Sự bổ sung oligochitosan trọng lượng 11.126 Da với nồng độ 25; 50 và 75 ppm làm tăng khả năng chống chịu của cây mạ lúa để duy trì ổn định hoạt động sinh trưởng của cây.. Ảnh hưởng của c
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Hạt lúa giống IR64 được cung cấp bởi Công ty Cổ phần giống Điện Biên
Chitosan trọng lượng phân tử 573.170 Da
Oligochitosan các phân đoạn 30.143 (I); 11.126 (II); 5.994 (III) và 4.592 Da (IV) được cắt bởi bức xạ gamma liều xạ lần lượt 0, 50, 100, 150 và 200 kGy từ dung dịch chitosan 8B (Funakoshi – Tokyo, Nhật Bản) 5%, độ deacetyl hóa 80% (Chitosan và oligochitosan được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh).
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro
Mục đích thí nghiệm: Tạo nguyên liệu khởi đầu cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo
Phương pháp thí nghiệm: Khử trùng hạt lúa với javel 15 % trong 20 phút, sau đó đặt vào đĩa P tri có giấy thấm được làm ẩm với nước cất, ủ nảy mầm trong 4 ngày ở điều kiện tối để thu nhận cây mạ lúa Cây mạ lúa cao 2 cm được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hạn nhân tạo lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ mannitol gây hạn lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa
Phương pháp thí nghiệm: Cấy cây mạ lúa (ở nội dung 2.2.1) lên giấy thấm ẩm trong hũ thủy tinh có chứa dung dịch Yoshida [47] và dung dịch Yoshida bổ sung mannitol các nồng độ 10, 20, 30 và 40 g/L Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái và hàm lượng sắc tố quang hợp sau 10 ngày nuôi cấy ở 5 nghiệm thức:
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cường độ ánh sáng 4000 lux, nhiệt độ 25 o C và ẩm độ 70 – 80%
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan lên khả năng chịu hạn của cây mạ lúa
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan/oligochitosan lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện hạn
2.2.3.1 Xử lý hạt lúa với chitosan và oligochitosan giai đoạn nảy mầm
Phương pháp thí nghiệm: Hạt lúa được ngâm với dung dịch chitosan và oligochitosan nồng độ 25, 50, 75 và 100 ppm ủ nảy mầm trong 4 ngày để thu nhận cây mạ lúa Cấy cây mạ có chiều dài rễ 2 – 3 cm lên giấy thấm ẩm trong hũ thuỷ tinh (đường kính đáy 6,4 cm, chiều cao 11,8 cm) với mật độ 20 cây/hũ chứa 20 mL dung dịch Yoshida bổ sung mannitol nồng độ được chọn từ nội dung 2.2.2 Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa sau 10 ngày nuôi cấy ở 21 nghiệm thức:
(10) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 25 ppm
(11) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 50 ppm
(12) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 75 ppm
(13) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 100 ppm
(14) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 25 ppm
(15) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 50 ppm
(16) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 75 ppm
(17) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 100 ppm
(18) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 25 ppm
(19) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 50 ppm
(20) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 75 ppm
(21) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 100 ppm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cường độ ánh sáng 4000 lux, nhiệt độ 25 o C và ẩm độ 70 – 80%
2.2.3.2 Xử lý cây mạ lúa với chitosan và oligochitosan
Phương pháp thí nghiệm: Cây mạ lúa ở nội dung 2.2.1 được cấy lên giấy thấm ẩm trong hũ thủy tinh (đường kính đáy 6,4 cm, chiều cao 11,8 cm) với mật độ 20 cây/hũ có chứa 20 mL dung dịch Yoshida bổ sung mannitol nồng độ được chọn từ nội dung 2.2.2 Ghi nhận các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa sau 10 ngày nuôi cấy ở
(10) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 25 ppm
(11) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 50 ppm
(12) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 75 ppm
(13) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan II 100 ppm
(14) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 25 ppm
(15) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 50 ppm
(16) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 75 ppm
(17) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan III 100 ppm
(18) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 25 ppm
(19) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 50 ppm
(20) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 75 ppm
(21) Yoshida + Mannitol 30 g/L + Oligochitosan IV 100 ppm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cường độ ánh sáng 4000 lux, nhiệt độ 25 o C và ẩm độ 70 – 80%.
Phương pháp phân tích
2.3.1 Chỉ tiêu hình thái a Chiều cao cây: Đo từ vị trí gốc thân đến chót lá dài nhất (60 cây mạ lúa/lần lặp lại) b Số lượng lá: Đếm tổng số lá mở có chiều dài từ 1 cm (60 cây mạ lúa/lần lặp lại) c Số lượng rễ: Đếm tổng số rễ nhô ra khỏi gốc thân từ 1 mm (60 cây mạ lúa/lần lặp lại)
2.3.2 Chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa a Tỷ lệ trọng lượng khô và trọng lượng tươi:
Mỗi nghiệm thức có 60 cây mạ được chia làm 6 mẫu, mỗi mẫu gồm 10 cây mạ Cân mẫu bằng cân phân tích có độ chính xác 0,0001g để xác định trọng lượng tươi, sau đó sấy cây ở 75°C trong tủ sấy đến khi trọng lượng không đổi Trọng lượng khô của cây mạ lúa được xác định bằng cân phân tích có độ chính xác 0,0001g
Tỷ lệ chất khô (g/g) được tính theo công thức:
Hàm lượng đường tổng có trong lá và rễ cây mạ lúa được xác định th o phương pháp ph nol – sulfuric acid [48] Quy trình được tiến hành th o các bước sau:
- Cân 0,2 g mẫu thực vật (lá và rễ) vào ống falcon
- Làm lạnh dung dịch về nhiệt độ phòng
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút
- Bỏ phần dịch nổi và rửa phần bã 2 lần với nước cất
- Pha loãng 5 lần phần dịch chiết thu được
- Hút 1 mL dịch chiết đã được pha loãng cho vào ống nghiệm có nắp
- Thêm 1 mL phenol 5% (v/v) và trộn đều
- Thêm 5mL H2SO4 đặc nguội 95%
- Đậy nắp ống nghiệm vào đun ở 95 o C trong 2 phút
- Đo độ hấp thụ với bước sóng 490 nm (A490)
Hàm lượng đường hòa tan trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:
AM (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 490 nm của mẫu dịch chiết
Ablank (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 490 nm của mẫu trắng Độ dốc (Å/μg/mL): được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính
25 n: Độ pha loãng của dung dịch đ m đi định lượng (n 5)
3 (mL): thể tích nước cất sử dụng ban đầu để chiết mẫu thực vật
Trọng lượng tươi (g): khối lượng mẫu thực vật đ m đi chiết Đường chuẩn đường hòa tan:
- Pha D-glucose chuẩn với các nồng độ: 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 và 200 μg/mL
- Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định hàm lượng đường hòa tan trong mẫu c Hàm lượng proline:
Hàm lượng proline có trong lá và rễ cây mạ lúa được xác định th o phương pháp của Carillo [49] Quy trình được tiến hành th o các bước sau:
- Cân 0,2 g mẫu thực vật (lá và rễ) vào ống falcon
- Pha loãng 10 lần phần dịch chiết thu được với ethanol 70% (v/v)
- Hút 0,5 mL dịch chiết đã được pha loãng cho vào ống nghiệm có nắp
- Thêm 1 mL thuốc thử ninhydin, đậy nắp và trộn đều
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
- Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)
Hàm lượng proline trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:
AM (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 520 nm của mẫu dịch chiết
Ablank (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 520 nm của mẫu trắng
26 Độ dốc (Å/nmol): được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính
500 (μL): Thể tích dịch chiết sử dụng
1500 (μL): Tổng thể tích dung dịch cuối cùng n: Độ pha loãng của dung dịch đ m đi định lượng
Trọng lượng tươi (g): khối lượng mẫu thực vật đ m đi chiết Đường chuẩn proline:
- Pha dung dịch proline chuẩn với các nồng độ: 5, 2, 1, 0,5, 0,2 mM
- Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định hàm lượng proline trong mẫu d Hàm lượng protein tổng số:
Hàm lượng protein có trong lá cây mạ lúa được xác định th o phương pháp Bradford [50] Quy trình được tiến hành th o các bước sau:
- Cân 0,2 g mẫu lá thực vật vào ống falcon
- Làm lạnh dung dịch về nhiệt độ phòng
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút
- Bỏ phần dịch nổi và rửa phần bã 2 lần với nước cất
- Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 2 phút
- Hút 1 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm
- Thêm 5 mL thuốc thử Bradford và trộn đều
- Để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 phút
- Đo độ hấp thụ với bước sóng 595 nm (A520)
Hàm lượng protein trong mẫu thực vật được xác định th o công thức và so sánh với đường chuẩn:
AM (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm của mẫu dịch chiết
Ablank (Å): độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm của mẫu trắng Độ dốc (Å/μg/mL): được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính n: Độ pha loãng của dung dịch đ m đi định lượng
5 (mL): thể tích dung dịch NaOH 0,1N sử dụng ban đầu để chiết mẫu thực vật Trọng lượng tươi (g): khối lượng mẫu thực vật đ m đi chiết Đường chuẩn protein:
- Pha dung dịch albumin chuẩn với các nồng độ: 10, 20, 30, 40, 50μg/mL
- Thực hiện phản ứng và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu e Hàm lượng sắc tố quang hợp:
Quy trình được tiến hành th o các bước sau:
- Cân 0,2 g mẫu lá thực vật
- Nghiền nát trong cối với 10 mL dung dịch ethanol 96%
- Đo độ hấp thụ với bước sóng lần lượt là 470 nm, 649 nm, 665 nm (A470, A649, A665)
Hàm lượng sắc tố được tính toán dựa trên định luật Lambert – Beer (A = ɛ x C x d), cụ thể với giá trị chiều rộng cuvette là 1 cm, thì công thức tính hàm lượng các sắc tố (μg/mL) như sau:
Ca, Cb, Cc (μg/mL) lần lượt là hàm lượng diệp lục tố a, b và carotenoid
A là độ hấp thụ ở các bước sóng 470, 649, 665 nm
Hàm lượng sắc tố được chuyển từ đơn vị μg/mL sang đơn vị μg/g trọng lượng tươi th o công thức sau:
Thể tích pha loãng là 25 (mL)
2.2.2.3 Phương pháp phân tích thống kê
Kết quả thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) dùng cho Window phiên bản 26 Phương pháp phân tích phương sai 1 chiều (ANOVA) và Duncan được sử dụng để chứng minh sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức ở p ≤ 0,05 Kết quả được thể hiện ở dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (chỉ tiêu hình thái với n = 60, chỉ tiêu tỷ lệ trọng lượng khô/trọng lượng tươi với n = 6 và các chỉ tiêu còn lại với n = 3)