Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng và sự sinh tổng hợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseus L.G.Don

TÊN DE TÀI:“ Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng va sự sinh tonghợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseus L.G.Don.. Kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LÊ TRÍ NHƠN

KHẢO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONGTHUC VAT LEN SU TANG TRUONG VA SU SINH TONG HOP CHAT

ALKALOID CUA MO SEO CAY DUA CAN

CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON

CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOC

MA NGANH: 60.42.80

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Thị Thủy TiênCán bộ cham nhận xét 1: PGS TS Bùi Văn LệCán bộ chấm nhận xét 2: TS Trần Trung Hiếu

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Truong Dai học Bách Khoa, Dai học quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2014.

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ bao gồm:1 Chủ tịch hội đồng: PGS TS Nguyễn Đức Lượng2 Thư ký hội đồng: TS Nguyễn Tan Trung3 Ủy viên Phản biện 1: PGS.TS Bùi Văn Lệ4 Ủy viên Phản biện 2: TS Tran Trung Hiếu5 Ủy viên Hội đồng: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khiluận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KTHH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

-==OoQOO -NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Trí Nhơn MSHV: 12310743

Ngày thang, năm sinh: 02/04/1987 Nơi sinh: Mỹ Tho — Tiền GiangChuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80

I TÊN DE TÀI:“ Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng va sự sinh tonghợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseus L.G.Don ”

Il NHIỆM VU VÀ NOI DUNG:> Tạo và nhân giống cây in vitro.> Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu khởi đầu đến sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo

Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự hình thành, tăng sinh vàtong hop alkaloid của mô sẹo

> Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật và mật độ tế bào khởiđầu đến sự hình thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào

> Định tính và định lượng Vinca alkaloid thu được từ mô seo và huyền phù tế bào.IH NGÀY GIAO NHIEM VU : 01/2014

Iv NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 10/07/2014V CAN BO HUONG DAN: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Tp HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2014

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn chân thành tới quý Thầy Cô trường Đại họcBách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh và đặc biệt là các Thay Cô khoa Kỹ thuật Hóa Học.Luận văn được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ rất lớn từ Phó Giáo Sư — Tiến sĩ Lê Thị ThủyTiên, Cô đã truyền thụ phần lớn kiến thức chuyên ngành quý báu trong suốt 7 năm em họctập tại trường Cô luôn quan tâm nhắc nhở, động viên trong quá trình làm luận văn, chia sẻnhững khó khăn và giúp đỡ mỗi khi em cân truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm Côluôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoànthành được luận văn này Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô

Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến Phó Giáo Sư - Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hươngvà Tiền sĩ Huỳnh Ngọc Oanh đã quan tâm tạo điều kiện về thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm

và những góp ý trong quá trình làm luận văn.

Cũng không thể quên gửi lời cảm ơn tới Ths Trần Trúc Thanh, Ths Võ Thanh Phúcđã giúp đỡ về dung cu, hóa chất phòng thí nghiệm và những trao đổi trong quá trình thực

Xin gửi lời Chúc sức khỏe déi dào đến các Thay Cô, các bạn va gia đình

Xin chân thành cảm ơn.

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2014

Học viên thực hiện

Lê Trí Nhơn

TÓM TAT

Mô sẹo từ trụ hạ diệp của cây mam dừa cạn in vitro, đốt than in vitro và lá non củacây trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung kinetin 0,5 mg/1 kết hợp với

2,4-D (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l) hay NAA (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l).

Kết quả cho thấy thời gian tao seo từ trụ ha diệp của cây mam ngan hon từ đốt thân cay in

vitro va la non của cây trưởng thành ở các nghiệm thức khảo sát Sự cảm ứng m6 sẹo xảy ra

nhanh hơn đồng thời chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao hon ở môi trường có bồ sung kinetin và2,4—D so với môi trường có bố sung kinetin và NAA

Sự tăng sinh của mô sẹo trên môi trường MS bo sung kinetin 0,5mg/1 và 2,4 — Dnông độ 1,0 và 2,0 mg/l tốt nhất, mô sẹo có dạng xốp nên 2 nghiệm thức này được sử dụngcho mục đích tạo mô sẹo dé cung cấp nguyên liệu tạo huyền phù tế bao

Huyền phù tế bào hình thành và tăng sinh 6n định sau 3 tuần nuôi cấy Thể tích tế bàokhởi đầu có ảnh hưởng quan trọng đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào và thể tích 2,0ml tế bào khởi đầu/ 20ml môi trường lỏng có hiệu quả cao nhất

Vinblastine hiện diện trong mô sẹo trên tất cả các môi trường có 2,4 — D Với huyềnphù tế bao, vinblastine chỉ có trong tế bào được nuôi cay trong môi trường có 2,4 — D 0,5 hay2,0 mg/l Vincristine được ghi nhận có mặt trong mô sẹo va huyền phù tế bào trong nghiệm

thức có 2,4 —D 1,5 mg/l.

MỤC LỤC

TrangLOT CAM ON 0 iTOM v/v ii

MUC LUC 0 — iii

DANH MỤC HÌNIHH G5 G55 E5 E51 9 9 9 S9 9v gu eo viii0.(000004i5000007 7 ix0:0019)i905E0,0906)1000177 11.1 Tính cấp thiết của dé tài ch TT TT HT TH HT TH TT HH ru |

1.2 Mur tidu nghién CUU 011 2

1.3) NOi dung nghién CUU 20 ee — i 2

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAL LIEU 5-5- <5 << 5° <5 SE x5 sex £eeeseses 3

° IV) U0// 00000) (.0 :cctttddiddddii 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của cây dừa cạn ở Việt nam s5: 4

2.1.2 Giá tri y học của cây dừa Cạn - + 2020111101111 1111111111111 11 11v se 5

2.2 Hop chat vinca alkaloid c.ccccccsssessscsscscscecsecscescecscescsvscessvscseescuavsvacecsavavscesvacsenees 52.2.1 Hợp chất alkalOid - c6 E61 3 111K TS ST TH TT người 5

2.2.1 Phân loại alkaloid ou ceccceecccceccessccesscceecceessseesscsessseucesssccseesseeseeseeseeeesens 5

2.2.3 Vinca alkaloid của Cay dừa Cat cceccccccccccccccenseececcecceesseeeececeesseaaeseescssaaaeeesesees 7

2.2.3.1 Hợp chất Vinblastine 0 cccccscscecsssssessscscessssscescecscescevscsecsveesevscesvavseseevaes 72.2.3.2 Hợp chat Vincristine 0.c.cccccecsccescssceccsseececsceccevscescevsceecsvscseessevevscessavseeetevscee 82.3 Sinh tong hop alkaloid trong cây đừa cại s6 SE 911 SE ng neo 92.3.1 Sinh tổng hợp alkaloid trong dita cạn - + S6 SE 1S cv gg re 92.3.2 Cơ chế và tác dụng dược lý của alkaloid dừa cạn - << << << << << << +52 12

2.3.2.1 Tac dung i07 12

2.3.2.2 Cơ chế tác MUN cccccccsscsccssscssescesssvscssesvscsccsvsvscssvsvscasscesvacsensvevsceseasaeeees 132.4 _ Các kỹ thuật nuôi cay tẾ bào thực vật - c- ke k1 1T ng ng ngu 14

2.4.1 Tao mô seo từ mô hay cơ quan thực vật - - + S331 13+xssssss 14

2.4.2 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo mô sẹo 15

2A.2.2 CytOk min 1a 16

2.4.2.3 Gibberellin 0 a a 18

2.4.3 Sự tạo huyén phù té bảo c1 S91 v1 11 1 1 11g H1 HT Hàn ru 19

2.5 Tinh hình nghiên cứu trong nước và nước n8OàI + + << << sss 202.5.1 Tinh hình nghiÊn cứu trong nƯỚC - + + + << 5 2213101101011 1111111111115 11152 20

2.5.2 Tinh hình nghién cứu nước nØOảiI - - << c 3232101101111 1111111111115 111111132 21

CHUONG 3: VAT LIEU VA PHƯƠNG PHP 5- 5 5 5< 5s £seeseeeeseeses 25

SH 25

3.1.1 Vật liệu tạo cây mầm i7? VỈ/FO -c- «kh 1k1 5 1T TH TH HT ng 253.1.2 Vật liệu tạo chi 17 Vi/rO cv tr HH1 12k 25

3.1.3 Vật liệu tạo M6 SO - - CC CS 1102100210 TH HH ng ng nh cv 26

3.1.4 Vật liệu tạo huyền phù té bảoO - Sk 11v S311 51111 1 111g ng gu 283.1.5 Chat chuẩn dùng dé định lượng vinblastine ¿+ 6xx ke exeevserxes 28

3.2.3.1 Su hình thành va tăng sinh mô Se0 - << << 5+ S2Sx+sssssa 34

3.2.3.2 Sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tẾ - - 6S cevseseeevse 353.2.4 Phương pháp chiết xuất và định tính alkaloid diva cạn 5-6 se: 36

3.2.5 Phương pháp định lượng alkaloid dừa cạn - 5+ << << s<++++++sssss 37

3.2.5.1 Nguyên lý phương pháp LCMS c G0111 11.11111111 1 1 11112 37

3.2.5.2 Ứng dụng của phương pháp LCMS + + E + *E+kE*EsEkEsEsEeererseeecee 383.2.5.3 Thiết bi sử dung trong phương pháp LCMS ou cesecesessceseseesssssceseecseeees 38

4.1.1.1 Sự tạo sẹo trên môi trường có 2,4 — Ì) - scc s11 1111 1 111111111112 41

4.1.1.2 Su tạo seo trên môi trường CO NAA ccc ceececccccccecceeseeeceeeeceaeeeeseeeeceeeeeaeeees 44

4.1.2 Anh huong cua chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng sinh mô sẹo 47

4.1.2.1 Với auxin là 2,4 - Ï c1 1121212301101 10 1010 1 1 nh 474.1.2.2 Voi auxin là NA A c2 H10 11 0100111011 1k KT 49

4.1.3 Kết quả định tính alkaloid từ mô Se - - c5 << << S331 55xxssss 524.1.4 Kết qua định lượng vinblastine va định tinh vincristine của mô sẹo có nguồn gốc

TỪ MO SEO - CC Q0 01900 TH HT cu HT ch cha 56

4.1.5 Sự hình thành và tăng sinh của huyén phủ té bảo - - s5 S2 SE £e£seceei 574.1.5.1 Sự tạo huyền phù tẾ bảO ch 1n HT HH HT ng ro 574.1.5.2 Sự tăng sinh của huyén phù tế bảo G- «6 E13 E81 1E vn 584.1.5.3 KẾT Quả G1 11T TT TH TT TH TT HT HT TH TT TH TH ng gu 62

Đa -adaa 63

4.2.1 Vai trò của vật liệu khởi đầu trong sự hình thành mô sẹo - - ees 63

4.2.2 Vai trò cua auxin ngoại sinh lên sự hình thành va tăng sinh của mô sẹo 63

4.2.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào khởi đầu lên sự tăng sinh của huyền phù tế bào 644.2.4 Vai trò của auxin trong sự tong hợp hợp chất thứ cấp - - se se sex sersed 65CHƯƠNG 5: KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ, 2 5 <5 5 <5 << x<Ssx e9 cueg cu 675.I Kt luận S: 2 St 2t 221 1121111 11111111111111111111111111112111.1101111 011 Hee 675.2 _ Kiến nghị G- SH HT TT TT TH TT TH TT TH TT ng HH nh rkt 67TÀI LIEU THAM IKHÁOO 5 5- 25 << 2 E5 E9 999 91x 99v g9 ve 68

100000 2 Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC ANH

TrangẢnh 2.1 Cây và hoa dita cạn - ¿+ E131 S33 1111111815 1111111111111 1101111111011 re 4Ảnh 3.1 Qua va hat của cây dita cạn c1 TT TT HT TT TT ng HT ng ưyn 25Ảnh 3.2 Cây dừa cạn trưởng thành cung cấp vật liệu tạo ChOi 177 vi#rO ccccccecsssa 26Ảnh 3.3 Cây mầm dừa can 10 ngày tuỔi c- c1 E111 TT TH ng ng net 26Ảnh 3.4 Cây in vitro sau 8 tuần nuôi Gấy - - se SE 111121 111151111111 111 1111 ru 27Ảnh 3.5 Lá non dừa cạn dùng để tạo mÔ SẹO - ác tt n1 S1 9119115115111 11 1511111 ersrd 27Ảnh 3.6 Mô sẹo 6 tuân tuổi dùng để tạo huyền phù tế bảo 26s sex EsEseeeesed 28Ảnh 3.7 Chất chuẩn dùng dé định lượng vinblastine 5-6 xxx Eevseeereesed 28Ảnh 3.8 Thiết bị sử dụng trong phương pháp LCMS - 5-5 =2 + EeE+E+E+Eeeereesrred 38Ảnh 3.9 Bang giá trị chạy kết quả khi sử dung phần mềm LCMS 5+2 +£+s2 39Ảnh 4.1 Mô sẹo 1 tháng tudi từ trụ hạ diệp trên môi trường có 2,4 — D 2,0 mg/1 41Ảnh 4.2 Mô seo 2 tháng tuổi từ đốt than in vitro trên môi trường có 2,4 — D 2,0 mg/1 42Ảnh 4.3 Mô seo 1 tháng tudi từ lá non cây trưởng thành trên 2,4 — D 2,0 mg/1 43Ảnh 4.4 Mô seo từ trụ hạ diệp trên môi trường có NAA 2,0 mg/1 s +5 sss xe 44Ảnh 4.5 Mô seo từ đốt than in vitro trên môi trường có NAA 2,0 mg/l - +scscssa 45Ảnh 4.6 Mô seo từ lá non cây trưởng thành có NAA 2,0 mg/l 5-5 + + +£s£seeecxe 46Anh 4.7 Mô sẹo trên môi trường có 2,4 — D 2,0 mg/Ï -c- E3 SE sEeEekEeseekrersed 47Ảnh 4.8 Mô seo từ trụ hạ diệp cây mâm dừa can 2,4— D nông độ thay đối 49Ảnh 4.9 Mô seo tăng sinh trên môi trường NAA 2,0 mg/L -c- s56 se csEsEseesesed 50Ảnh 4.10 Mô seo từ lá non của cây trưởng thành trên NAA nông độ thay đổi 52Ảnh 4.11 Dịch chiét mô SẹO - - c-G SE E231 E1 158858811588 11 1158111111118 1111111 111111 ng 5SAnh 4.12 Dich chiết sau khi thử thuốc thử Wagner va Mayer - - sec sxcsrsesxcee 55Ảnh 4.13 Huyền phù tế bào khởi đầu trong thí nghiệm khảo sát mật độ tế bảo 58

Tỷ lệ mẫu cay tly tru ha di€p 01982 41

Ty lệ mẫu cay từ đốt thân in Vitro ta0 SO c.eececesssesesessscecscescscscsesesvecseseseseeees 42Ty lệ mẫu cay từ lá non cây dừa cạn taO SCO eeeeseececeececeseeeeceeeeeaseeseeeeeeeeeens 43Tỷ lệ mẫu cay tly tru ha di€p 01982 44

Ty lệ mẫu cay từ đốt thân in Vitro ta0 SO c.eececesssesesessscecscescscscsesesvecseseseseeees 45Ty lệ mẫu cay từ lá non cây dừa cạn taO SEO eeeeeesececcececeeeseeceeeeeaseesseeeeeeeeeans 46Sự tăng sinh cua mô sẹo trên mdi trường có kinetin và 2,4 — D 48

Sự tăng sinh cua mô sẹo trên mdi trường có kinetin và NAA - 50

Kết quả định tính alkaloid từ mô seo ở môi trường 2,4 — ÏD -. - 53

Kết quả định tinh alkaloid từ mô seo ở môi trường có NAA 54

Hàm lượng vinblastine trong mô sẹo trên môi trường có 2,4 — Ù 57

Kết quả định tính vincristine của mô sẹo trên môi trường có 2,4 — D 57

Chỉ số tăng trưởng của huyền phù tế bào trên 2,4 — D 1,0 mg/1 eee 59Chỉ số tăng trưởng của huyền phù tế bào trên môi trường 2,4 — D 2,0 mg/1 60

Kết quả định lượng vinblastine có truong huyền phù tế bào trên 2,4 - D 62

Định tinh vincristine đối với huyền phủ tế bảo trên môi trường 2,4 — D 62

Công thức hóa học của vinblastine - cc S33 1311111533 333111111111 5x xx2 7

Công thức hóa học của VINCTIStiNe 2+ << 232131311153 1311111111113 xx2 8

Con đường sinh tong hop vincristine va vinblastine - cescesesssesssceseeeeeeees 9Con đường sinh tong hợp vinblastine c.cccccescssccesesseececcessevscsseevscsecevecseeseaees 11Co chế ức chế hình thành cau trúc vi ống của Vinca alkaloid - 5+ 13Cau trúc hóa học một số auxin phổ 7:0 16Cau trúc hóa học một số cytokinin phổ bién wo ce cececesessscescecessessctscecscneeees 17Cau trúc hóa hoc co ban của Gibberellin ccccccccccecssseescescescesseseeseescesesscesceaesaes 18Quy trình chuyén mô seo va tạo huyền phù tế bảo - 5 5s sex secsrseexcee 20Tổng quát quy trình thí nghiệm - 6 2 SE SE SE SE vs re 29

Quy trình khử trùng hạt dừa cạñ << c2 231111 1111533311111 11 1551 5x x£2 30

Quy trình khử trùng đốt thân diva can -G- G + xxx E1 nen reg 32

Quy trình khử trùng lá non cây đừa cạn - <5 1111111111111 111155 53 5x x2 33

Quy trình chiết xuất và định tinh alkaloid từ mô sẹo - -:- 2z css++s£ss£+esss2 36

Mô hình hoạt động của phương pháp LCMS - «+ << << sssssssss 37

Quy trình thu và nhận định lượng vinblastine mô sẹo và huyền phù tế bảo 40

Sự tăng sinh cua mô sẹo trên môi trường có sự hiện diện của 2,4 — D 48

Sự tăng sinh của mô sẹo trên môi trường có sự hiện diện của NAA S1

Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào trong môi trường có 2,4 — D 1,0 mgil 59Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào trong môi trường có 2,4 — D 2,0 mgiI 61

CÁC TỪ VIET TAT% LCMS: liquid chromatography mass spectrometry

+ HPLC: high performance liquid chromatography+ FDA: Food and Drug administration

+ MSRT: Murshige skoogs revised tobacco& IAA: indolylacetic

= BA: benzyladenine

% NAA: naphthaleneacetic acid“ IPA: isopentenyladenosine

CHUONG 1: MO DAU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Dừa cạn mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới như Việt Nam, An Độ,Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Brazil Ở Việt Nam gặp nhiều nhất tại các tỉnhgan biển, nhưng khắp nơi đều trồng được, trước đây chỉ được trồng làm cảnh, gan đây đãđược trồng để thu hoạch lấy lá và rễ làm thuốc

Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai loại alkaloid vinblastinevà vincristine, là những chất ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu vớitubulin, protein vi ông ở thoi phân bào, ngăn cản sự tạo thành các vi ống và gây ngừng phânchia tế bào ở pha giữa Ở nồng độ cao, các hợp chất này có thé ức chế được tế bào ung thu,còn ở nông độ thấp làm ngừng phân chia tế bào

Vinblastine và vincristine ngoài tác động trên thoi vô sắc trong kỳ phân chia của tếbào còn có tác động đối với sự chuyển hoá của glutamate va aspartate Vincristine có khanăng ngăn can sự tong hop RNA và các protein, vinblastine có tac dung ức chế miễn dịch đốivới các tế bào khối u và ung thư

Vinblastine và vincristine có thé thu nhận bằng cách chiết xuất từ cây dừa cạn ngoài

tự nhiên, tuy nhiên làm lượng thu được rat thap Đề ồn định nguồn cung cấp sinh khối thực

vật có chứa các hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao, một giải pháp được các nhà khoa họcquan tâm đó là sử dụng kỹ thuật nuôi cay tế bào thực vật Một số hệ thống tế bào thực vat invitro có thé sản xuất ra những hợp chất thứ cấp với sản lượng cao hơn cây nguyên vẹn nếuđược nuôi cấy trong điều kiện thích hợp

Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăngtrưởng và sự sinh tong hợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseusL.G.Don” được tiến hành nhằm bước dau tìm hiểu và đánh giá khả năng thu nhận vincaalkaloid từ cây dừa cạn trồng ở Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khao sát ảnh hưởng cua auxin va cytokinin lên sự hình thành, tăng trưởng va kha

năng tong hợp vinca alkaloid của mô sẹo và huyền phù tế bao từ nhiều nguồn nguyên liệu

khác nhau.

1.3 Nội dung nghiên cứu

> Tạo nguồn nguyên liệu in vitro.> Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến sự hình thành và tăng trưởng của

mo sẹo.

> Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 — D va NAA kết hợp với kinetin lên sự hình thành, tăngsinh và tong hop alkaloid của mô sẹo

> Khảo sát sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tế bào

> Định tính và định lượng vinca alkaloid thu được.

CHƯƠNG 2: TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu cay dừa cạn

Giống Catharanthus (thuộc ho trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là câythân thao lâu năm Trong số đó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ An Độ,còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar Số lượng nhiễm sắc thé cho tat cảcác loài Catharanthus đều là 2n=16 Tám loài thuộc giống này đó là:

e = Catharanthus coriaceus Markgr Madagascar.

e Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon Madagascar.

e Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon Madagascar.

e = Catharanthus ovalis Markgr Madagascar.

e = Catharanthus pusillus (Murray) G Don India subcontinent.

e = Catharanthus roseus (L) G Don Madagascar.

e Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon Madagascar.

e = Catharanthus trichophyllus (Baker) pichon Madagascar

Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường được trồng dé làmcảnh Được biết đến nhiều nhất là Madagascar Periwinkle hay còn gọi là Vinca do kha năngchịu hạn và chịu nóng của nó Ngoài việc được biết đến như một loại cây cảnh, từ lâu dịchchiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loạithuốc chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành,chống viêm mắt, làm se da và ngày nay người ta còn tìm ra được một công dụng hết sứcquan trong của loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả

+ Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G Don, Vinca rosea L, Lochnera rosea

Reich.

+ Tên khác: bông dừa, hoa hải đăng, trường xuân hoa, dương giác, Madagascar

2.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của cây dừa cạn ở Việt nam

Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60 em, phân nhiều cành, câycó bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phan trên Moc thành bụi day, lá mọc đối,thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuồng lá hẹp nhọn, dài 4 — 6 cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhãn,mặt trên sam bóng, mặt dưới nhạt

Hoa trắng hoặc hồng có mùi thơm Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn Quả gồm 2đại, dài 2 — 4 cm, rộng 2 — 3 cm, mọc thăng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạchdọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ mau nâu nhạt, hình trứng, trên mặthạt có các hột noi thành đường chạy doc Mùa hoa quả gần như quanh năm

Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa âm và có khả năng chịu được hạn Trong điều kiệntrồng trọt, khi được cung cấp đầy đủ điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh,khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên Cây mọc từ hạttrong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu được xử lý có thé tăng lên 90% Cây trồng từ hạt rahoa sau 4-5 tháng Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chối khỏe

Nguôn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đôi dôi dào.

2.1.2 Giá trị y học cua cay dừa cạn

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và láphơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ va ít, làm thuốc điều kinh, taygiun, chữa sốt, săn đa, chữa bệnh ngoài da

Ở Nam Châu Phi, An Độ, châu Úc, quân dao Antilles người dan dùng tri bệnh đái

tháo đường Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và ly Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà

các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất chiếtxuất từ dừa cạn và dẫn đến sự phát hiện ra vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng cótác dung chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin

Ngoài ra người ta còn phát hiện ra tac dụng tây giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu

của catharanthin, vindolinin và vindolidin Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được

bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác, tuy nhiên có nhiều ý kiếnkhác nhau Mặc dù vay, vì hiện nay chưa có loại thuốc nào khác tốt hơn, nên nhu cau vềdừa cạn vẫn cứ tăng lên

2.2 Hợp chất vinea alkaloid

2.2.1 Hợp chất alkaloid

Alkaloid là nhitng chất hữu cơ có chứa dị vòng nito, và có tinh base Thường gặptrong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thay trong một vài loài động vat Dac biệt,alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối vớihệ thân kinh Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khinó là thần được trị bệnh đặc hiệu Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại

rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê.

2.2.1 Phân loại alkaloid

Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung và các

Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin.

Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin

Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin,

strychnin, brucin, veratrin, cevadin.

Nhom isoquinolin: Cac alkaloid sốc thuốc phiện như : morphin, codein,

thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.

Nhom phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin

Nhom indol:

+ Cac tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin.

+ Các ergolin: Các ancaloit từ ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, acid

lysergic.

+ Cac beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin.

+ Cac alkaloid từ chi Ba gac (Rauwolfia): reserpin.

Nhom purin: Cac xanthin ( caffein, theobromin, theophyllin).

Nhom terpenoit:

+ Cac alkaloid aconit: aconitin.

+ Các steroit: solanin, samandari (các hợp chat amoni bậc bốn): muscarin,

cholin, neurin.

+ Các vinca alkaloid: Vinblastin, vincristin

2.2.3 Vinca alkaloid của cây đừa cạn

Vinca alkaloid toàn phan có ở lá dừa can với ham lượng 0,37 — 1,15 %, than 0,40 %,

rễ chính 0,7 — 2,4 %, rễ phụ 0,9 — 3,7 %, hoa 0,14 — 0,84 %, vỏ quả 1,14 %, hạt 0,18 %

Có khoảng 70 loại alkaloid hữu ich đã được phát hiện từ Catharanthus roseus

(Svobda và cộng sự, 1991) Trong đó quan trọng nhất là vinblastine (vincaleukoblastine) và

vincristine (leuocristine).

Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013 — 0,063 %, ở bộ phận trên mặt đất 0.0015 %,ở rễ 0,23 %.Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0.0003 % - 0.0015 %

2.2.3.1 Hợp chất Vinblastine

+ Công thức phân tử: CygHsgN4Oo

% Tên hóa hoc: dimethyl (2B,3B.4B.5œ,12.,19øơ)- 15-[(5S,9S)- 5-ethyl- 5-hydroxy- (methoxycarbonyl)- 1,4,5,6,7,8,9, 10-octahydro- 2H- 3,7 methanoaza-cycloundecino[5,4-5]indol- 9-vl]|- 3-hydroxy- ló-methoxy- 1-methyl- 6,7-

9-didehydroaspidospermidine- 3,4-dicarboxylate

+ Tên gọi khác: vincaleukoblastine+ Tên thương mại: Cytoblastin

34 Phân bố: thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể Thuốc liên kết nhiều vớiprotein huyết tương Vinblastine ít qua hang rào máu não và không đạt nồng độ điều

trị trong dịch não tủy.

3# Chuyến hóa: vinblatine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan dé thành desacetylvinblastine là chất có hoạt tính mạnh hon vincristine, tính trên cơ sở khối lượng

Thai trừ: thuốc thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số dao thải dưới dạngthuốc không biến đổi

2.2.3.2 Hop chat Vincristine

Hình 2.2 Cong thức hóa học cua vincristine

+% Công thức phan tử: CasHs6NiOj0

“% Tên hóa học: methyl (18,9R,10S.11R,12R,19R)- 11-(acetyloxy)- 12-ethyl-

4-[(135.15S,1759)- 17-ethyl- 17-hydroxy- l3-(methoxycarbonyl)- 1,11 diazatetracyclo

[13.3.1.0°!2.0°'°lnonadeca- 4(12),5,7,9-tetraen- 13-yl]- 8-formyl- 10-hydroxy- methoxy- 8,16-diazapentacyclo [10.6.1.0°7.027.0'®!7] nonadeca- 2,4,6,13-tetraene-

5-10-carboxylate

% Tên gọi khác: leurocristine

3% Tên thương mại: Oncovin, Vincasar, Vincrex và cũng có thể gọi là sunlfat

vincristine.

4 Đặc điểm: là tinh thể hình phiến, điểm chảy: 218-220°

3 Phân bố: sau khi tiêm, vincristine nhanh chóng phân bố vào các mô cơ thé và gắn vớicác yếu tô máu đã hình thành, đặc biệt là hồng cầu và tiểu cầu Vincristine không xâmnhập hệ thần kinh trung ương với mức độ đáng kẻ.

3+ Chuyển hóa và bài tiết: vincristine được chuyên hóa nhiều ở gan Con đường thải trừchính là qua đường mật đi ra phân Một phan ba liễu dùng có thé được phục hồi trongphan trong vòng 24 giờ đầu và hai phan ba trong vòng 72 giờ Chỉ có 12 % liễu đượcbài tiết qua thận Khoảng một nửa liều được phục hồi trong phân và nước tiểu dướidạng chất chuyển hóa

2.3 Sinh tổng hop alkaloid trong cây dừa cạn

2.3.1 Sinh tong hop alkaloid trong dira can

Hình 2.3 Con đường sinh tổng hop vincristine va vinblastine

Vinblastine va vincristine duoc tao thanh tu su ghép nối của hai monomeralkaloid: catharanthine (indole) va vindoline (dihydroindole), ca hai déu xuat hién 6dang tu do trong cây Vincristine có cau trúc tương tự như vinblastine nhưng thay thé

Những alkaloid này được hình thành bởi sự kết hợp của hai nửa: một nửa làindole và một nửa là dihydroindole Vì thế, các hợp chất này được biết với tên gọi là

“dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid”’.

Su khac nhau cua Catharanthus alkaloid phu thudc vao loai alkaloid terpenoid

indole Hop chất gồm hai nửa bat nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt — conđường mevalonate tạo secologanin và tryptamin nhận được từ sự chuyển hóatryptophan Cau trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ.Một là indole nito (nửa bắt nguồn từ tryptophan) Và nguyên tử nito thứ hai được tao

thành từ sự tách rời của hai carbon tại vi trí B của vòng indole Secologanin bắt nguồn

từ acid mevalonic qua Co — geraniol (monoterpenoid) Geraniol được tạo thành, thông

qua một chuỗi chuyển hóa sẽ tạo thành dạng loganin và sau đó chuyển hóa thành

secologanin (một monoferpenoid glucoside).

Chất trung gian trong thuyết phát sinh sinh học của những alkaloid monoterpene

indole là 3a (S) — strictosidine, tạo thành từ sự ngưng hoạt tính enzyme của trytamine

và secologanin Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng quan trong này là strictosidine

synthase Strictosidine sau đó sẽ hình thành cấu trúc cathenamine (alkaloid loại

coryanthe) Enzyme liên quan ở đây là cathenamine synthase Cathenamine sau đó phải

trải qua một chuỗi các phản ứng dé dẫn đến sự hình thành catharanthin (alkaloid loại

iboga) và vindoline (alkaloid loại aspidosperma) Catharanthine và vindoline là các

alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây 3’,4’ — anhydrovinblastine là chấttrung gian từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline và các enzyme liên quan lànhững peroxidase Sau đó nó được chuyền thành vinblastine

Shikimate Pathway Mevalonate Pathway Methyl-erythritol phosphate (MEP) pathway

[ryptamine Secologanin

(Indole pathway) he D (Monoterpenoid pathway)

Strictoisidine

Cathenamineoor Tews,

" 1 Wee,

-"" ' See,oo" ! a,Roem Vv “ss.

Ajmalicine Tabersonine Catharanthine

Vinblastine được tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid:catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole) Mặc dù nhu cau sử dụngvincristine nhiều hơn so với vinblastine nhưng cây lại sản xuất ty lệ vinblastine nhiềuhơn Va bây giờ, các nha khoa học có thé biến đối vinblastine thành vincristine bằng

phương pháp hóa học hay thong qua phương pháp vi sinh hoc “microbiological

N-demethylation” sử dụng Streptomyces albogriseolus.

2.3.2 Co chế và tác dụng dược ly của alkaloid dừa can

2.3.21 Tác dụng được ly

Vinblastine hay còn gọi là vincaleucoblastine, là một chat ức chế cấu trúc viống Vinblastine được đồng ý đưa vào điều trị bởi tổ chức Food and DrugAdministration (FDA) năm 1961 và đã trở thành một thành phần chính của phươngpháp hóa trị liệu điều trị các tế bào mầm của tế bào ung thư, khối u ác tính và một sốloại lymphoma cấp cao, bao gồm u lymphoma Hodgkin, u lymphoma không Hodgkin,u sùi dang nam, tế bao ung thư phổi nhỏ, ung thư vú, ung thư tinh hoan tiến triển,

bướu thịt Kaposi, bệnh mô bao huyết, ung thư nhau, chriocarcinoma (một loại ung thu

tử cung),

Theo ghi chú trong lịch sử sử dụng vinblastine thì vinblastine có thể sử dụngmột mình hoặc kết hợp với các tác nhân khác để chữa bướu thịt Kaposi và ung thưbàng quang, ung thư vú và một vài loại u ác tính não Hoạt tính điều trị ung thư củavinblastine cũng hiệu quả như hoạt tính cua vincristine, song nó lại là một độc tố than

kinh.

Desacetyl vinblastine (vindesine) được xem như là dẫn xuất của vinblastineđược bán tong hợp bởi Potier va cộng sự Vinorelbine (5’-norhydro Vinblastine), cóhoạt tính chống ung thư rộng hơn và giảm phan ứng phụ là gây độc than kinh Hopchất này có cau trúc được sửa doi trên nhân catharanthine, kết qua là tang đáng kểlượng lipophilicity (chất có khả năng hòa tan trong chất béo và dung môi không phâncực) hơn so với Vinca alkaloid Có hiệu quả trong sự kết hợp với hóa trị liệu nhưanthracycline, fluorouracil và taxol Dược tinh chap nhận ở Mỹ trong việc điều trị tế

bào ung thư phối nhỏ, có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với cisplatin, và cũng

được dùng cho bệnh nhân bị ung thư vú.

Vincristine hay còn gọi là leurocristine, thường được dùng để điều trị khối u áctính ở trẻ em, có khả năng chống lại sự kết hợp rất nhạy cảm của bệnh khối u ác tính ởtrẻ em đối với vineristine và cho tác dụng tốt hơn khi dùng đúng liều lượng dành chotrẻ em Mặt khác, ở cả người lớn và trẻ em, vincristine là một thành phan cần thiếttrong liệu pháp hóa học để chữa viêm bạch cau cấp tinh, sự lên con làm vỡ lymphoidcủa bạch cầu myeloid mãn tính (chronic myeloid leukemia), và hai bệnh lymphoma

Hodgkin va lymphoma không Hodgkin Nó cũng đóng vai trò trong một vài liệu pháp

điều trị khối u Wilms, bướu thit Ewing, u nguyên bao thần kinh vàrhabdomyosarcoma, cũng tốt như trong điều trị đa u tủy (multiple myeloma) và tế bàoung thư phổi nhỏ (small-cell lung cancer) ở người lớn

2.3.2.2 Cơ chế tác dụng

Vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloidnày liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein vi ống ở thoi phân bảo và ngăn cản sự kếthợp của những cấu trúc hình ống có ở trong nguyên sinh chất của nhiều tế bào di

động ngăn cản sự tăng lên về sô lượng trong kỳ giữa gián phân của tê bào.

Indibulin and

' ) Vincas alkaloids la

Các vị trÍ gần trên vi Ong (*) vi Ong

Vincas & Indibulin iy

Các khôi Chat uc ché vị ông can thiệp

Paclitaxel lấp táp bang cách lắp ráp hay tháo rời vi

ống

Các khôi

tháo rời

Vinblastin có tác dụng chống ung thu còn do tác động đối với chuyển hoá củaglutamate va aspartate Va ở vincristin tác dụng chống ung thư còn do ngăn cản sựtong hop RNA va cac protein O nong độ cao, vincristine diệt được tế bao, còn ở nôngđộ thấp làm ngừng phân chia tế bảo.

Vinca alkaloid có tác dụng làm tăng nồng độ các phosphate acid và kiềm trongtinh hoàn và tuyến tién liệt của chuột cống trang Điều này chứng tỏ cao dừa can đãlàm biến đổi chức năng chuyển hoá và hoạt tính của phosphatase ở các co quan này

của chuột.

Vinca alkaloid còn có tác dụng ức chế mạnh hoạt tính của protease của cả haichủng T5 và T12 của nắm da Trichophyton rubrum Tac dụng ức chế hoàn toàn có ý

nghĩa ở những nông độ cao Ở những nông độ thấp, hoặc không ức chế, hoặc tác dụng

ức chế trên protease Cơ chế kháng nắm ở đâu là ức chế sự hô hấp của sợi nắm của cả

2 chủng 7.rbrum.

2.4 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật

2.4.1 Tạo mồ sẹo từ mo hay cơ quan thực vật

Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quanđã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật ) Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này, trừ các tế bào của môphân sinh, phải chịu một sự phản phân hòa trước lần phân chia đầu tiên (theo Halperin,1969) Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, cho phép một tế bào đã trưởng thànhtrở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa).Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạophôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987)

Các tế bảo thuộc các mô hoặc cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệpthường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin)để cho ra mô sẹo Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyền nhân do các tế bào nhu mô chịu sự

phản phân hóa còn do sự phân chia các té bào tượng tang, su xáo trộn trong các mô

phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan.

2.4.2 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo mô sẹo

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lí tế bàotrong quá trình nuôi cay Các ảnh hưởng đó bao gồm:

Làm tăng quá trình phân bào Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệtlàm tăng quá trình biệt hóa tế bao dé tạo ra những cơ quan riêng biệt của cây như rễthân lá Kích thích sản phẩm thứ cấp (sản phẩm bậc 2)

Trong quá trình nuôi cay tế bao thực vật người ta thường sử dụng các chất điềuhòa sinh trưởng thực vật để khiến những quá trình trên.Các chất điều hòa sinh trưởngthực vật thường được sử dụng với liều lượng rất nhỏ (hàm lượng 1 + 10 mg/l) Hầu hếtcác quá trình nuôi cay tế bào thực vật đều cần những chất điều hòa sinh trưởng như sau:

e Nhóm auxin (bao gôm IAA, IBA, NAA, 2,4-D).e Nhóm cytokinin (bao gom kinetin, BA, zeatin, IPA)

e Gibberellin.

2.4.2.1 Auxin

Auxin có vai trò quan trong trong sự tạo mô sẹo Trong môi trường nuôi cấy,auxin thường: kích thích sự phân chia tế bao tạo mô seo, kích thích sự tạo rễ bất định,gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất địnhchiếm ưu thế, khi nông độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô

Seo.

Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động củatầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thé ngọn, tính hướng động của thực

vật, sự sinh trưởng theo hướng của quả và tạo ra quả không hạt Auxin kích thích

sự sinh trưởng kéo dài của tế bao Nhưng nếu kích thích với hàm lượng quá cao sẽ

xảy ra hiện tượng ức chê ngược, lúc này auxin sẽ trở thành chât ức chê.

J” ies Se ;CH;COOH c¡ XC 1 C CH,

acid Iméole-3-bytyric acid 23 6tr iio acid =

2-methoxy-3,6-dichloro-(LAA) (IBA) benzoic acid

(dicarn.ba |Dan xuất indole Benzoic acid

HCOOH OCH;COOH c OOH

a-Naphthalene acetic acid a to 3y: acetic acid a-Naphthoxyacetic acid [LNaphthoxyacetic acid

Hình 2.7 Cấu trúc hóa học một số cytokinin phô biến

Có nhiều loại cytokinin được tìm thay trong cây Tuy nhiên, chỉ, loài vanhững yếu tố khác sẽ quyết định cytokinin nào là hiệu quả nhất Vai trò củacytokinin trong nuôi cay in vitro:

e Phân chia tế bao và tạo thành cơ quan: vai trò chính của cytokinintrong cây là kích thích sự phân chia tế bào

e Sự gia tăng kích thước của tế bao và cơ quane Su tượng rễ và sự phát triển rễ: cytokinin có thể kích thích hoặc ức

chế sự khởi dau và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử

lý.

e Sự phát triển nụ và chéi: cytokinin có khả năng kích thích chổi bênvà đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thé chồi ngon

Hình 2.8 Cấu trúc hóa học cơ bản của Gibberellin

Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây.Tuy nhiên ởnhững chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệuquả nhất Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của

thực vật như sự phát trién than, sự nảy mâm của hột, miên trang, tro hoa, phân hóa

giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa:

Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: các gibberellin đãbiết đều có khả năng kích thích sự vươn dai của thân hay sự phânchia té bào

Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: có nhiều biến dị thiếu khả năng sinhtong hop GA đã được phát hiện

Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng.Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: gibberellin có khả năng thúc day quá trìnhtrổ hoa trong nhiều loài thực vật

Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão

hóa.

2.4.3 Sự tạo huyền phù tế bao

Huyền phù tế bao là môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diệncủa những tế bảo soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi cóthể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn (theo Henshaw và cộng sự, 1965, Torres,

1989).

34 Y nghĩa của việc tạo huyền phù tế baoNuôi cay tế bào huyền phù thường khởi đầu băng cách đặt các khối mô sẹo bởtrong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi cấy, các tếbào sẽ dan dan tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường Sau mộtthời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kíchthước khác nhau Và đây là nhân tố quan trong trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấpdo các tế bảo không phân hóa trong nuôi cây huyền phù thường tạo thành một khối vàitrăm tế bào, các tế bao ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các té bào ởbên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối dé tạo thànhcác chất thứ cấp (Lee 2001)

Ngoài ra, huyền phù tế bảo còn được ứng dụng trong công nghệ chuyển gen nhưbắn DNA, dung hợp tế bào cũng như mọi thao tác ở mức tế bào

a Nguyên tắc tạo huyền phù tế bào

M6 seo phat

trien fo.2 Mô sẹo | Ongnghiém

> i

Cây chuyền ¬ Se “J Cây chuyên qua môi

s : ‡ meth Môi TH + x1) ị trường mới sau 4 -6 tuần

£ =! ran Xe%

Manh mồ

seo

Mô seo-:^— Moéitreonglong

Huyền phù tế bao Cây chuyên

Hình 2.9 Quy trình chuyền mô sẹo và tạo huyền phù tế bào

Huyền phủ tế bào được tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trường lỏngđược lắc liên tục, tương tự huyền phù tế bào cũng được ra từ cây mạ hay phôi

Đối với huyền phù tế bào được tạo ra từ mô sẹo thì muốn huyền phù được tốt,phải tạo được mô sẹo tốt tức là mô sẹo phải có khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp Môsẹo khi phát triển đến một lúc nào đó trên môi trường đặc sẽ chuyển sang môi trườnglỏng trong các bình tam giác và được lắc liên tục trong một máy lắc vòng với tốc độ lắcthích hợp Trong quá trình tạo huyền phù tế bào, những điều kiện sinh trưởng như môitrường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ hay thành phân các chất kích thích cũng tương tựnhư lúc tạo mô seo, hoặc nếu có thay đôi thì chỉ thay đổi rất ít (theo Torres, 1989)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

a Trần Văn Thanh và cộng sự, 1996 và 1999 đã chiết xuất alkaloid toàn phần từrễ, làm giàu ajmalicin bằng phương pháp hydro hóa serpentin, sau đó mới chiết xuấtajmalicin, tạo hiệu suất chiết xuất cao hơn gap 2 lần Vì những alkaloid này chỉ tồn tại với

một lượng nhỏ trong cây (vincristine thu được từ cây thuốc thô chỉ đạt hiệu suất0,0002%), vì vậy nếu muốn sản xuất thì ta phải cần số lượng rất lớn nguyên liệu thô dé

trich ly.

+ Mai Ngoc Tâm va cong su, 1997 đã chứng minh rễ dừa can ở vùng Nha Trang

chứa ajmalicin 0,18%, serpentin 0,27%, tetrahydroalstonin, tabersonin, lochnericin,

catharanthin va akuamin.

+ Năm 1979, Viện Quân Y 13- Quân khu 5 đã nghiên cứu sử dung cây dừa can

làm bài thuốc điều trị bệnh cao huyết áp và đã thử nghiệm thành công trên thỏ

3# Xi nghiệp dược TW II đã chiết thành công vinblastin để chữa ung thư bạch

4 Đào Hùng Cường và Lê Xuân Văn, trường Đại học Sư Pham Đà Nẵng (2011)nghiên cứu chiết tách hợp chất alkaloid trong rễ cây dừa cạn ở Bình Định

4 Bui Văn Lệ và Nguyễn Hồng Ngọc (2006) trường đại học Khoa học tự nhiênvà đại học Tôn Đức Thắng đã khảo sát các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường

saccharose lên dịch nuôi cây huyền phù tê bào dừa cạn C roseus.

2.5.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

& Sự tái sinh cây từ những tế bào mô seo đơn bội hay lưỡng bội C.roseus trênmôi trường bố sung những chất điều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và ÿ-

indolylacetic acid (AA) đã được thực hiện bởi Abou-Mandour và cộng sự (1979).

4 Phuong pháp cho tần số cây C.roseus tái sinh cao bằng cách tạo phôi soma đãđược mô tả bởi Kin và cộng sự (1994) Tác giả thu được mô seo từ bao phan C.roseus từmôi trường MS ran bồ sung NAA 1.0 mg/l va kinetin 0.1 mg/l Phôi soma hình thành saukhi chuyển những mô sẹo nay vào môi trường lỏng có thành phan tương tự Những câyđược trồng như vậy sẽ có cùng số lượng nhiễm sắc thể như cây trồng từ hạt (2n=16)

+ Krueger và cộng sự (1982) đã thu được cây con hoàn chỉnh từ hạt C.roseus nay

cay cho thay sự tong hợp vindole nhanh chóng cùng rất nhiều hỗn hop alkaloid khác, baogồm cả những alkaloid không được tim thấy ở cây nguyên vẹn.

& Miura và cộng sự (1988) đã cô lập duoc vinblastine từ những chéi nonC.roseus in vitro từ những cây con nảy mam từ hạt Lượng vinblastine thu duoc là15ug/g chất khô va cao hơn trong mô seo (Miura et al 1987) Kết qua này cho thay ranglà sự san xuất vinblastine thì liên quan đến sự hình thành chôi

+ Furmanowa và cộng sự (1991, 1994) cũng đã thành công trong việc áp dụng

phương pháp nay cho sự nhân giỗng cây C.roseus Tác giả đã tái sinh những cây con từchéi ngọn và chổi nách Những chổi ngọn đã được cắt từ những cây con 7 ngày tuổi vànuôi trên môi trường rắn Nitsch và Nitsch (NN) (Nitsch và Nitsch 1969) được b6 sungthêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid (IBA) va IAA kết hợp với nhau Sau 2tháng nuôi cấy những cây con có rễ được cắt và chuyển vào môi trường mới dé tiếp tụctăng sinh Sau đó sẽ được phát triển trong nhà mái vòng bằng nhựa và trong nhà kính.Sau 5 tháng sinh trưởng, người ta sẽ thu nhận, sấy và cân Việc phân tích thành phần hóahọc của lá được thực hiện Vindoline và catharanthine chiếm ưu thế trong giai đoạn cònnon của cây (trước khi ra hoa) Hàm lượng alkaloid tong trong lá của những cây đượcnuôi cay in vitro rồi mới chuyển sang môi trường đất thì cao hơn những cây trồng chỉtrong đất

4 Marfori và Alejar (1993) đã cho thay kha năng sản xuất alkaloid của những môsẹo có nguôn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giỗng C.roseus trang và hồng tím Các tácgiả đã thu được tam dòng mô sẹo băng cách sử dụng môi trường LS bố sung BA 3.0mg/l, 2,4-D 0.5 mg/l và nước dừa Sau khi các mô được hình thành thì được chuyển vàomôi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trồng trong 1 năm.Hàmlượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tim và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ

4& Hirata và cộng sự (1994) đã chứng minh rang chất điều hòa sinh trưởng thựcvật rất quan trọng cho sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô, dẫn đến sự hìnhthành va phát triển của chồi C.roseus lam đa dạng hóa các alkaloid và làm tăng ham

lượng cua chung Tat ca choi non C.roseus hình thành với tân sô cao từ những hat nay

mam trên môi trường Murashige va Skoog bố sung BA 1.1 mg/l (Hirata và cộng sự

1987).

& Yuan và Hu (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của những sự kết hợp khác nhaucủa auxin, cytokinin và cường độ chiếu sáng lên sự hình thành của chéi cây C.roseustrong nuôi cấy in vitro Các tác giả đã chứng minh rang các chất điều hòa sinh trưởng BAvà NAA được b6 sung vào môi trường MS lần lượt là 7.0 mg/l và 1.0 mg/l có tác dụngkích thích sự hình thành chéi non, trong khi 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ứcchế sự phân hóa Cường độ chiếu sáng 550 — 700 lux có ảnh hưởng tốt khi kết hop đồngthời với môi trường MS bố sung BA 2 mg/l và NAA 0-1.0 mg/L

& Sử dung môi trường MS cơ bản có b6 sung BA và 2,4-D ở nồng độ thấp.Những chổi nách nay sẽ tăng sinh sau 4-5 tuần nuôi cây Các đoạn chéi này được chuyểnsang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng thực vật kéo dài Sau đó chúngđược cắt và cho tạo rễ in vitro trên môi trường MS bồ sung NAA giai đoạn nhà kính làgiai đoạn sau cùng Trong cả 2 trường hợp đều thành công

3 Moreno và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lênnhững con đường chuyển hóa khác nhau liên quan đến quá trình chuyển hóa hợp chất thứcấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào C.roseus

& Pietrosiuk va cộng sự (1999) đã thu được hai dòng mô sẹo C.roseus trang vàxanh trên môi trường Gamborg ran b6 sung 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA Mô sẹohình thành từ đoạn trụ dưới lá mam của cây mầm C.roseus Dòng mô sẹo trang đã đượcchọn từ những mô xanh phát triển trong pha tĩnh Trái ngược với sự răn chắc của dòngmô sẹo màu xanh, dòng mảu trắng lại mịn và mềm Phương pháp HPLC đã phân tích cácchất chiết từ mô sẹo của cả hai dong mô sẹo xanh va m6 sẹo trắng chỉ cho thay cac indolealkaloid tồn tại ở dạng vết và không có dược tính

3 Zhao va cộng sự (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng thu nhận được từ12 loại nắm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền

hóa chat và chất cảm ứng Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide va nam sợiAspergillum niger đã cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy

catharanthine.

& Satdive và cộng sự (2003) nghiên cứu anh hưởng những nồng độ IAA và BAkhác nhau lên sự sản xuất ajmalicine trong bình lac (shake flasks) bởi nguyên liệu là chỗiC.roseus Những chéi được nuôi trong môi trường MS có bố sung IAA ở nông độ cao vàBA ở nồng độ thấp, đã tích lũy một lượng lớn ajmalicine Với IAA ở nông độ thấp và BAở nông độ cao thì chdi sẽ giải phóng nhiều ajmalicine vào môi trường Quá trình sản xuấtajmalicine từ chéi nuôi cay thì không tương quan với tốc độ tăng trưởng Vinblastine và

vincristine không hiện diện trong chôi nuôi cay.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

Vật liệu su dụng trong thí nghiệm là cây dừa cạn Catharanthus roseus (L) G Don

được trồng tại Quận 1, Thanh phố Hồ Chí Minh

3.1.1 Vật liệu tạo cây mầm in vitro

Vật liệu: quả gia từ cây dừa cạn được sử dung dé lay hạt Chọn những hat gia, mauđen, day dan dé lam vat liéu tao cay mam

3.1.2 Vật liệu tao choi in vitro

Vật liệu: đốt than thứ 2 va thứ 3 (mũi tên đánh dấu màu đỏ) của cây dừa can được

trông ngoài vườn đê làm vật liệu tao choi in vitro.

Ảnh 3.2 Cây dừa cạn trưởng thành cung cấp vật liệu tạo chổi in vitro

3.1.3 Vật liệu tạo mô sẹo

%_ Trụ hạ diệp cây mam dừa cạn 10 ngày tuổi

v Lá

là » k3

: :

+ Dot thân từ chỗi dừa can in vitro sau 8 tuân nuôi cây

Ảnh 3.4 Cây in vitro sau 8 tuần nuôi cay

“& Lá non dia cạn từ cây trông ngoài vườn.

3.1.4 Vật liệu tạo huyền phù tế bào

Mô seo 6 tuân tuôi có nguôn goc từ trụ hạ diệp cây mâm dừa cạn trên môi trường

có 2,4 - D 1 hoặc 2 mg/l kết hợp với kinetin 0,5 mg/l dang ở giai đoạn tăng sinh mạnhđược sử dụng làm vật liệu tạo huyền phù tế bao

3.1.5 Chất chuẩn dùng để định lượng vinblastine

Chất chuẩn sử dụng là biệt dược vinblastine điều trị ung thư

Ảnh 3.7 Chất chuẩn dùng đề định lượng vinblastine