitro các bộphận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cay mô dùng cho cả hai mục đíchnhân giống và cải thiện di truyền (vi dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sảnphẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý Nuôi cấytrong điều kiện vô trùng bằng cách đặt các mô vào ống nghiệm có môi trường dinhdưỡng phù hợp Kỹ thuật này có thể áp dụng cho nhiều loại cấu trúc thực vật, từ nhữngcau trúc có tổ chức như đỉnh sinh trưởng, chỗi bat định, phôi cho đến những cấu trúckhông có tô chức như mô sẹo, dịch huyền phù, tế bào trần

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thựcvật dé chứng minh cho tính toàn thé của tế bao Theo ông mỗi một tế bào bat kỳ của một

cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đề phát triển thành một cá thể hoànchỉnh Như vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thê đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượngthông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tếbào có thé phát triển thành một cơ thé sinh vật hoàn chỉnh Hon 50 năm sau, các nhàthực nghiệm về nuôi cay mô và tế bào thực vật mới đạt được thành tựu chứng minh chokhả năng ton tại và phát triển độc lập của tế bào Tính toàn thế của tế bào thực vật đãđược từng bước chứng minh Nỗi bật là các công trình: Miller và Skoog (1953) tạo được

rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá, Reinert và Steward (1958) đã tạo được phôi vàcây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch Đề biểu hiện tính toàn thế,các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) và sau

=)

đó là giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation) Hiện tượng tế bào trưởng thành trở lại

trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa (undifferentiation) được gọi là

phan phân hóa, trong khi khả năng dé các tế bào phản phân hóa tạo thành cây hoàn chỉnh(whole plant) hoặc các cơ quan thực vật được gọi là tái phân hóa Ở động vật, sự phânhóa là không thể đảo ngược trở lại Như vay, sự phân hóa tế bào là kết quả cơ bản của

sự phát triển ở những cơ thé bậc cao (Lê Văn Hoàng va Trịnh Ngọc Nam, 2008)

2.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

2.2.2.1 Giai đoạn 1: khử trùng mẫu cấy

Hầu hết các mô cơ quan của thực vật đều có thể được sử dụng làm nguyên liệunuôi cấy nhưng đề thành công cần phải phụ thuộc vào hệ thống môi trường sử dụng, loàithực vật và cách khử trùng mẫu cấy Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các mẫu cấy

vô trùng và vẫn có khả năng sinh trưởng đưa vào nuôi cấy in vitro Mẫu mô được vôtrùng thì thao tác ban đầu rất khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên thực hiện Vìvay, chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường đinhdưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh

2.2.2.2 Giai đoạn 2: tái sinh mẫu cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quátrình này được điều chỉnh chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokinin ngoạisinh bé sung vào môi trường nuôi cấy Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng táisinh cao hơn mô trưởng thành Mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh cho kết quảkhả quan trong tái sinh chi

2.2.2.3 Giai đoạn 3: nhân nhanh chồi

Giai đoạn này là giai đoạn then chốt của quá trình Dé tăng hệ số nhân, thường

được đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng(auxin, cytokinin) các chat bố sung khác như nước dừa, khoai tây, dich chiết nắm menkết hợp với các yếu té nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôicấy có thé nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành qua các cụm chồi hay kíchthích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tinh

2.2.2.4 Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh

Trong giai đoạn nhân giống, chồi được cấy chuyền thành từng cụm nhưng trướckhi chuyên chéi sang môi trường ra rễ thì chồi phải được tách ra riêng lẻ Đây là giaiđoạn các chéi đạt được kích thước nhất định (các chồi tùy thuộc vào loài thực vật), các

chéi được chuyển sang môi trường tạo rễ Giai đoạn này có thé kéo dai từ 2 — 4 tuần,

6

chất điều hòa sinh trưởng là auxin được bồ sung vào môi trường là nhóm hormone thực

vật quan trọng trong việc tạo rễ cây.

2.2.2.5 Giai đoạn 5: chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng củaquá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Trong điều kiện in vitro thì câycon có được môi trường sống lý tưởng, 6n định về đinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ

âm Trong khi điều kiện ngoài vườn hoàn toàn khác như dinh dưỡng thấp, ánh sángmạnh, nhiệt độ cao, không 6n định cây con dé bị sốc môi trường, dé mat nước, nhanhhéo và có thê chết Do đó, cần tạo điều kiện cho cây con có đủ thời gian dé thích nghĩdan với điều kiện tự nhiên và đạt tỷ lệ sống cao (Pham Thị Thu Ly, 2014)

2.2.3 Môi trường nuôi cấy mô

Bảng 2.1 Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

Thành phần Hóa chất Nông độ (mg/L)

KNO3 1900 NH4NO3 1650

Da luong CaCl2.H20 370

MgSOu.2HaO 440

KH2PO, 170

CoCh.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H:BO: 6,2

Vi lượng KI 0,83

MnS04.4H20 22,3 Na2Mo042H20 0,25 ZnSO4.H20 8,6

Na2EDTA.2H20 37,3 Fe-EDTA

2.2.3.1 Các nguyên tố đa lượng và vi lượng

Các nguyên tố thiết yếu trong môi trường nuôi cấy tế bào hoặc mô thực vật ngoàicacbon, hydro và oxi còn có các nguyên tố đa lượng như: nitơ, photpho, kali, canxi,magie và lưu huỳnh cần cho sự tăng trưởng và phát sinh hình thái (Saad and Elshahed,2012) Đối với cây trồng, các chất khóang đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví

dụ magie là một phan của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bảo, nitơ là thành phan

quan trọng của vitamin, amino acid và protein (Nguyễn Văn Hồng, 2009) Ngoài ra, các

nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho sự phát triển của tế bào và mô thực vật với hàmlượng ít như sắt, mangan, kẽm, bor, đồng và molybden Sắt thường là chất quan trọngnhất trong tat cả các vi chất dinh dưỡng Nguyên tổ này được sử dung làm citrate hoặcmuối tartrate trong môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, có một số van đề với các hợp chatnay là khó hòa tan và dé kết tủa của chúng sau khi chuẩn bị môi trường Đã có nhữngthử nghiệm để giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng EDTA — FeEDTA (Saad và

Elshahed, 2012).

2.2.3.2 Nguồn cacbon và năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro cây thường không có khả năng quang hợp nên chủ yếu phát

triển theo phương thức tự dưỡng (hoàn toàn sử dụng các chất đinh dưỡng từ môi trường)

Đề sử dụng được cần có nguồn cacbon từ môi trường đưa vào thông qua các loại đườngkhác nhau như: saccharose, maltose, fructose Hàm lượng đường bổ sung vào môitrường tuỳ thuộc vào loại mô nuôi cấy Tuy nhiên, hiện nay nguồn cacbon ưa chuộngnhất cho các loại môi trường nuôi cấy là đường saccharose, một số trường hợp sử dụngglucose và fructose thay thé cho saccharose thường nghèo carbohydrat so với nhu cầu

của thực vật (Saad và Elshahed, 2012).

2.2.3.3 Vitamin

Hầu hết các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tat cả các loại vitamin

cơ bản nhưng thường với số lượng dưới mức yêu cầu Dé mô có sức sinh trưởng tốt phải

bồ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Thực vật cần vitamin dé xúc

tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vitro thì mộtvài vitamin trở thành yếu tô giới hạn sự phát triển của chúng Các vitamin được sử dụngnhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) vàmyo-inositol Thiamin được coi là vitamin quan trọng và căn ban cần thiết cho sự tăngtrưởng của tất cả các tế bào Vitamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1

— 10 mg/L Acid nicotinic va pyridoxine thường được bồ sung vào môi trường nuôi cấy

8

nhưng cũng không can thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật Acidnicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1 — 5 mg/L, pyridoxine được sử dụng vớinồng độ 0,1 — 10 mg/L Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của

vitamin Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được

chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật Người ta chorằng myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa

thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia

tế bào Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thựcvật ở nồng độ 50 — 5000 mg/L Inositol thường được nói đến như là một vitamin kíchthích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nókhông phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp Các vitamin khác, đặc biệt là

nicotinic axit (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin BS) va biotin cũng được sử

dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cay (Lé Van Hoang va Trinh Ngoc Nam,

2008; Saad and Elshahed, 2012).

2.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bé sung một hoặcnhiều loại chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết

dé kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan như kéo dai thân, phát dục

và ưu thế ngọn cung cấp sức sống tốt cho mô và các tô chức Tuy vậy, yêu cầu đối vớinhững chất này thay đối tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh

trưởng nội sinh của chúng.

Auxin có tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của tầngphát sinh, quả Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kíchthích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chỗồi bên, kim hãm sự rụng hoa, rụngquả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sựphân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vaitrò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sựphát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều hoà khác đảm bảocho sự tạo thành khối các tế bao đang phân chia thành cơ thé thực vật hoàn chỉnh Môitrường nuôi cấy thường được bổ sung các nhóm auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA,

2,4-D và NOA IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn lại là các auxin nhân

tạo Thông thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hon do đặc điểm phân tử của

chúng nên các enzyme oxy hóa auxin không có tác dụng Trong sô các auxin thì IBA và

9

NAA thường được sử dụng trong môi trường tạo rễ và phối hợp với cytokinin cho môitrường ra chồi (Nguyễn Quang Dam, 2009; Nguyễn Thị Quỳnh Trang, 2020).

Cytokinin là dẫn xuất của adenin, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự

phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các loạicytokinin thường được dùng trong nuôi cấy bao gồm: BA, BAP, TDZ, Zeatin Kinetin

và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tếbào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào Ngoài ra, cytokinin còn tác dụnglên quá trình trao đồi chất, tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tínhcủa một số enzyme Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thé hiệnbằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết củahiston với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA Tác động phối hợp của auxin vàcytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và

mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho

sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức

độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) (Nguyễn Văn Hồng, 2009;

Nguyễn Thị Quỳnh Trang, 2020)

Hiện nay, đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid Loại

gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3 Trong đời sốngthực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lýngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều đài củathực vật Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang sinhtrưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non Hiệu quả rõ rệt nhất của GA3 làkích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao thân, chiều dài cành, rễ, sự kéo dài củalong cây GA3 kích thích sự nay mam của hạt, củ nên nó có tác dụng đặc trưng trong

việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng GA có tác dụng hoạt hóa sự hình thành các

enzyme thủy phân trong hạt như a-amylase Enzyme này sẽ xúc tác phản ứng biến đổitinh bột thành đường, tạo điều kiện cho sự nảy mam Ngoài ra, GA có hiệu quả kích

thích sự ra hoa, phân hóa giới tính đực, kích thích lên sự hình thành quả và tạo quả

không hạt, điều chỉnh một số quá trình trao đôi chất và hoạt động sinh lí của cây (HoàngMinh Tắn và ctv, 2006; Lê Văn Hoàng và Trịnh Ngọc Nam, 2008)

2.2.5 Các hợp chất hữu cơ

Ngoài các chất điều hòa sinh trưởng thì môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vậtthường được bé sung một số hợp chất hữu cơ như nước dừa, dịch chuối, nước cốt cà

10

chua, dich nghiền khoai tây, dịch chiết nam men, dịch nghiền cà rốt, dịch nghiền củ đậu.Các hợp chất hữu cơ làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay các cơ quan nuôi cấy.

Dịch nghiền chuối: chuối khi chưa chín chứa các hợp chất khó tiêu, tinh bột kháng

và chất sơ, khi chín lượng tinh bột trong chuối phân hủy thành fructose và sucrose TheoPareek (2016) trong 100 g chuối có khoảng 74,91 g nước; 1,09 g protein; 12,23 g đường,

ngoài ra còn có các loại vitamin như A (3 pg), C (8,7 pg), E (0,1 mg), K (0,5 pg), B6

(0,37 wg) và các chất khoáng như canxi (5 mg), sắt (0,26 mg), magie (27 mg), photpho(22 mg), kali (358 mg), nito (1 mg), kẽm (0,15 mg) Một số nghiên cứu cho rằng dichnghiền chuối bé sung vào môi trường nuôi cấy mô giúp kích thích chỗi với khả năng tạoPLBs và sinh trưởng chồi (Netshiheni và ctv, 2019)

Dịch nghiền khoai tây: trong khoai tây chiếm phần lớn là nước khoảng 77% vàmột số thành phần khác như carbohydrate, protein, chất xơ, các loại khoáng, vitamin vàcác hợp chất hữu cơ carotenoit, phenol tự nhiên Carbohydrate chiếm chủ yếu trong tổng

số trọng lượng khô của củ dao động từ 66 — 90% Các loại khoáng chất bao gồm canxi

(1%), sắt (6%), magie (6%), kali (9%), photpho (8%) Vitamin gom B1 (7%), B2 (3%),B3 (7%), B6 (23%), C (24%) Do có nhiều thành phan quan trọng nên khoai tây được

bồ sung vào môi trường nuôi cấy mô có tác dụng làm tăng hàm lượng dinh dưỡng, ngoài

ra các hợp chất hữu cơ trong khoai tây giúp thúc đây quá trình phát triển của tế bào thực

vật (DereJe và Chibuzo, 2021).

Dịch nghiền cà rốt: nước ép cà rốt rất giàu carbohydrate và khoáng chất như canxi,

sat, photpho và magie rat cần thiết cho sự phát triển của cây Theo Shamar và ctv (2011)

cà rốt có độ âm thay đôi từ 86 đến 89% và có các thành phan hóa học quan trọng nhưprotein (0,9%), chất béo (0,2%), carbohydrate (10,6%), chất xơ thô (1,2%), tro tổng số(1,1%), canxi (80 mg/100 g), sắt (2,2 mg/100 g), photpho (53 mg/100 g) Bên cạnh đó

cà rốt có chứa một số thành phan như cytokinin, vitamin, acid amin va sterol nội sinh

Cà rốt được cho là loại rau củ giàu dưỡng chất chứa nhiều khoáng đa lượng, vi lượngnhư canxi, photpho, kali, magie, sắt va các loại vitamin A, C, B6, B12 Do có nhiéuthành phan đinh dưỡng nên cà rốt được sử dung trong rất nhiều lĩnh vực như y học, chếbiến thực phẩm, thủy sản, bỗ sung vào môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Puchooa

và Ramburn (2004), đã bổ sung nước ép cà rốt vào môi trường dé thực hiện nghiên cứutạo mô sẹo trên loài Daucus carota Năm 2017, Lê Quốc Việt và ctv đã nghiên cứu càrốt dé thay thế thức ăn viên trong nuôi tôm thẻ chân trắng

Dịch nghiền củ đậu: củ đậu sau khi được bóc vỏ có khoảng 90% nước, 2,4% tinh

11

bột, 4,51% glucose, 1,46% protid, 0,39% chất vô cơ Ngoài ra củ đậu còn giàu muốikhoáng sắt, photpho, canxi Bên cạnh đó củ đậu còn có công dụng chống oxy hóa, điềuhòa miễn dịch, chống ung thư, chống tiểu đường, kháng khuan, chống lão hóa (Đỗ TatLợi, 2004) Bồ sung củ đậu vào môi trường giúp gia tăng hàm lượng đường, các loạivitamin và các khóang chất quan trọng như canxi, magie, sắt, kẽm, photpho, kali Tuynhiên, những nghiên cứu trước đây đều nghiên cứu về hoạt chất sinh học để phục vụtrong y học như tiểu đường, ung thư, điều chế miễn dịch, chống oxi hóa và lão hóa

(Jaiswal và ctv, 2021).

2.3 Các nghiên cứu liên quan trong và ngoài nước

2.3.1 Nghiên cứu về Qué lan hương

Năm 2013, Devi và ctv nghiên cứu tạo sẹo từ lá và tai sinh chéi từ sẹo lá trên loàilan Aerides odorata Lour Kết quả cho thấy sẹo hình thành ở gốc lá sau 60 ngày nuôicấy, môi trường bổ sung 1 mg/L TDZ ghi nhận PLBs phát sinh ở gốc lá Môi trườngthích hợp nhân chồi và tạo rễ cho Aerides odorata Lour là 2 mg/L NAA kết hợp 4 mg/L

BAP (4,8 chồi/mẫu) va 0,5 mg/L NAA tốt nhất cho giai đoạn tạo rễ (7,5 rễ; 2,43 em)

Năm 2014, Hongthongkham và Bunnag đã nghiên cứu in vitro Aerides odorata

Lour Kết quả ghi nhận được là khi bổ sung riêng lẻ BA và NAA thúc đây sự hình thànhchổi và rễ ở 5 mg/L BA cho số chồi đạt 6,05 chồi/mẫu còn nồng độ NAA 1 mg/L cho

số rễ đạt 2,35 rễ Nhưng khi kết hợp BA với NAA thì day mạnh sự hình thành PLBs

Năm 2016, Nguyễn Văn Việt và ctv cho rằng nhân chồi thông qua việc tao sẹo từcác mô lá rat mat thời gian Do đó, ông đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro dé nghiêncứu quy trình nhân giống Qué lan hương (Aerides odorata Lour.) Kết quả ghi nhận thời

gian khử trùng quả bằng HgCl; trong thời gian 15 phút là tốt nhất, xác định được môi

trường nhân nhanh chéi thích hợp khi bổ sung 0,8 mg/L BAP, 0,4 mg/L Ki, 0,1 mg/LNAA, 100 m1/L nước dừa, 100 ml/L dịch chiết khoai tây và môi trường tạo rễ bổ sung0,3 mg/L NAA, 100 ml/L nước dừa, 100 ml/L dịch chiết khoai tây

Năm 2018, Jhansi và Khasim đã thực hiện nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn vàgây độc tế bào in vitro của Aerides odorata Lour Kết quả ghi nhận chiết xuất ethanolic

từ hoa Aerides odorata Lour là chat ức chế tiềm năng của các chủng E.coli Nghiên cứu

đã tìm thấy phenolic, flavonoids trong lá loài này có hoạt tính chống oxy hóa và hoạttính chống lại ung thư

Năm 2019, Katta và ctv tiếp tục nghiên cứu về hoạt động sinh học và chống ungthư trên loài lan Aerides odorata Lour Kết quả ghi nhận được khi phân tích hóa học sơ

12

bộ bằng các dung môi khác nhau trên 14 Aerides odorata Lour cho thấy sự hiện diện

của nhiều loại hoạt chất như flavonoid, glycoside, phenol, steroid, terpenoid và các hoạt

chất sinh học quan trọng khác khi thử nghiệm bằng những phương pháp và công nghệ

phân tích chuyên sâu Ngoài ra, nghiên cứu còn chứng mình dịch chiết dung môi ethylacetate và metanol có hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào MCF-7 va HeLa

Năm 2022, Nugraheni và ctv nghiên cứu tế bào học về loài lan Aerides odorata

Lour ở Sleman, Yogyakarta Nghiên cứu này với mục đích là xác định các giai đoạn

phân bào, số nhiễm sắc thé, hình thái nhiễm sắc thé và kiêu nhiễm sắc thé Kết quả thuđược hoa Aerides odorata Lour ở Sleman, Yogyakarta có các đốm trắng và tím, sốlượng nhiễm sắc thé là 38 (14 nhiễm sắc thể trung tâm va 24 nhiễm sắc thé ngoại tâm)

Năm 2023, Paraste và ctv thực hiện nghiên cứu đánh giá toàn diện về loài gồm khuvực phân bố, đặc điểm hình thái, phương pháp nghiên cứu, các loại nam nội sinh, cáchoạt tính sinh học và những khó khăn đối với việc phát triển Aerides odorata Lour

2.3.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2010, Hoàng Thi Giang và ctv đã “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi

trồng giống lan hài quý P hangianum perner guess (hài Hang) thu thập ở Việt Nam”.Kết quả thu được khi bé sung 100 g/L dich chiết chuối với 150 g/L nước dừa tốt nhấtcho việc nhân nhanh giống lan hài Hằng Đồng thời cũng là môi trường thích hợp chotạo chéi từ protocorm của lan hai Hang

Năm 2014, Nguyễn Thị Cúc và ctv thực hiện “Nghiên cứu ảnh hưởng của một sốhợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây lan hài Hồng (Paphiopedilumdelenatii) in vitro” Kết quả thu được khi bồ sung các nhóm hữu cơ đều gia tăng số chồi,

số lá Đặt biệt ở tảo spirulina vừa kích thích tạo chồi mà còn làm tăng tỷ lệ sống chomẫu cấy ở nồng độ 50 mg/L với tỷ lệ sống 100% Đối với nhóm chất hữu cơ chuối, nướcdừa, khoai tây thì chuối cho kết quả chéi tốt nhất ở nồng độ 20 g/L (3,8 chồi/mẫu) Còntrong nhóm pepton, tryptone và bột nam men, bột nam men tác động mạnh nhất đến quátrình tạo chồi với số chéi cao nhất 3,9 chồi/mẫu cấy ở nồng độ 1 mg/L

Năm 2014, Vũ Quốc Luận nghiên cứu “Ảnh hưởng của các chất bố sung hữu cơlên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan Vân hài (Paphiopedilum callosum)nuôi cấy in vitro” Nghién cứu bồ sung nước dừa, nước vo gạo, khoai tay, peptone, chuốimục đích là đề tìm ra chất hữu cơ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển củachi lan Vân hài nuôi cây in vitro Kết quả khi bé sung nước vo gạo ở nồng độ 200 m1/Ltốt nhất cho sự phát triển của cây sau 90 ngày nuôi cây Mặc khác, khi bồ sung bột chuối

13

100 g/L và khoai tây (100 — 200 g/L) cũng cho kết quả tốt về sự phát triển của cây cóthé thay thế nước dừa nhằm mục dich hạ giá thành mà chất lượng cây giống 6n định.

Năm 2020, Đặng Thị Thanh Tâm và ctv đã khảo sát “Ảnh hưởng của một số loạidịch nghiền hữu cơ đến sự kéo dài chéi in vitro lan (Dendrobium lituiflorum Lindl.)”.Kết quả thu được khi bô sung riêng lẻ các dịch hữu cơ khoai tây, đậu xanh nảy mam,chuối, củ đậu thì củ đậu và khoai tây cho kết quả tốt nhất về chiều cao chéi và khốilượng chéi trung bình của chéi in vitro Bên cạnh đó, khi kết hợp các dịch hữu cơ lại vớinhau thu được kết quả tốt nhất cho khả năng kích thích phát triển chiều cao chdi là 50

g/L khoai tây với 10 g/L đậu xanh và 50 g/L củ đậu với 0,5 g/L than hoạt tính.

Năm 2023, Trần Nguyên Chất và ctv thực hiện khảo sát “Ảnh hưởng của các dịchchiết hữu cơ đến sự hình thành chồi và rễ in vitro của Lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) Kết quả thu được khi khảo sát 5 loại dich chiết là chuối, cà chua, nước

dừa và khoai tây thì ở môi trường có bổ sung 200 ml/L dịch chiết cà chua cho tỷ lệ nhân

nhanh chồi cao nhất đạt 41,917 chồi/mẫu và lá đạt 30,5 lá/cụm chéi Còn môi trường bổsung 250 ml/L dich khoai tây ghi nhận kết quả tốt cho sự hình thành rễ (8,5 rễ/cây).Nhưng khi bồ sung 100 m1⁄L nước dừa thì chiều dài rễ là phát triển tốt nhất (1,306 cm).2.3.3 Nghiên cứu trên thế giới

Năm 2015, Chen và ctv thực hiện nghiên cứu trên Paphiopedilum spicerianum một

loài lan có số lượng rat ít ở Trung Quốc Trong nghiên cứu nhà khoa học đã bồ sung 10

g/L chuối vào môi trường đề thúc đây sự hình thành và phát triển cây con từ hạt của loài

Paphiopedilum spicerianum.

Nam 2015, Islam va ctv thực hiện khảo sát bố sung dich nghién hữu cơ vào môitrường nuôi cấy in vitro thúc day sự sinh trưởng và phát triển PLBs bằng hạt của loàilan Dendrobium sp Kết quả thu được khi bổ sung chuối vào môi trường ở nồng độ 25ml/L có tác động tốt nhất đến sự phát trién của PLBs

Năm 2017, Zahara và ctv đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các loại môi trường,nồng độ sucrose và các dịch nghiền hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển của loài lanPhalaenopsis hybrid Nghiên cứu thu được khi bổ sung 10% ca rốt cho kết quả tốt nhất

về chiều dài rễ (9,5 em), chiều dai lá (5,33 em) và chiều cao cây (6,33 cm)

Năm 2021, Herawati va ctv đã bố sung nước dừa và chuối vào môi trường MS đềkích thích sự tái sinh PLBs của lan Dendrobium gatton sunray Trong nghiên cứu kếtquả tốt nhất ghi nhận khi bổ sung nước dừa kết hợp với chuối ở cùng nồng độ 75 ml/Lcho sự phát triển của chồi Dendrobium gatton sunray từ PLBs

14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Đề tài được nghiên cứu từ tháng 3/2023 đến tháng 11/2023

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật BIO 203, khoa Khoa họcSinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:vật liệu ban đầu dùng làm mẫu để nhân giống là Quế lan

hương 2 năm tuổi tại nhà nhà vườn Mỹ Dung, Bình Định

Hóa chat sử dụng: xà phòng, ethanol, Ca(OCD)s, tween 20, môi trường MS pha sẵnmurashige and skoog medium (Duchefa biochemie), các chất hữu cơ (chuối, củ đậu, càrốt), đường saccharose, agar và chất điều hòa sinh trưởng NAA (Merck)

Thiết bị và dụng cụ: tủ cấy vô trùng, cân phân tích, máy do pH, nồi hấp khử trùng,

tủ sấy, tủ lạnh, máy lạnh, máy nước cất, dao cấy, pince, kéo, đĩa cấy, giấy cấy, đèn cồn,ống nghiệm, chai thủy tinh 500 ml, bình tam giác, ống đong, cốc đong

Điều kiện nuôi cấy:

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2500 - 3000 luxNhiệt độ phòng nuôi cấy: 24 + 28°C Độ am: 65%

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Nội dung 1: ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Ca(OC]); lên khả năngtái sinh chồi Qué lan hương

Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Ca(OCI)2 lên khảnăng tái sinh chồi Quế lan hương

Mục tiêu của thí nghiệm: xác định nồng độ chất khử trùng Ca(OCD); thích hợp

Vật liệu: quả Qué lan hương của cây 2 năm tuổi

Các bước tiến hành

Bên ngoài tủ cay: qua Qué lan hương được rửa sạch sơ dưới vòi nước, ngâm mẫutrong dung dịch nước rửa chén Lix Sau đó rửa lại 3 lần với nước cất Quả được rửa sạch

và lau với ethanol 70°.

Bồ trí thí nghiệm: mẫu được rửa lại bang ethanol 70° trong 60 giây và rửa lại vớinước cat vô trùng 3 lần Sau đó mẫu được lắc đều bang chất khử trùng Ca(OCI)2 với cácnồng độ thay đổi (5%; 10%; 15%; 20%) trong 15 phút, rửa lại với nước cất vô trùng 3

15

lần Qua sau khi được khử trùng tách vỏ quả và rãi lên môi trường MS có bổ sung 8 g/Lagar, 30 g/L saccharose Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên mộtyếu tố gồm 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại 10 chai.

Bang 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng Ca(OCI) lên kha năng tái sinh chồiQué lan hương

Nghiệm thức Nong độ Ca(OC]); (%) Thời gian (phút)

AI 5 15 A2 10 15 A3 15 15 A4 20 15

Chỉ tiêu theo dõi và ghi nhận: sau 60 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ xấu sạch (%) _ _ Tổng số mẫu sạch 100

Tổng số mẫu ban đầu

Tổng số mẫu sống sạch

Tỷ lệ mẫu sạch tái sinh (%) = x 100

Tổng số mẫu cấy ban đầu

3.2.2.2 Nội dung 2: ảnh hưởng hàm lượng dịch nghiền củ đậu, cà rốt và chuối đếnkhả năng sinh trưởng và phát triển của chồi Quế lan hương

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ củ đậu, cà rốt và chuối ảnh hưởng đến sựsinh trưởng và phát triển của chồi Qué lan hương

Vật liệu: từ kết quả thí nghiệm 1 chọn ra các chồi in vitro sống sạch với kích thướcđồng đều 0,5 cm làm vật liệu cho các thí nghiệm 2, 3, 4 và 5

Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng dịch nghiền củ đậu sự sinh trưởng và phát triểnchồi Quế lan hương

Bố tri thí nghiệm: chồi Qué lan hương cấy trên môi trường MS có bổ sung 8 g/Lagar, 30 g/L saccharose Thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên mộtyếu tố với các nồng độ dịch nghiền củ đậu thay đổi (0, 10, 30, 50, 70 g/L), 5 nghiệm

thức 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu là 135.

16