Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa (Oryza sativa L.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN LÊ NGÂN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN LÊN

KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY MẠ LÚA (Oryza sativa L.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2022

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Nguyễn Tiến Thắng

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa

(Oryza sativa L.) (Effects of oligochitosan on drought stress tolerance in rice (Oryza

sativa L.))

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Đánh giá ảnh hưởng của chitosan trọng lượng 573.170 Da và oligochitosan trọng lượng 30.143; 11.126; 5.994; 4.592 Da ở các nồng độ 25; 50; 75 và 100 ppm lên

sự sinh trưởng của cây mạ lúa IR64 trong điều kiện hạn (mannitol 30 g/L) in vitro

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2022V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và những lời động viên từ thầy cô, anh chị và các bạn cũng như từ phía gia đình Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

Toàn thể thầy, cô trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh; đặc biệt là các thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kĩ thuật Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cô PGS TS Lê Thị Thủy Tiên đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và luôn động viên tôi trong quá trình làm luận văn

Các thầy, cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ trong cuộc sống và xuyên suốt quá trình thực hiện luận văn

Một lần nữa, tôi xin được gửi lời chúc sức khỏe, lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy cô, các anh chị và các bạn Chúc mọi người gặt hái được nhiều thành công!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 9 năm 2022 Học viên thực hiện

Nguyễn Lê Ngân

iii

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của chitosan trọng lượng 573.170 Da và oligochitosan trọng lượng 30.143; 11.126; 5.994; 4.592 Da ở các nồng độ 25; 50; 75 và 100 ppm lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa IR64 trong điều kiện

hạn (mannitol 30 g/L) in vitro Khi gặp stress hạn, sự sinh trưởng của cây bị ức chế

đồng thời kích hoạt hệ thống kháng hạn của cây Sự bổ sung oligochitosan trọng lượng 11.126 Da với nồng độ 25; 50 và 75 ppm làm tăng khả năng chống chịu của cây mạ lúa để duy trì ổn định hoạt động sinh trưởng của cây Thông qua các biến đổi hình thái (tăng chiều cao cây và số lượng rễ) và sinh hóa (giảm tỷ lệ chất khô, hàm lượng đường tổng, proline, protein tổng và sắc tố)

iv

ABSTRACT

The study was carried out with the aim of evaluating the effects of chitosan weight 573,170 Da and oligochitosan weight 30,143; 11.126; 5,994; 4,592 Skin at 25 concentrations; 50; 75 and 100 ppm on the growth of IR64 rice seedlings under

drought conditions (mannitol 30 g/L) in vitro Under drought stress, plant growth is

inhibited and the plant's drought resistance system is activated The addition of oligochitosan weighing 11,126 Da with a concentration of 25; 50 and 75 ppm increase the tolerance of rice seedlings to maintain stable plant growth Through morphological (increase in plant height and number of roots) and biochemical (decrease in dry matter ratio, total sugar, proline, total protein and pigment)

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 9 năm 2022 Tác giả

Nguyễn Lê Ngân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây lúa 3

1.1.1 Nguồn gốc cây lúa 3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lúa 3

1.1.3 Thành phần hóa học của hạt lúa 4

1.1.4 Đặc điểm sinh lý của cây lúa 6

1.1.5 Sự sinh trưởng của cây lúa 7

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 9

1.2.1 Khái niệm về hạn 9

1.2.2 Tính chịu hạn và tác động của hạn tới thực vật 9

1.2.3 Cơ chế chống hạn 11

1.3 Giới thiệu về chitosan 14

1.3.1 Cấu trúc, tính chất của chitosan 14

1.3.2 Tác dụng của chitosan lên cơ chế chịu hạn của thực vật 15

1.4 Một số nghiên cứu về chitosan lên khả năng chịu hạn của lúa 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro 20

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hạn nhân tạo lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa 20

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa 21

vii

2.3 Phương pháp phân tích 23

2.3.1 Chỉ tiêu hình thái 23

2.3.2 Chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả 29

3.1.1 Ảnh hưởng của điều kiện hạn nhân tạo lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa 29

3.1.2 Ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa 31

3.2 Thảo luận 50

3.2.1 Ảnh hưởng của điều kiện hạn lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa 50

3.2.2 Ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan lên khả năng chống chịu của cây mạ lúa trong điều kiện hạn 50

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 60

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần trung bình (% khối lượng) của lúa gạo, có độ ẩm 14% 5 Bảng 3.1 Hình thái cây mạ lúa ở các nghiệm thức có nồng độ mannitol khác nhau 29 Bảng 3.2: Hàm lượng sắc tố quang hợp cây lúa ở các nồng độ mannitol khác nhau 30 Bảng 3.3: Hình thái cây mạ lúa trong điều kiện hạn với sự hiện diện của chitosan và

Bảng 3.4: Hình thái cây mạ lúa trong điều kiện hạn với sự hiện diện của chitosan và

Bảng 3.5: Hàm lượng đường tổng cây mạ lúa xử lý với chitosan và oligochitosan giai

Bảng 3.6: Hàm lượng prolin cây mạ lúa xử lý với chitosan và oligochitosan giai đoạn

Bảng 3.7: Hàm lượng prot in trong lá cây mạ lúa xử lý với chitosan và oligochitosan

Bảng 3 : Hàm lượng sắc tố quang hợp cây mạ lúa xử lý với chitosan và oligochitosan

Bảng 3.9: Hình thái cây mạ lúa trong điều kiện hạn với tác động của chitosan và

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan 15 Hình 3.1: Hình thái cây mạ lúa ở các nồng độ mannitol khác nhau 30 Hình 3.2: Hình thái cây mạ lúa trong điều kiện hạn với tác động hỗ trợ của chitosan và oligochitosan khác nhau 31 Hình 3.3: Hình thái cây mạ lúa trong điều kiện hạn với tác động của chitosan và

oligochitosan ở các nồng độ khác nhau 41

1

LỜI MỞ ĐẦU

Lúa gạo là nguồn cung cấp lương thực chính cho hơn một nửa dân số thế giới Ở nước ta, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân và được gieo trồng chủ yếu ở hai vùng đồng bằng Sông Cửu Long và đồng bằng Sông Hồng

Theo thống kê của Liên Hợp Quốc, đến năm 2030, dân số thế giới sẽ tăng lên 8,1 tỷ người, đồng nghĩa với việc nhu cầu lương thực cũng sẽ tăng theo nên việc đảm bảo an ninh lương thực cho dân số toàn cầu trở thành một vấn đề lớn Bên cạnh đó, ở Việt Nam, khoảng 35% tổng giá trị sản xuất nông nghiệp trong những năm gần đây là lúa gạo, nên lúa không chỉ có ý nghĩa về mặt an ninh lương thực mà còn có giá trị về mặt kinh tế cho người dân [1] Tuy nhiên, biến đổi khí hậu ngày càng phức tạp, tình trạng hạn có thể xảy ra vào bất cứ mùa nào và vùng nào trong năm

Lúa là loài cây trồng rất nhạy cảm với các điều kiện ngoại cảnh và là cây chịu hạn kém Ở Việt Nam, hàng năm trung bình khoảng một phần ba tổng số lương thực bị mất do thiên tai, trong đó hạn được xem là nhân tố chính làm giảm năng suất lúa

Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước chỉ mới tập trung vào việc lựa chọn giống và thay đổi cách thức canh tác nhằm nâng cao tính chịu hạn của lúa Tuy nhiên, các phương pháp này vẫn phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự nhiên của từng địa phương Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật mới để có thể áp dụng trong điều kiện biến đổi như hiện nay là cần thiết

Chitosan là dẫn xuất của chitin, được sản xuất chủ yếu từ vỏ tôm, cua và không gây độc với con người và môi trường Chitosan có khả năng kháng khuẩn, giúp tăng cường khả năng chống chịu với stress hạn và kích thích sự tăng trưởng của thực vật Oligochitosan là một chất hữu cơ cao phân tử được điều chế từ chitosan, trọng lượng nhỏ, dễ hòa tan trong nước nên có tiềm năng ứng dụng cao trong nông nghiệp Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của oligochitosan đối với lúa

Do đó việc nghiên cứu ảnh hưởng của oligochitosan lên tính chịu hạn của lúa là một thực tiễn quan trọng cần được quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý do trên, đề tài:

“Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa (Oryza

2

sativa L.)” được thực hiện trong phòng thí nghiệm nhằm góp phần tìm ra nồng độ

chitosan và oligochitosan thích hợp giúp cải thiện sự sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện hạn

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc cây lúa

Cây lúa (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á vì nó được thuần hoá từ

lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên của châu Á là Ấn Độ, biên giới Thái Lan - Myanmarr, Trung du Tây Bắc Việt Nam Có tài liệu cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở miền Nam

Việt Nam và Campuchia Có giả thuyết lại cho rằng tổ tiên của lúa Oryza là một cây

hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [2]

Tuy có nhiều nguồn tài liệu khác nhau chứng minh các nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên cây lúa đã lan rộng ra các vùng khác nhau [3], [4]

Phân loại thực vật học: Giới: Plantae

Ngành: Tracheophytes Bộ: Poales

Họ: Poaceae Chi: Oryza

Loài: Oryza sativa L

Ở Việt Nam nền văn minh lúa nước đã có từ hơn 4000 năm nay kể từ thời vua Hùng, đã phát triển suốt chiều sâu của lịch sử và chiều dài của đất nước, từ cao nguyên Đồng Văn tới bán đảo Cà Mau ở Nam Bộ

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lúa

Lúa gạo chiếm 26,5% trên tổng cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới Với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm, lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương

4

thực Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm Đặc biệt trong những năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng suất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng lên [2]

Trên thế giới, khoảng 40% dân số sử dụng lúa gạo là lương thực chính và có tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trong 1/3 khẩu phần ăn hằng ngày Ở Việt Nam, 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính [3] Vì có thành phần các chất dinh dưỡng ổn định và cân đối nên lúa gạo được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

- Lúa gạo được chế biến thành nhiều món ăn khác nhau

- Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, sản xuất bánh kẹo, sản xuất rượu bia, …

- Sản phẩm phụ của cây lúa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Tấm được dùng để sản xuất rượu, phấn viết, Cám được dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp, sản xuất các vitamin nhóm B, chế tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng, Vỏ trấu để sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc, vật liệu độn phân hữu cơ, làm chất đốt, Rơm rạ dùng trong công nhiệp sản xuất giấy, đồ gỗ gia dụng

Ngoài ra, lúa gạo còn là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân và góp phần đàm bảo an ninh lương thực [5]

1.1.3 Thành phần hóa học của hạt lúa

Thành phần hóa học của hạt lúa thay đổi tùy theo giống lúa, kỹ thuật canh tác, điều kiện khí hậu, Sự phân bố các chất dinh dưỡng trong từng loại hạt không giống nhau và được biểu diễn trong bảng 1.1 Nhưng nhìn chung, chúng đều có các thành phần như nước, carbohydrate, protein, cellulose, lipid, vitamin và chất khoáng

5

Bảng 2.1: Thành phần trung bình (% khối lượng) của lúa gạo, có độ ẩm 14% [6]

- Carbohydrate:

Carbohydrate là thành phần chủ yếu và chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần lúa gạo Các carbohydrate của lúa ngoài tinh bột là thành phần chủ yếu còn có đường, cellulose, hemicellulose, dextrin [5]

- Tinh bột:

Tinh bột chiếm đến 90% lượng chất khô và chủ yếu tập trung trong nội nhũ Hạt tinh bột của lúa gạo có hình dạng đa giác đặc trưng, kích thước thay đổi từ 2 - 10 μm Nhiệt độ hồ hóa tinh bột gạo trong khoảng 65 - 70oC [8]

- Đường:

Trong lúa gạo, đường tồn tại ở dạng chủ yếu là saccharose, ngoài ra còn có glucose, fructose và raffinose Trong hạt lúa nảy mầm có sự hiện diện của maltose [3]

6 - Protein:

Protein trong hạt lúa chiếm từ 5,5 - 13,0% khối lượng khô của hạt Khoảng 80% protein là glutelin, 18 - 20% là prolamin, 2 - 8% là globulin, albumin chiếm 5% Globulin là thành phần chính của protein trong phôi hạt lúa, khối lượng phân tử 26 Kda [9]

- Lipid:

Trong lúa hàm lượng chất béo rất nhỏ chỉ khoảng 1,5 - 2,3% Lipid tồn tại dưới dạng các giọt chất béo có kích thước < 0,5 μm trong lớp aleurone, < 1 μm trong lớp subaleurone và < 0,7 μm trong phôi và các phần khác của hạt [7]

- Vitamin:

Trong lúa có chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, B6, PP, E, B2, phần lớn tập trong ở phôi, vỏ hạt và lớp aleurone Gạo hầu như không có hoặc có rất ít vitamin A, C và D [3]

- Chất khoáng:

Các chất khoáng vô cơ tập trung ở lớp vỏ hạt gạo Chất khoáng nhiều nhất trong hạt gạo là phosphor Trong lớp vỏ trấu, chất khoáng có hàm lượng cao nhất là silic Trong phôi hạt, chất khoáng có hàm lượng cao là phosphor, potassium và magnesium [5]

1.1.4 Đặc điểm sinh lý của cây lúa

Cây lúa phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 20 - 30oC Nhiệt độ trên 40oC hoặc dưới 17oC, cây lúa tăng trưởng chậm lại Dưới 13oC cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu điều kiện này kéo dài 1 tuần cây lúa có thể chết [10]

Khi cây lúa còn non và sinh trưởng mạnh thì hô hấp sinh trưởng là chủ yếu, khi cây lúa càng già thì hô hấp duy trì lại chiếm ưu thế Để tổng hợp ra 1g hạt lúa cần 1,20 g chất hữu cơ Tổng hô hấp duy trì ước tính khoảng 15 - 25 mg glucose/ g chất khô/ ngày đối với cây lúa Ngoài hô hấp tối, ở cây lúa còn có thể xảy ra hiện tượng hô hấp sáng khi cường độ ánh sáng và nhiệt độ môi trường quá cao Đây là một hạn chế và có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lúa [10]

- Lân là chất sinh năng, là thành phần của ATP và NADP, giúp thúc đẩy việc sử dụng và tổng hợp các chất trong cây Từ lúc hạt của nảy mầm cho đến khi hình thành lá thứ ba, lân được sử dụng chủ yếu là loại dự trữ trong hạt giống

- Kali giúp cho quá trình vận chuyển và tổng hợp cho các chất trong cây, duy trì sức trương của tế bào, giúp cây cứng cáp, tăng khả năng chống sâu bệnh, chịu hạn, tăng số hạt chắc trên bông

1.1.5 Sự sinh trưởng của cây lúa

Sự sinh trưởng là sự gia tăng không hoàn nghịch về kích thước (chiều dài, chiều rộng, diện tích, thể tích) hay trọng lượng (tươi hay khô) Trong cơ thể đa bào sự sinh trưởng xảy ra nhờ sự phân chia tế bào (sự gia tăng số tế bào) và sự gia tăng kích thước tế bào (sự kéo dài và mở rộng tế bào) [12]

Ở lúa, sự tăng trưởng bắt đầu từ khi hạt nảy mầm (rễ nhú ra 1 mm) đến khi cây lúa bắt đầu phân hoá đòng Sự nảy mầm của hạt lúa bắt đầu khi hạt hút no nước, trương phồng lên, ẩm độ trong hạt gia tăng, tinh bột trong phôi nhũ bị phân giải thành những chất đơn giản để cung cấp cho mầm phát triển [10]

Lúa là cây đơn tử diệp Khi hạt nảy mầm thì rễ mầm xuất hiện trước, sau đó đến thân mầm Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt nảy mầm Thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm Rễ mầm không ăn sâu, ít phân nhánh, chỉ có lông ngắn, thường dài khoảng 10 - 15 cm, có nhiệm vụ chủ yếu là hút nước cho phôi phát triển và sẽ chết sau 10 - 15 ngày, lúc cây được 3 - 4 lá Rễ mọc ra từ các đốt thân, có nhiều nhánh và lông hút Tại mỗi mắt có hai vòng rễ, vòng rễ trên to khoẻ, vòng rễ dưới nhỏ hơn Rễ lúa là rễ chùm Thân mầm được bao bởi một lá bao mầm (diệp tiêu), dài khoảng 1 cm [10]

8

Kế đó, lá đầu tiên xuất hiện, có cấu tạo như một lá bình thường nhưng chưa có phiến lá, gọi là lá thứ nhất hay lá không hoàn toàn Sau đó, đến lá thứ hai có phiến lá nhỏ dài khoảng 2 - 3 cm Tiếp tục là thứ ba, thứ tư, Người ta đếm số lá trên thân để tính tuổi mạ Cây mạ có bao nhiêu lá là có bấy nhiêu tuổi Trong giai đoạn đầu cây lúa ra lá nhanh, trung bình 3 - 4 ngày/lá Từ lúc nảy mầm cho đến khi mạ được 3 - 4 lá, cây mạ chỉ sử dụng chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt [13]

Ở điều kiện bình thường, sau 5 - 7 ngày cấy, cây lúa bén rễ hồi xanh và chuyển sang đẻ nhánh Sau khi đạt được số nhánh tối đa cây lúa chuyển sang thời kỳ làm đốt Trong thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng, thân lúa là thân giả do các bẹ lá tạo thành được phát triển từ trục phôi Từ thời kỳ làm đốt trở đi, thân lúa chính thức hình thành Quá trình làm đốt được tính khi lóng thứ nhất ở gốc thân có chiều dài lớn hơn 0,5 cm Các lóng ở dưới gốc thường ngắn, tốc độ phát triển chậm Các lóng trên dài hơn và tốc độ phát triển nhanh hơn Số lóng trên thân phụ thuộc vào giống và có từ 4 - 7 lóng [14]

Giai đoạn tiếp th o là làm đòng Đây là quá trình phân hoá và hình thành cơ quan sinh sản, có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất lúa Quá trình này diễn ra ở đỉnh sinh trưởng của các nhánh cây lúa, có thể nhìn thấy bằng mát thường khi đòng đã dài 1 mm Sau khi hình thành bông nguyên thuỷ, lúc này chiều dài của đòng từ 6 – 12 cm, bằng 1/2 chiều dài của bông sau này Đòng lúa lớn dần, phình to và phát triển chiều dài Giai đoạn làm đòng kết thúc khi cây lúa có đòng già chuẩn bị trổ bông Từ giai đoạn bông nguyên thuỷ cây lúa còn hình thành được 3 lá, không kể lá đòng [2]

Khi đòng đã hoàn chỉnh cây lúa bắt đầu trổ bông Toàn bộ bông lúa thoát ra khỏi bẹ lá đòng là quá trình trổ bông hoàn tất với khoảng thời gian 4 - 6 ngày Tiếp đến là giai đoạn làm hạt, một lượng lớn các chất tinh bột và đường tích luỹ trong thân, bẹ lá được vận chuyển vào hạt Hạt lúa lớn dần về kích thước, khối lượng, vỏ hạt đổi màu, già và chín Lá lúa cũng bắt đầu già hoá từ những lá dưới cùng và dần lên trên Cuối giai đoạn này hạt chắc cứng, vỏ trấu màu vàng, khối lượng hạt đạt tối đa [14]

Hạn là một hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật Khái niệm về khô hạn dùng để chỉ tình trạng mất nước của cây Hiện tượng mất nước có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của thiếu nước trong môi trường hoặc có thể do tác động thứ cấp được gây ra bởi nhiệt độ thấp, sự đốt nóng, hay do độ mặn của muối Tuy nhiên rất khó có thể xác định được thế nào là một trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được [15]

1.2.2 Tính chịu hạn và tác động của hạn tới thực vật 1.2.2.1 Tác động của hạn tới thực vật

Hạn sẽ gây ảnh hưởng đầu tiên đến sự mất nước của tế bào và mô Bất kỳ sự mất nước nào cũng sẽ dẫn đến sự thiếu hụt nước trong tế bào Sự thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng tiêu cực Thiếu nước nhẹ chỉ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng Nhưng thiếu nước nặng gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, kéo theo quá trình già hóa của tế bào, làm cho cây bị héo Khi tế bào bị khô, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến sự bị tổn thương và chết của tế bào [16]

Khi hạn xảy ra gần thời điểm ra hoa (giai đoạn sinh trưởng mẫn cảm nhất) sẽ ảnh hưởng đến yếu tố hình thành năng suất, chủ yếu là tỷ lệ đậu hạt Bên cạnh đó, lá cây có thể mất sức trương hoặc chết mô (biểu hiện khô lá) do quá mất nước khi nhiệt độ tăng Lá bị mất cân bằng do sự thoát hơi nước Sự thiếu hụt nước ở những lá tầng thấp nhiều hơn những lá tầng cao, những lá thấp có xu hướng tàn trước những lá trên cao

10

Quang hợp cũng là quá trình chịu tác động rất lớn bởi hạn, để thích ứng với điều kiện này, khí khổng sẽ được điều khiển đóng lại nhằm giảm thiểu sự thoát hơi nước Tuy nhiên điều này đồng nghĩa với việc giới hạn trao đổi CO2 và làm giảm quang hợp [17] Vì vậy, nồng độ CO2 trong gian bào và cường độ quang hợp giảm dần khi mức độ hạn và cường độ ánh sáng tăng lên [18] Điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ của mức độ hạn với độ dẫn khí khổng và cường độ quang hợp [19] Th o đó hạn càng nặng thì càng làm giảm độ dẫn khí khổng và giảm cường độ quang hợp

1.2.2.2 Tính chịu hạn của thực vật

Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ, nước, phèn, độ mặn, … Nếu ở ngoài giới hạn đó, thì các nhân tố sinh thái này có thể gây hại, cản trở cho sự sinh trưởng và phát triển của cây dẫn đến giảm năng suất sinh học

Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, tham gia vào các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất diễn ra, như vậy nước có ý nghĩa sinh thái và sinh lý đến việc quyết định đời sống của thực vật Thiếu nước ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng, cũng như ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Mức độ tổn thương của cây trồng do thiếu nước gây ra có nhiều mức độ khác nhau như: chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Khả năng của thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thương do thiếu hụt nước này ra được gọi là tính chịu hạn [20]

Thực vật sẽ có những biến đổi sinh lý để chống lại khô hạn, nhằm không để mất nước Có hai cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong điều kiện môi trường thiếu nước là cơ chế tránh mất nước và cơ chế chịu mất nước

Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ Những cây chịu

11

hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước Bên cạnh đó, cây có hệ mạch và hệ mô bì dẫn nước lên các cơ quan thoát nước phát triển, sẽ hạn chế sự mất nước của cây do sự thoát hơi nước Cơ chế tránh mất nước phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ nhằm giảm mất nước một cách tối đa [20]

Cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi sinh hoá diễn ra bên trong tế bào, nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước Áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước còn lại trong đất Sự điều chỉnh này thông qua việc tích luỹ các chất hoà tan, protein, amino acid, ví dụ như prolin , mannitol, fructos , K+, các enzyme phân hủy gốc tự do, … Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: - Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+

- Thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipid hoặc prot in trong màng, ngăn chặn sự phá huỷ màng và các phức protein [20]

1.2.3 Cơ chế chống hạn

Hệ thống rễ là cơ quan cảm nhận đầu tiên với stress hạn Mặc dù sự phát triển của chồi trên mặt đất bị ức chế, nhưng bộ rễ vẫn tiếp tục phát triển bên dưới đất và có sự thay đổi về hình thái, cấu trúc để tăng cường khả năng hấp thụ nước, muối khoáng Hệ thống rễ phát triển và điều chỉnh cấu trúc th o các hướng khác nhau, có thể sâu hơn hoặc nông hơn về phía các mảng đất có độ ẩm cao hơn nhờ tín hiệu auxin [21] Sự phân bố nước không đều trong đất cũng ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bên Do đó, các rễ bên sẽ được ưu tiên phát triển về phía nước có độ ẩm cao [22] Ngược lại, nếu môi trường thiếu nước hoàn toàn sẽ ngăn cản sự hình thành rễ bên Sự phát triển của rễ bên bị giảm chủ yếu là do ức chế sự hoạt hóa của các mô phân sinh của rễ bên Việc gia tăng chiều dài rễ được x m là cơ chế hữu hiệu nhằm tăng khả năng hút nước và chất khoáng từ đất, giúp cải thiện sinh khối trong cơ thể thực vật [23]

12

Sự tích luỹ chất tan là cơ chế cơ bản để bảo vệ và điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong điều kiện stress hạn Các chất hòa tan được tích luỹ chủ yếu trong tế bào khi bị stress hạn mà không can thiệp vào hoạt động của các đại phân tử Chúng là các hợp chất hydroxyl như oligosaccharid , polyhydric, sucros hoặc các hợp chất chứa nitơ như prolin , GB, polyamin và các hợp chất amoni [24] Các chất này thường có khối lượng phân tử nhỏ, dễ hòa tan, ít độc với tế bào, có thể duy trì mức áp suất thẩm thấu bình thường, bảo vệ hoạt động của protein và cấu trúc màng tế bào,… Sự điều hòa thẩm thấu của các ion vô cơ có liên quan mật thiết đến bơm Na+, K+, H+, do đó làm thay đổi điện thế thẩm thấu của tế bào Đồng thời, sự thay đổi nồng độ ion vô cơ sẽ gây ra sự thay đổi về hình thái và chức năng của tế bào [25]

Trong thời gian stress hạn, prolin đóng một vai trò quan trọng và hoạt động như một hợp chất truyền tín hiệu để điều chỉnh hoạt động của ty thể Proline ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào bằng cách kích hoạt các g n đặc biệt để chống lại các stress [26] Proline có khả năng ngậm nước mạnh, vì vậy nó có thể đóng vai trò bảo vệ cấu trúc tế bào Trong trường hợp cây bị tổn thương, prolin tương tác với protein tạo thành khung kỵ nước nhằm ổn định, bảo vệ các đại phân tử sinh học và cấu trúc màng tế bào Sự tích luỹ proline giúp duy trì tính toàn vẹn của màng và ổn định các enzyme hoặc protein bằng cách giảm quá trình oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào chống oxy hóa khử và loại bỏ các gốc tự do [27] Proline có thể liên kết với prot in để tạo thành một lớp màng bảo vệ với các phân tử nước trên bề mặt của protein Sự hình thành màng bảo vệ hạn chế sự mất nước ra bên ngoài tế bào Hơn nữa, màng bảo vệ có tác dụng bảo vệ tốt đối với prot in và các đại phân tử sinh học khác, duy trì cấu trúc và hoạt tính cao của các đại phân tử sinh học Đối với các protein bị biến tính dưới tác động của hạn, proline có thể cải thiện tính ưa nước của các protein bị biến tính bằng cách kết hợp và giữ trạng thái hòa tan của các protein biến tính Kết quả là tránh được sự ngưng kết của các prot in đã biến tính cản trở hoạt động trao đổi chất của tế bào [25]

Glycine Betaine (GB) là một chất điều hòa thẩm thấu hiệu quả, không độc hại, có thể liên kết với cả vùng ưa nước và kỵ nước của các đại phân tử sinh học Việc tăng

13

cường tổng hợp và tích luỹ GB trong điều kiện khô hạn giúp cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật Dưới áp lực hạn hán, GB có thể ổn định cấu trúc và tính chất của các đại phân tử sinh học, các enzyme quan trọng của chu trình dicarboxylic acid, các chất oxy hóa và hệ thống quang hóa,… có ý nghĩa sinh lý quan trọng trong việc duy trì quá trình hô hấp và quang hợp bình thường của thực vật [28]

Đường tổng bao gồm glucose, fructose, sucrose và các loại carbohydrate khác là nguồn năng lượng và cacbon quan trọng, tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể thực vật Sự tích luỹ đường tổng làm giảm thế nước của tế bào, cải thiện khả năng hút nước và giữ nước của cây Ngoài ra, chỉ có đường tổng mới có thể thay thế các phân tử nước, hình thành liên kết hydro với prot in để duy trì cấu trúc và chức năng cụ thể của protein khi bị stress hạn nghiêm trọng Hơn nữa, sự gia tăng cacbohydrate hòa tan giữa các màng sinh học có thể tránh được sự sụp đổ trực tiếp của hệ thống màng sinh học [25] Đường không khử, đặc biệt là đường disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide có tác dụng hỗ trợ duy trì tính toàn vẹn của màng Tương tự, trehalose giúp ổn định lipid màng, protein và cấu trúc sinh học, cải thiện hoạt động quang hợp trong điều kiện khô hạn [29] Cơ chế bảo vệ này là kết quả của việc hình thành các liên kết hydro giữa các chất thẩm thấu và đại phân tử; từ đó, tránh được việc tạo ra các liên kết hydro nội phân tử làm thay đổi không thể đảo ngược cấu trúc không gian của các đại phân tử

ROS là các phân tử hóa học trong cấu trúc chứa oxy nguyên tử có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa khử mạnh hơn O2, gồm các dạng chính là peroxide, superoxide, gốc hydroxyl và oxy đơn [30] ROS có thể được tạo ra trong cơ thể thực vật cả trong điều kiện bình thường và trong điều kiện stress Các bào quan khác nhau của tế bào thực vật như lục lạp, ty thể, peroxisome, màng sinh chất và thành tế bào đều có thể là nơi sản xuất ra ROS Lục lạp và peroxisome tạo ROS chính trong điều kiện có ánh sáng, trong khi ở ti thể, ROS được sản xuất chính trong điều kiện tối [31]

Việc tạo ra các gốc oxy ROS có tác dụng tham gia vào quá trình chống lại stress bên ngoài, điều hòa sự sinh trưởng và phát triển của cây ROS cũng đóng vai trò điều

14

tiết quan trọng trong phản ứng với stress phi sinh học Hiện nay, ROS còn được coi là những phân tử điều hòa chính trong cơ thể thực vật với vai trò tín hiệu ban đầu do rối loạn chuyển hóa tế bào và các kích thích môi trường [30]

Hệ thống chống oxy hoá phi enzyme trong thực vật chủ yếu bao gồm ascorbate, glutathione (GSH), vitamin E, mannitol, carotenoids và flavonoid Những chất này có thể phản ứng trực tiếp với các gốc ROS hoặc xuất hiện dưới dạng chất nền của các nzym trong cơ chế chống oxy hoá Ngoài ra, một số phân tử nhỏ như vitamin cũng tham gia vào việc loại bỏ các gốc oxy tự do và ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid Sự biểu hiện quá mức của các protein chống oxy hóa này có thể làm giảm đáng kể hàm lượng H2O2 ở thực vật sau khi xử lý stress phi sinh học, từ đó cải thiện khả năng chống chịu stress của cây trồng chuyển gen [32]

Các nzym liên quan đến bảo vệ chống oxy hóa trong thực vật chủ yếu bao gồm SOD, CAT, APX, DHAR, MDHAR và POD Trong đó, SOD có chức năng chính loại bỏ O2- và có thể chuyển đổi O2 thành H2O2 [31]; CAT, POD, APX và DHAR chịu trách nhiệm loại bỏ H2O2; guaiacol peroxidase (GPX) loại bỏ ROS của quá trình chuyển hóa lipid và alkyl peroxit [33]

1.3 Giới thiệu về chitosan

1.3.1 Cấu trúc, tính chất của chitosan

Chitosan được tạo thành bằng phản ứng N-deacetyl hóa chitin trong môi trường kiềm, thành phần chính trong vỏ của động vật giáp xác Chitosan là copolymer của hai monomer 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose (N-acetyl glucosamine, GlcNAc) và 2-amino-2-deoxy-D-glucos (glucosamin, GlcN) thông qua liên kết β-(1-4) Cấu trúc hóa học của chitosan được minh họa trong hình 1.1

15

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan

Độ deacetyl hóa (DDA) được sử dụng để phân biệt chitin và chitosan Khi độ deacetyl hóa của chitin lớn hơn hoặc bằng 50%, nó trở nên tan trong môi trường acid và được gọi là chitosan Sự hòa tan xảy ra bởi quá trình proton hóa nhóm -NH2 tại vị trí C2 của đơn vị tái lặp D-glucosamin [34]

Chitosan không tan trong nước có độ pH > 6,6 do có nhóm amino (NH3) tự do, nhưng tan tốt trong dung dịch acid như acid formic, acid acetic,… độ nhớt của dung dịch chitosan có mối quan hệ tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử chitosan, nồng độ dung dịch và ngược lại [34]

1.3.2 Tác dụng của chitosan lên cơ chế chịu hạn của thực vật

Chitosan và oligochitosan đã được nghiên cứu nhiều trong việc giúp tăng khả năng chống chịu các yếu tố phi sinh học trên thực vật Trên màng tế bào thực vật có những thụ thể nhận biết chitin, hoặc những polymer hay monomer của chitin, truyền tín hiệu kích thích các phản ứng phòng vệ trong cây khi gặp điều kiện bất lợi Chitin elicitor binding protein (CEBiP), thụ thể nhận biết chitin, được phân lập ở nhiều loại cây trồng khác nhau Tín hiệu này được truyền đến các thụ thể thứ cấp để kích thích quá trình “miễn dịch” của cây thông qua các chất có hoạt tính sinh học giúp chống lại tác nhân gây hại Chitosan cũng là tín hiệu kích thích quá trình kháng oxy hóa giảm tổn hại bào quan, cân bằng áp suất thẩm thấu, bảo vệ màng tế bào, điều hòa lượng nước

proline trong cây cỏ xạ hương (Thymus daenensis Celak) [37] Tuy nhiên, theo thí nghiệm của Mahdavi và cộng sự vào năm 2011 đối với cây rum (Carthamus tinctorius

L.), nồng độ chitosan thấp (0,05-0,4%) làm giảm hàm lượng prolin , nhưng ở nồng độ chitosan cao, hàm lượng của proline lại tăng lên [38] Tương tự, năm 2012, Karimi và

cộng sự cho thấy trong cây thầu dầu (Ricinus communis), chitosan không ảnh hưởng

1.4 Một số nghiên cứu về chitosan lên khả năng chịu hạn của lúa

Suchada Boonlertnirun và cộng sự (2007) trồng cây lúa trên môi trường được bổ sung chitosan trọng lượng phân tử 100.000 kDa trong điều kiện hạn, sau đó kiểm tra khả năng phục hồi và năng suất hạt của lúa trong điều kiện khô hạn Kết quả cho thấy việc xử lý cây lúa với chitosan trước khi trồng trong điều kiện hạn cho thấy khả năng phục hồi năng suất tốt và tỷ lệ lá bị hại ít hơn so với nghiệm thức đối chứng [41]

Seang-Ngam và cộng sự (2014) sử dụng 40 mg/l oligochitosan 0% để xác định khả năng chống hạn trên giống lúa KDML105 thông qua sự biểu hiện của gen OsCam1-1 Khi kiểm tra các cây lúa chuyển gen KDML105 cho thấy biểu hiện của OsCam1-1 tăng trưởng tương đối cao hơn so với nghiệm thức đối chứng Khả năng chống hạn trên cây lúa sau khi được xử lý với oligochitosan trong giai đoạn đầu có thể nhờ Ca2+ được mã hóa bởi gen OsCam1-1 [42]

18

Namphueng Moolphuerk và Wattana Pattanagul (2020) tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chitosan có trọng lượng phân tử 50 - 190 kDa, 190 - 310 kDa và 310 - 375 kDa lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa khi chịu hạn hán Kết quả cho thấy, ứng dụng chitosan giúp thúc đẩy sự phát triển của rễ cây lúa trong điều kiện hạn hán Tất cả các nghiệm thức chitosan đều cho kết quả trọng lượng tươi và sắc tố quang hợp tăng Ngoài ra, chitosan có tác dụng làm giảm bớt các tác động do khô hạn gây ra bằng việc giảm nồng độ malondialdehyde (MDA) và hydrogen peroxide (H2O2) [43]

Namphueng Moolphuerk, Tracy Lawson và Wattana Pattanagul (2021) tiến hành xử lý cây lúa bằng chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau để kiểm tra các tính trạng sinh lý và hiệu suất quang hợp ở cây lúa bị stress do hạn Kết quả cho thấy, hoạt động của các enzyme chống oxy hóa (guaiacol peroxidase và ascorbate peroxidase), sự phát triển của chồi và rễ cây lúa đã cải thiện Ngoài ra, ứng dụng chitosan cũng tăng tốc độ quang hợp [44]

Nguyễn Thị Bích Vân và Võ Công Thành (2018) tiến hành nghiên cứu nhằm tìm hiểu về hàm lượng chlorophyll, đường tổng và proline trong lá của 4 giống lúa (R64, CTUS4, Nàng níu, LH01) trong điều kiện hạn giai đoạn sinh dưỡng Kết quả cho thấy, để thích ứng trong điều kiện hạn, 4 giống lúa có sự tích lũy cao hàm lượng chlorophyll, đường tổng và prolin trong lá Hàm lượng chlorophyll a tăng từ 1,1 - 1,6 lần, chlorophyll b tăng từ 1,2 - 1,5 lần, chlorophyll tổng tăng từ 1,3 - 1,4 lần, đường tổng tăng từ 1,2 - 3 lần, prolin tăng từ 2,2 - 9,5 lần Hai dòng CTUS4 và LH01 có sự tích lũy hàm lượng đường tổng và proline thấp nhất cho thấy hiệu quả chọn lọc cao đối với khả năng chịu hạn [45]

Trần Ngọc Sơn và cộng sự (2021) tiến hành thí nghiệm trên 12 giống lúa mùa trong điều kiện gây hạn nhân tạo, sau đó đánh giá kết quả qua các chỉ tiêu như: hình thái, cấu trúc giải phẫu rễ và khí khổng Qua thời gian thực hiện, kết quả cho thấy 3 giống (Sophinh, Xương gà đỏ và Bằng nâu) có khả năng chịu hạn tốt nhất trong giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng (28 ngày sau khi ngắt nước) Giống Sophinh có mật độ và

19

diện tích khí khổng nhỏ nhất, giúp giảm mất nước qua quá trình thoát hơi nước khi cây thiếu nước Giống Xương gà đỏ có tỷ lệ rễ sâu cao nhất, có thể tăng khả năng lấy nước từ tầng đất sâu Giống Bằng nâu có đường kính rễ dày và diện tích lõi lớn, chứa nhiều hậu mộc và tổng diện tích hậu mộc lớn nhất, giúp tăng lực dẫn nước lên chồi Mối quan hệ giữa số rễ, số mạch hậu mộc và mật độ khí khổng là tương quan nghịch; trong khi tương quan giữa đường kính rễ, số hậu mộc và tổng diện tích hậu mộc là tương quan thuận Kết quả này sẽ giúp định hướng phát triển giống lúa th o cơ chế chịu hạn [46]

Dựa vào những nghiên cứu trên cho thấy các tác giả trong nước chỉ mới tập trung vào việc nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây lúa nhưng chưa quan tâm đến ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chịu hạn của loại cây này

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tạo nguyên liệu khởi đầu cho các thí nghiệm khảo sát

tiếp theo

Phương pháp thí nghiệm: Khử trùng hạt lúa với javel 15 % trong 20 phút, sau

đó đặt vào đĩa P tri có giấy thấm được làm ẩm với nước cất, ủ nảy mầm trong 4 ngày ở điều kiện tối để thu nhận cây mạ lúa Cây mạ lúa cao 2 cm được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hạn nhân tạo lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ mannitol gây hạn lên sự sinh trưởng

của cây mạ lúa

Phương pháp thí nghiệm: Cấy cây mạ lúa (ở nội dung 2.2.1) lên giấy thấm ẩm

trong hũ thủy tinh có chứa dung dịch Yoshida [47] và dung dịch Yoshida bổ sung mannitol các nồng độ 10, 20, 30 và 40 g/L Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái và hàm lượng sắc tố quang hợp sau 10 ngày nuôi cấy ở 5 nghiệm thức:

(1) Yoshida (đối chứng)

(2) Yoshida + Mannitol 10 g/L (3) Yoshida + Mannitol 20 g/L

21 (4) Yoshida + Mannitol 30 g/L

2.2.3.1 Xử lý hạt lúa với chitosan và oligochitosan giai đoạn nảy mầm

Phương pháp thí nghiệm: Hạt lúa được ngâm với dung dịch chitosan và

oligochitosan nồng độ 25, 50, 75 và 100 ppm ủ nảy mầm trong 4 ngày để thu nhận cây mạ lúa Cấy cây mạ có chiều dài rễ 2 – 3 cm lên giấy thấm ẩm trong hũ thuỷ tinh (đường kính đáy 6,4 cm, chiều cao 11,8 cm) với mật độ 20 cây/hũ chứa 20 mL dung dịch Yoshida bổ sung mannitol nồng độ được chọn từ nội dung 2.2.2 Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa sau 10 ngày nuôi cấy ở 21 nghiệm thức:

(1) Yoshida + Mannitol 30 g/L (đối chứng)

(2) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 25 ppm (3) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 50 ppm (4) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 75 ppm (5) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 100 ppm (6) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 25 ppm (7) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 50 ppm (8) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 75 ppm (9) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 100 ppm (10) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 25 ppm (11) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 50 ppm (12) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 75 ppm (13) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 100 ppm

22

(14) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 25 ppm (15) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 50 ppm (16) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 75 ppm (17) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 100 ppm (18) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 25 ppm (19) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 50 ppm (20) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 75 ppm (21) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 100 ppm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cường độ ánh sáng 4000 lux, nhiệt độ 25oC và ẩm độ 70 – 80%

2.2.3.2 Xử lý cây mạ lúa với chitosan và oligochitosan

Phương pháp thí nghiệm: Cây mạ lúa ở nội dung 2.2.1 được cấy lên giấy thấm

ẩm trong hũ thủy tinh (đường kính đáy 6,4 cm, chiều cao 11,8 cm) với mật độ 20 cây/hũ có chứa 20 mL dung dịch Yoshida bổ sung mannitol nồng độ được chọn từ nội dung 2.2.2 Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa sau 10 ngày nuôi cấy ở 21 nghiệm thức:

(1) Yoshida + Mannitol 30 g/L (đối chứng)

(2) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 25 ppm (3) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 50 ppm (4) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 75 ppm (5) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Chitosan 100 ppm (6) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 25 ppm (7) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 50 ppm (8) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 75 ppm (9) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan I 100 ppm (10) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 25 ppm (11) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 50 ppm (12) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 75 ppm

23

(13) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 100 ppm (14) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 25 ppm (15) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 50 ppm (16) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 75 ppm (17) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 100 ppm (18) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 25 ppm (19) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 50 ppm (20) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 75 ppm (21) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 100 ppm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cường độ ánh sáng 4000 lux, nhiệt độ 25oC và ẩm độ 70 – 80%

2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Chỉ tiêu hình thái a Chiều cao cây:

Đo từ vị trí gốc thân đến chót lá dài nhất (60 cây mạ lúa/lần lặp lại)

a Tỷ lệ trọng lượng khô và trọng lượng tươi:

Mỗi nghiệm thức có 60 cây mạ được chia làm 6 mẫu, mỗi mẫu gồm 10 cây mạ Cân mẫu bằng cân phân tích có độ chính xác 0,0001g để xác định trọng lượng tươi, sau đó sấy cây ở 75°C trong tủ sấy đến khi trọng lượng không đổi Trọng lượng khô của cây mạ lúa được xác định bằng cân phân tích có độ chính xác 0,0001g

Tỷ lệ chất khô (g/g) được tính theo công thức:

- Bỏ phần dịch nổi và rửa phần bã 2 lần với nước cất - Thêm 3 mL nước cất

- Đun sôi ở 95oC trong 2 tiếng

- Pha loãng 5 lần phần dịch chiết thu được

- Hút 1 mL dịch chiết đã được pha loãng cho vào ống nghiệm có nắp - Thêm 1 mL phenol 5% (v/v) và trộn đều

- Thêm 5mL H2SO4 đặc nguội 95%

- Đậy nắp ống nghiệm vào đun ở 95oC trong 2 phút - Làm lạnh ở 22oC trong 30 phút

- Đo độ hấp thụ với bước sóng 490 nm (A490)

Hàm lượng đường hòa tan trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:

Công thức:

(μg/g trọng lượng tươi)

25

n: Độ pha loãng của dung dịch đ m đi định lượng (n 5)

3 (mL): thể tích nước cất sử dụng ban đầu để chiết mẫu thực vật Trọng lượng tươi (g): khối lượng mẫu thực vật đ m đi chiết

Đường chuẩn đường hòa tan:

- Pha D-glucose chuẩn với các nồng độ: 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 và 200 μg/mL - Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định hàm lượng đường hòa tan trong mẫu

- Đun nóng ở 95oC trong 20 phút - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút - Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)

Hàm lượng proline trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:

Công thức:

(nmol/g trọng lượng tươi)

Trong đó:

AM (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 520 nm của mẫu dịch chiết Ablank (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 520 nm của mẫu trắng

26

Độ dốc (Å/nmol): được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính 500 (μL): Thể tích dịch chiết sử dụng

1500 (μL): Tổng thể tích dung dịch cuối cùng n: Độ pha loãng của dung dịch đ m đi định lượng

Trọng lượng tươi (g): khối lượng mẫu thực vật đ m đi chiết

Đường chuẩn proline:

- Pha dung dịch proline chuẩn với các nồng độ: 5, 2, 1, 0,5, 0,2 mM

- Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định hàm lượng proline trong mẫu

- Bỏ phần dịch nổi và rửa phần bã 2 lần với nước cất - Thêm 5 mL NaOH 0.1N

- Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 2 phút - Hút 1 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm - Thêm 5 mL thuốc thử Bradford và trộn đều - Để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 phút - Đo độ hấp thụ với bước sóng 595 nm (A520)

Hàm lượng protein trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:

27

Công thức:

(μg/g trọng lượng tươi)

Đường chuẩn protein:

- Pha dung dịch albumin chuẩn với các nồng độ: 10, 20, 30, 40, 50μg/mL

- Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác

định hàm lượng protein trong mẫu e Hàm lượng sắc tố quang hợp:

Quy trình được tiến hành th o các bước sau: - Cân 0,2 g mẫu lá thực vật

- Nghiền nát trong cối với 10 mL dung dịch ethanol 96% - Lọc nhanh dịch chiết

- Định mức thành 25 mL

- Đo độ hấp thụ với bước sóng lần lượt là 470 nm, 649 nm, 665 nm (A470, A649, A665) Hàm lượng sắc tố được tính toán dựa trên định luật Lambert – Beer (A = ɛ x C x d), cụ thể với giá trị chiều rộng cuvette là 1 cm, thì công thức tính hàm lượng các sắc tố (μg/mL) như sau:

28

Thể tích pha loãng là 25 (mL) Trọng lượng tươi m là 0,2 (g)

2.2.2.3 Phương pháp phân tích thống kê

Kết quả thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) dùng cho Window phiên bản 26 Phương pháp phân tích phương sai 1 chiều (ANOVA) và Duncan được sử dụng để chứng minh sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức ở p ≤ 0,05 Kết quả được thể hiện ở dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (chỉ tiêu hình thái với n = 60, chỉ tiêu tỷ lệ trọng lượng khô/trọng lượng tươi với n = 6 và các chỉ tiêu còn lại với n = 3)