Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa Nisin và Disodium Edta lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi

Kết quả thí nghiệm thu được cho thấy công thức tối ưu đã thể hiện rõ hiệu quả của nó trên 6 đối tượng được khảo sát: - Làm giảm từ 3.3 – 6.1 log10 tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

PHAN THỊ NHƯ NGỌC

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC SÚC MIỆNG CHỨA NISIN VÀ DISODIUM EDTA

LÊN CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM GÂY HƠI THỞ HÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: PHAN THỊ NHƯ NGỌC MSHV: 10310613 Ngày, tháng, năm sinh : 26 – 12 – 1973 Nơi sinh: Đà Nẵng Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium

EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium

EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi, với các nghiệm thức kết hợp giữa nisin (nồng độ thay đổi từ 6.3 µg/ml đến 43.8 µg/ml) và disodium EDTA (nồng độ thay đổi từ 10mM đến 30mM) Xác định nghiệm thức tối ưu nhất

Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1

lên hệ vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi trên 6 đối tượng thử nghiệm So sánh hiệu quả của nghiệm thức nisin- disodium EDTA với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 11/2012 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ cũng như tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Xin được bày tỏ lòng biết ơn và cảm kích đối với sự giúp đỡ của các em sinh viên bộ môn Công nghệ thực phẩm K2008, các em đã nhiệt tình cung cấp các mẫu thử phục vụ cho thử nghiệm

Tôi xin chân thành cám ơn bạn Tạ Thị Tuyến, Cao Xuân Yến đã giúp đỡ rất nhiều Cám ơn các bạn học viên cao học cùng thực hiện luận văn trong cùng khoảng thời gian đã chia sẻ những kinh nghiệm quí báu

Cuối cùng, luôn luôn ở bên cạnh và là động lực cho tôi đó là gia đình, Ba, Mẹ và anh chị em Tôi xin được gởi đến họ thành quả của quá trình học tập, đó chính là cuốn Luận văn này

Phan Thị Như Ngọc

Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi

Nội dung nghiên cứu:

1 Xác định công thức tối ưu phối hợp giữa nisin và disodium EDTA lên

hai chủng vi sinh vật Fusobacterium nucleatum và Klebsiella pneumoniae bằng nghiên cứu in vitro

2 Đánh giá sự giảm tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi khi sử dụng

công thức tối ưu nisin – disodium EDTA bằng khảo sát in vivo trên 6 đối

tượng

3 So sánh hiệu quả in vivo của công thức tối ưu nisin – disodium EDTA

với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm để xác định đường kính vòng kháng khuẩn,

chọn ra nghiệm thức tối ưu in vitro và tiến hành nuôi cấy để xác định tổng số vi khuẩn yếm khí trong các mẫu thử nghiệm in vivo

Kết quả thí nghiệm thu được cho thấy công thức tối ưu đã thể hiện rõ hiệu quả của nó trên 6 đối tượng được khảo sát:

- Làm giảm từ 3.3 – 6.1 log10 tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi, - Hiệu quả diệt khuẩn trội hơn sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông

dụng trên thị trường (sản phẩm này đã được chứng nhận lâm sàng về khả năng diệt vi khuẩn gây hôi miệng, mảng bám và viêm nướu),

- Thể hiện rõ năng lực vượt trội in vitro trên hai chủng nghiên cứu so với

sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông dụng

Evaluate the efficacy of a mouthrinse containing nisin and disodium EDTA on Gram negative bacteria inducing malodour

Content:

1 Determine the optimum formulation of nisin in combination with

disodium EDTA for antimicrobial activity on Fusobacterium nucleatum and Klebsiella pneumoniae by in vitro evaluation

2 Estimate the population reduction of anaerobic bacteria inducing malodour during the treatment with the optimum nisin – disodium EDTA

formulation by in vivo evaluation on 6 human subjects 3 Compare the in vivo antimicrobial efficacy of the optimum nisin –

disodium EDTA formulation with a popular clinical proven antibacterial (inducing malodour) mouthrinse (randomly selected)

We implemented experiments in order to determine the diameter of inhibitory

cirles, the in vitro optimum formulation and tested in vivo samples for total of

viable anaerobic bacterial count The results showed that the optimum nisin – disodium EDTA formulation proved its antibacterial efficacy (inducing malodour) for 6 human subjects in this

- Proving the superior in vitro antimicrobial efficacy on two study

microorganisms in comparison with the controled antibacterial mouthrinse

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn của nisin……… 12

1.2.3 Đặc điểm hóa lý - Độ ổn định và độ hòa tan……… 15

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn……… 15

1.2.5 Ứng dụng……… 17

1.3 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ……… 18

1.4 Hệ vi sinh vật trong khoang miệng người khỏe mạnh và người bệnh 19 1.5 Các bệnh răng miệng……… 22

1.6 Thành phần nước súc miệng……… 24

1.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài……… 27

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu……… 31

2.2 Công thức nước súc miệng đề nghị……… 32

2.3 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu……… 33

2.4 Mô hình thí nghiệm ……… 34

2.5 Lấy mẫu……… 35

2.6 Kiểm tra mẫu ……… 35

2.7 Các phương pháp phân tích và nghiên cứu được áp dụng

2.7.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái của hai chủng vi sinh vật chỉ

2.7.6 Xác định tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi ………… 39

2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến khảo sát in vivo ……… 40

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Một số thí nghiệm tiền đề tài……… 41

3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức nisin và disodium EDTA trên hai chủng nghiên cứu……….……… 45

3.3 Các kết quả khảo sát in vivo…… ……… 51

3.4 So sánh hiệu quả chăm sóc răng miệng của nước súc miệng nisin- disodium EDTA với nước súc miệng diệt khuẩn thị trường và đóng góp cụ thể của đề tài……… 60

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 68

PHỤ LỤC……… 74

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Dữ liệu nồng độ ức chế danh nghĩa …… ……….… 14 Bảng 1.2 Hệ vi sinh vật trong miệng……… 21

Bảng 2.1 Công thức nước súc miệng đề nghị cho khảo sát in vivo……… 32 Bảng 2.2 Các công thức kháng khuẩn và tỉ lệ các thành phần………… 33 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị 10 ml các công thức kháng khuẩn từ dung dịch

gốc nisin và disodium EDTA 100mM……… 38

Bảng 3.1 Đường kính vòng kháng khuẩn trên chủng K pneumoniae … 45

Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn trên chủng F nucleatum…… 48 Bảng 3.3 Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) ở điều kiện

thường (không sử dụng nước súc miệng)……… 52 Bảng 3.4 Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10

Bảng 3.5 Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10

ngày sử dụng nước súc miệng chứa 25µg/ml nisin-20mM

Bảng 3.6 Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10

ngày sử dụng nước súc miệng diệt khuẩn thị trường ………… 57 Bảng 3.7 Đường kính vòng kháng khuẩn của nước súc miệng nisin-

disodium EDTA và nước súc miệng diệt khuẩn trên hai chủng nghiên cứu……… 61 Bảng 3.8 So sánh hiệu quả chăm sóc răng miệng giữa nisin- disodium

EDTA và nước súc miệng diệt khuẩn thị trường……… 62

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các mô hình tạo lỗ ……… 16

Hình 1.2 Cấu trúc răng……… 28

Hình 2 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu……… 40

Hình 3.1 Chủng Klebsiella pneumoniae qua kính hiển vi……… 41

Hình 3.2a, b Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường Columbia blood agar base và môi trường Thioglycollate agar ………… 41

Hình 3.3 Chủng Fusobacterium nucleatum qua kính hiển vi……… 42

Hình 3.4 Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum trên môi trường Columbia blood agar base……… 43

Hình 3.5 Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum trên môi trường Thioglycollate agar……… 43

Hình 3.6 Đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào của chủng Klebsiella pneumoniae……… 44

Hình 3.7 Đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào của chủng Fusobacterium nucleatum……… 44

Hình 3.8 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn trên chủng Klebsiella pneumoniae theo nồng độ nisin……… 46

Hình 3.9 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn trên chủng Fusobacterium nucleatum theo nồng độ nisin ……… 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic LAB: Lactic acid bacteria, vi khuẩn sinh lactic acid

MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus

kháng methicillin GRAS: Generally regarded as safe , được xem là an toàn UV: Ultra violet, tia cực tím

FDA: Food and Drug Association, Hiệp hội Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ ATCC: American Type Culture Collection, bộ sưu tập giống vi sinh vật Hoa Kỳ CFU: Colony form unit, đơn vị khuẩn lạc tạo thành

OD: Optical density, mật độ quang NSM: Nước súc miệng

MỞ ĐẦU

Chứng hơi thở hôi là căn bệnh phổ biến có nhiều yếu tố nguyên nhân Các mùi khó chịu phát ra từ khoang miệng được cho là từ các thực phẩm nặng mùi, như tỏi và hành; từ vài loại dược phẩm; từ cơ thể; từ các bệnh hệ thống; từ các nhiễm trùng khác và từ vi khuẩn

Vài con đường liên quan với chứng hơi thở hôi, bao gồm đường thở (mũi, xoang, họng và phổi), đường tiêu hóa, và vài cơ quan như thận, gan Mặc dù có rất nhiều nguyên nhân liên quan đến chứng hơi thở hôi, ước tính khoảng 80 – 90% mùi hôi là xuất phát từ miệng và vi khuẩn chịu trách nhiệm trực tiếp cho các khí có mùi khó chịu này

Các nhà nghiên cứu đã xác định được vài vi sinh vật sản sinh ra các mùi khó chịu và giải thích thỏa đáng về các điều kiện cần thiết cho sự sinh tổng hợp mùi hôi, đó là: vi khuẩn yếm khí, sự thiếu hụt oxy, pH kiềm và các chất nền có chứa sulfur

Các sản phẩm hóa học từ sự phân hủy của vi khuẩn là hợp chất lưu huỳnh bay hơi (volatile sulfur compounds - VSCs) có mùi hôi thối và được xác định là chịu trách nhiệm cho hơi thở hôi Các hợp chất lưu huỳnh bay hơi như hydrogen sulfide, methyl mercaptan, dimethyl sulfide và dimethyl disulfide chiếm hơn 90% mùi của sự phân hủy từ miệng

Bằng phương pháp in vitro, McNamara và cộng sự (1972) đã chứng minh rằng sự

tạo thành mùi của sự phân hủy có liên quan với sự hoán chuyển trong quần thể vi sinh vật từ sự trội hơn của Gram dương sang sự trội hơn của quần thể yếm khí Gram âm Không có vi sinh vật Gram dương nào sản sinh ra mùi khó chịu trong khi tất cả

vi sinh vật Gram âm (Fusobacterium polymorphum, Veillonella alcalescens, Bacteroides fundiliformis, Klebsiella pneumoniae) lại sản sinh ra mùi phân hủy

Trong một nghiên cứu tương tự, Solis-Gaffar và cộng sự (1980) đã tìm ra rằng chỉ

có các vi sinh vật Gram âm (Veillonella alcalescens, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides melanogenicus và Klebsiella pneumoniae) sản sinh ra hợp chất lưu

huỳnh bay hơi

Một số nghiên cứu cho thấy rằng hợp chất lưu huỳnh bay hơi của chứng hôi miệng góp phần vào sự phát sinh bệnh viêm nha chu Điều trị chứng hơi thở hôi là phải trực tiếp loại bỏ hay ít nhất làm giảm các vi sinh vật gây bệnh và các chất nền liên kết

NISIN đã được nghiên cứu rất nhiều về hiệu quả của nó đối với các vi khuẩn gây bệnh răng miệng (xem phần 1.5.2) Điểm nổi bật hơn là khi sử dụng nisin cùng với các chất kết hợp như disodium EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), calcium EDTA, EGTA (ethyleneglycoltetraacetic acid), lactate, sodium hexametaphosphate, alkyldiamine tetraacetates … thì sự kết hợp này làm tăng cả về độ rộng phổ lẫn hoạt lực kháng khuẩn của nisin lên các vi khuẩn Gram âm

Trên cơ sở đó, đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau:

Mục tiêu chung

Nghiên cứu này đưa ra công thức nước súc miệng chứa nisin, một chất chống khuẩn bản chất sinh học (bacteriocin), và chất kết hợp (chelating agent/chelator) disodium EDTA với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của công thức này lên các vi khuẩn Gram

âm (Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae) gây hơi thở hôi nói riêng và

gây bệnh răng miệng nói chung

Nội dung

Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium

EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi

Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1 lên hệ

vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi So sánh hiệu quả của công thức đề nghị với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacteriocin

1.1.1 Giới thiệu

Bacteriocin là một trong số các chất chống khuẩn sản sinh bởi lactic acid bacteria (LAB), cùng với các thành phần chống khuẩn khác là các acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và các enzyme ức chế Bacteriocin là các peptide hoặc các protein được tổng hợp ribosom và thường hoạt động chống lại các loài có quan hệ gần Bacteriocin khác với các kháng sinh truyền thống trong cách thức chủ yếu là: chúng có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp và chỉ độc đối với các vi khuẩn có quan hệ gần với chủng sản xuất Những độc tố này được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn chính và gần đây, chúng cũng được biết là được sản xuất bởi một vài thành viên của cổ khuẩn (Archaea)

Bacteriocin của LAB thường mang điện dương, chứa ít hơn 100 amino acid và có chứa phần nhiều (hơn 30%) các amino acid kị nước Điện dương của các peptide này đảm bảo lực hút tĩnh điện với màng ngoài vi khuẩn tích điện âm, trong đó phần kị nước của peptide sẽ tương tác với màng tế bào và xâm nhập vào màng đôi phospholipid

Bacteriocin được xem như là peptide bảo vệ và vì thế được xếp vào nhóm tương tự như độc tố nấm men, hay defensin của động vật có vú, cecropin của côn trùng, tachyplesin của cua, magainin của động vật lưỡng cư, pandanin của bọ cạp, và thionin của thực vật Phần lớn bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, nghĩa là chỉ có một số loài xác định, thường là những loài có quan hệ phát sinh loài gần với chủng sản xuất bị ảnh hưởng Tuy nhiên, vài bacteriocin bộc lộ phổ kháng khuẩn rộng hơn nhiều và còn mở rộng ra đến động vật nguyên sinh, nấm men, nấm mốc và virus [38]

1.1.2 Bacteriocin – nhìn lại lịch sử

Nghiên cứu về ức chế nội vi khuẩn (inter-bacterial), cũng tương tự như nhiều khía cạnh cơ bản khác về vi sinh học, có thể tìm thấy sự liên quan về nguồn gốc của nó với Louis Pasteur Vào năm 1877, Pasteur cùng với cộng sự Joubert của ông, đã tìm cách

kiểm soát sự phát triển của anthrax bacillus, loài đã được báo cáo (cả in vivo và in vitro) về hoạt tính ức chế khi kết hợp cùng nuôi cấy với Escherichia coli được phân

lập từ nước tiểu

Phần lớn các thành công ban đầu trong việc xác định bản chất bacteriocin lại liên quan đến bacteriocin của vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là colicin và phần nhiều các kiến thức này là từ các công trình của Gratia và Fredericq

Một quan sát bước ngoặt trong các khảo sát về bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

ghi lại rằng một vài hoạt tính ức chế của lactococci (streptococci nhóm N) đối với các

LAB khác là do một chất chống khuẩn có bản chất protein gọi là “chất ức chế nhóm N” hay còn gọi là nisin [40]

1.1.3 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đa dạng hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram âm Trải qua nhiều năm, nhiều phương pháp phân loại bacteriocin đã được đưa ra [37]:

Fredericq (1957) phân loại bacteriocin dựa trên đặc trưng hấp thu và các phân lớp phụ phù hợp với đáp ứng miễn dịch

Reeves (1965) thiết lập một hệ thống bao gồm 16 lớp bacteriocin dựa trên các loài sản sinh ra chúng

Bradley (1967) phân loại bacteriocin dựa trên trọng lượng phân tử Klaenhammer (1993) phân loại bacteriocin thành 4 lớp dựa trên cấu trúc, cơ chế hoạt động, di truyền và đặc điểm hóa sinh (xem phần 1.1.3.1)

Cotter và cộng sự (2005) phân thành 2 lớp chính, mỗi lớp lại chia thành các phân lớp phụ (xem phần 1.1.3.2)

Bacteriocin lớp I chứa lanthionine hay β-methyllanthionine gọi là lantibiotic Chúng phải trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã để sản sinh ra các peptide có kích thước nhỏ hơn 5 kDa Các lantibiotic nhóm A như nisin, epidermin và subtilin là các peptide có hình dạng đinh ốc, thon dài, linh động với hoạt tính tạo lỗ, trong khi các lantibiotic nhóm B, mà ví dụ tiêu biểu là mersacidin, thì nhỏ và đặc với các thành phần đặc trưng nhắm vào màng vi khuẩn Các lantibiotic nhóm B hoạt động bằng cách can thiệp vào phản ứng enzyme của tế bào, như tổng hợp thành tế bào

Các bacteriocin không chứa lanthionine (non-lanthionine bacteriocin) được xếp vào lớp II Các peptide này bền nhiệt và không trải qua chỉnh sửa sau dịch mã Bacteriocin lớp II chủ yếu hoạt động bằng cách gây ra sự thấm của màng và tiếp theo là rò rỉ các phân tử của vi khuẩn mục tiêu

Lớp phụ IIa là lớp phụ lớn nhất Chúng hoạt động chống lại Listeria và có một trình tự

đầu N bảo tồn kết hợp không đặc trưng lên bề mặt đích Giống như các lantibiotic nhóm A, bacteriocin lớp phụ IIa tạo các lỗ trong màng nguyên sinh chất Các ví dụ tiêu biểu là pediocin và các bacteriocin tương tự pediocin (pediocin-like bacteriocin), sakacin A, và leucocin A

Bacteriocin lớp IIb như lacticin F và lactococcin G tạo các lỗ và có hai protein khác nhau Trong trường hợp của lacticin 3147, thì một protein đóng vai trò khử cực màng, trong khi protein còn lại thì có vai trò tạo lỗ

Acidocin 1B, được xếp vào nhóm phụ IIc Các bacteriocin không tương tự pediocin (non-pediocin like bacteriocin) được xếp vào nhóm phụ IId

1.1.3.1 Cách phân loại của Klaenhammer (1993)

Lớp I – bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã (post-translationally modified bacteriocin) ví dụ lantibiotic

Các lantibiotic được chia thành dạng thẳng (nhóm A) và dạng cầu (nhóm B) Lớp II – các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt hoạt động theo cơ chế màng

Lớp IIa: các peptide kháng Listeria

Lớp IIb: các peptide hai thành phần Lớp IIc: các peptide hoạt hóa thiol (thiol-activated peptide) Lớp III – các bacteriocin lớn (>30 kDa), không bền nhiệt Lớp IV – các bacteriocin phức hợp bao gồm các bán lipid hay bán carbohydrate cơ bản kết hợp với protein

Gần đây, Kemperman và cộng sự (2003) đã đề nghị ghi nhận một lớp mới (lớp V) bao gồm các peptide kháng khuẩn dạng vòng thắt từ đầu đến cuối, tổng hợp ribosom, không chỉnh sửa sau dịch mã (ribosomally synthesized, non-modified head-to-tail ligated cyclic antibacterial peptide) [40]

1.1.3.2 Cách phân loại của Cotter (2005)

Nhóm Đặc tính

I – Lantibiotic Ia Nhỏ (19-38 amino acids), thon dài, là các peptide mang điện dương, tạo lỗ Ib Peptide cầu, gây cản trở các enzyme chủ yếu

II – Bacteriocin không chứa lanthionine IIa Peptide tương tự pediocin (Pediocin-like peptide) IIb Bacteriocin 2 peptide, yêu cầu cả 2 peptide để thể hiện hoạt tính IIc Peptide vòng, đầu N và đầu C là các liên kết đồng hóa trị IId Peptide không tương tự pediocin (non-pediocin like peptide) đơn

[37]

1.1.4 Ứng dụng của bacteriocin

Các ứng dụng được khảo sát cho đến nay của bacteriocin là trong ba lĩnh vực: thực phẩm, y học và chăm sóc răng miệng Bacteriocin chủ yếu được ứng dụng trong thực phẩm là nisin Nisin là chất bảo quản trong phomat tự nhiên; phomat chế biến thanh trùng; sữa thanh trùng và các sản phẩm từ sữa; rau quả đóng hộp; thịt; cá và động vật biển có vỏ (tôm, cua); thức uống có cồn; trong sản phẩm bột nướng có độ

ẩm cao; trứng dạng lỏng thanh trùng; nước xốt thịt bò; xốt salad; trong thực phẩm

chay được làm từ đậu nành và các rau củ khác; trong các sản phẩm rau củ lên men (xem chi tiết trong phần 1.2.5)

Ứng dụng y học của bacteriocin:

Sử dụng thường xuyên các kháng sinh dẫn đến nguy cơ kháng kháng sinh của các mầm bệnh trên người và động vật Kháng kháng sinh và nổi trội hơn là các mầm bệnh vi khuẩn đa kháng đã dẫn đến những nghiên cứu các chất kháng khuẩn thay thế để chữa trị và ngăn ngừa các nguồn lây nhiễm trên cả người và động vật Vì cơ chế hoạt động của bacteriocin khác đáng kể so với các kháng sinh thông thường, chúng được xem là cách tiếp cận mới đối với việc kiểm soát nguồn gây bệnh vi sinh vật Nghiên cứu về các peptide kháng khuẩn, với mối quan tâm đặc biệt về bacteriocin của LAB, đang bước vào kỷ nguyên mới với những ứng dụng mới hơn là được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm như lâu nay [37]

a Nhiễm trùng da

Staphylococcus aureus và S aureus kháng methicillin (MRSA) là các vi sinh

vật phổ biến nhất trong nhiễm trùng da MRSA được báo cáo lần đầu tiên trong những năm 1960 sau khi methicillin đã được dùng trong nhiều năm để điều trị

nhiễm trùng do S aureus Oxacillin, nafcillin, quinopristin-dalfopristin,

rifampicin, ciprofloxacillin, teichoplanin, cefazolin và cephalothin A cũng được

dùng để điều trị nhiễm trùng do S aureus nhưng thành công rất giới hạn Mersacidin, một lantibiotic sản sinh bởi chủng Bacillus sp HIL Y-85,54728, ức chế sự phát triển của chủng MRSA in vivo trên chuột và có thể được xem là

phương pháp điều trị thay thế Peptide này ức chế sự tổng hợp thành tế bào của chủng MRSA với hiệu quả tương tự vancomycin Mersacidin cũng có hoạt tính

chống lại Propionibacterium acnes và do đó có thể được sử dụng trong điều trị

mụn

Lacticin 3147, một lantibiotic 2 peptide sản sinh bởi Lactococcus lactis subsp lactis, ức chế sự phát triển của chủng S aureus, MRSA và chủng Enterococcus faecalis kháng vancomycin

Các nisin A và Z đang bước vào các thử nghiệm tiền lâm sàng cho việc chữa trị

enterococci kháng vancomycin

Epidermin và gallidermin, cũng được phân loại là lantibiotic nhưng được sản

sinh bởi Staphylococcus gallinarum và Staphylococcus epidermidis, đã chứng

tỏ hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng da Epidermin và gallidermin cũng có hoạt

tính chống lại P acnes Bonelli và cộng sự (2006) đã đo hoạt tính chống khuẩn

của epidermin và gallidermin bằng cách xác định sự phóng thích potassium (K+)

khỏi màng trên các mô hình họ xây dựng

Nisin và IB-367, một peptide tương tự protegrin (protegrin-like peptide) mang điện dương sản xuất bởi công ty Intrabiotics (Mountain View, California), gần đây đã bước vào giai đoạn I thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiễm trùng mụn [37]

b Viêm vú ở động vật cho sữa

Chứng viêm vú do vi khuẩn gây ra những thiệt hại kinh tế to lớn trong ngành công nghiệp sữa Các thử nghiệm đã được thực hiện bởi Taylor và cộng sự

(1949) cho thấy rằng dịch truyền nisin vào trong tuyến vú có hiệu quả trong việc

điều trị cả nhiễm do streptococcal và staphylococcal Broadbent và cộng sự (1989) trong thí nghiệm in vivo cho thấy rằng nisin ức chế sự phát triển của một vài vi khuẩn Gram dương gây bệnh viêm vú

Lacticin 3147 đã chứng tỏ hiệu quả trong việc điều trị viêm vú ở bò và cho thấy

hoạt lực chống lại staphylococci và streptococci vú Một bacteriocin sản sinh bởi Bacillus subtilis LFB112 ức chế sự phát triển của S aureus liên quan tới bệnh viêm vú

Streptococcus gallolyticus subsp macedonicus ST91KM sản sinh ra bacteriocin (macedocin ST91KM) có hoạt tính chống lại Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae subsp dysgalactiae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis, bao gồm các chủng

kháng methicillin và oxacillin Macedocin ST91KM vì thế có thể được sử dụng như là một phương án thay thế trong việc điều trị bệnh viêm vú ở bò cho sữa [37]

c Viêm nhiễm do cấy ghép

Một vài trường hợp viêm nhiễm do các dụng cụ cấy ghép y sinh bị tạp nhiễm đã được báo cáo

Nisin, được hấp phụ lên một bề mặt được silan hóa, ngăn ngừa sự phát triển của

Listeria monocytogenes

Trong một nghiên cứu độc lập, các nhà nghiên cứu đã phủ ống Teflon® FEP bằng nisin và chèn dụng cụ này vào tĩnh mạch cổ của cừu Trong một thí nghiệm tương tự, các ống thông khí quản PVC được phủ và đặt vào đường thở trên của ngựa Các ống thông khí quản phủ nisin đã ngăn ngừa sự tạo thành khuẩn lạc của

S aureus, S epidermidis và Streptococcus faecalis [37]

d Nhiễm trùng đường hô hấp trên

Pseudomonas aeruginosa là tác nhân chính gây bệnh viêm phổi ở bệnh nhân xơ nang và hơn 50% bệnh nhân xơ nang bị nhiễm trùng phổi P aeruginosa cũng

là một trong những nguồn gây bệnh viêm tai cấp/mãn tính Viêm tai giữa là một trong những bệnh thường gặp nhất ở trẻ dưới 2 tuổi Thêm vào nhiễm trùng phổi

ở bệnh nhân xơ nang và nhiễm trùng tai, P aeruginosa cũng liên quan với

nhiễm trùng vết thương bỏng, đặc biệt là ở những người bị suy giảm miễn dịch

Nisin ức chế sự phát triển của S pneumonia liên quan đến bệnh viêm tai giữa trong các thử nghiệm in vivo Peptide ST4SA, một bacteriocin lớp II, cho thấy

hoạt lực tốt hơn đối với các mầm bệnh viêm tai giữa do vi khuẩn Gram dương khi so với các chất kháng khuẩn khác

Peptide IB-367 gần đây trải qua giai đoạn I thử nghiệm an toàn trên người với

mục tiêu chống nhiễm trùng phổi cấp do P aeruginosa, đặc biệt là trên các

bệnh nhân xơ nang [37]

e Lao

Cuối thế kỷ 20, khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm Mycobacterium tuberculosis và có nguy cơ của bệnh lao Chỉ riêng 2007, hơn 13 triệu người

được chẩn đoán bị nhiễm lao và hơn 9 triệu trường hợp mới được báo cáo Tổ

chức y tế thế giới báo cáo hơn 1.8 triệu cái chết là do M tuberculosis (WHO 2009) Bacteriocin lớp II có hoạt tính chống lại M tuberculosis Theo các thử nghiệm in vivo, một phức hợp bacteriocin–liposome làm tăng tỉ lệ sống của

động vật khi cho tiếp xúc với mầm bệnh [37]

nguy hiểm đối với trẻ em, phụ nữ mang thai, những người bị tổn thương hệ miễn dịch và người lớn tuổi Mầm bệnh thường đi vào ruột và gắn với các tế bào biểu mô ở đó chúng được giữ lại bởi sự thực bào Hemolysin được vi khuẩn tiết ra

gây ra sự tan của màng thể thực bào Listeria sống sót từ sự đại thực bào và đi

xuyên qua rào chắn máu/não gây ra bệnh viêm màng não

Listeria kháng với các β-lactam, monolactam và cephalosporin, bao gồm

cefotaxime và ceftazidime

Các bacteriocin lớp II có hoạt tính chống lại L monocytogenes và có thể được sử dụng để điều trị listeriosis Pediocin PA-1, sản sinh bởi Pediococcus acidilactici, bộc lộ hoạt lực chống khuẩn in vivo chống lại các chủng L monocytogenes khác nhau Thêm vào đó, pediocin PA-1 không ức chế các vi

khuẩn đường ruột khác trong dạ dày

Clostridium botulinum gây ra bệnh thần kinh mất cảm giác được biết như là

chứng ngộ độc thịt Độc tố thần kinh ức chế sự phóng thích acetylcholine từ đầu nối các cơ thần kinh, gây ra sự mất cảm giác

Nisin đã chứng tỏ hiệu quả ức chế C botulinum và Clostridium tyrobutyricum

Nisin cũng chứng tỏ hiệu quả chống lại Clostridium difficile và có thể được sử

dụng trong điều trị tiêu chảy [37]

g Loét dạ dày

Sự xâm nhập của Helicobacter pylori trong dạ dày gây ra các rối loạn như viêm

dạ dày mãn tính, loét hệ tiêu hóa, lympho mô và ung thư dạ dày

Nisin và Lacticins A164 và BH5 ức chế sự phát triển của H pylori in vitro và

do đó có thể được sử dụng để điều trị loét hệ tiêu hóa Nisin, được sản xuất bởi công ty AMBI (Purchase, New York), và IB-367, một peptide tương tự protegrin (protegrin-like peptide) mang điện dương từ công ty Intrabiotics (Mountain View, California), đã thành công vượt qua giai đoạn I (an toàn) thử nghiệm lâm sàng Cả hai peptide này đang được xem xét cho việc điều

trị loét bao tử gây ra bởi H Pylori [37]

h Viêm và dị ứng

Phospholipase A2 đóng vai trò điều hòa lưu lượng arachidonic acid, dẫn đến sự tạo thành chất môi giới của sự viêm và dị ứng, bao gồm các prostaglandin, leukotriene và hydroxyeicosatetraenoic acid Các lantibiotic duramycin, duramycin B và C, và cinnamycin ức chế phospholipase A2 gián tiếp bằng cách cô lập chất nền phosphatidylethanolamine, vì thế nó có thể được sử dụng làm thuốc chống viêm [37]

i Cao huyết áp

Enzyme chuyển đổi angiotensin (angiotensin-converting enzyme) xúc tác sự chuyển đổi angiotensin I thành angiotensin II và phân hủy bradykinin, có liên quan tới điều hòa áp suất máu và cân bằng dịch thể Các lantibiotic tương tự cinnamycin (cinnamycin-like lantibiotic) và ancovenin, một lantibiotic nhóm B, có khả năng ức chế angiotensin-converting enzyme Lantibiotic vì thế có tiềm năng trong điều trị cao huyết áp [37]

j Nhiễm trùng đường niệu-sinh dục

Bacteriocin (subtilosin A) có tiềm năng trong điều trị nhiễm trùng đường sinh dục [37]

niệu-Trong lĩnh vực chăm sóc răng miệng, bacteriocin (chủ yếu là nisin) đã chứng tỏ tiềm năng trong điều trị các bệnh về răng miệng thông qua rất nhiều nghiên cứu (xem phần 1.5.2)

1.2 Nisin – bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis

1.2.1 Định nghĩa và giới thiệu

Nisin là một lantibiotic, thuộc nhóm I, loại A và là lantibiotic được nghiên cứu kỹ nhất cho đến nay Nisin đóng vai trò như là một hệ thống mô hình cho những nghiên cứu các mối quan hệ chức năng/cấu trúc bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã, tổ chức gen và các đặc điểm hóa sinh [40]

Nisin là một protein (polypeptide) có đặc tính kháng khuẩn khối lượng phân tử thấp

được sản sinh tự nhiên bởi các chủng Lactococcus lactis subsp lactis (gọi chung là L.lactis) Lúc này nó được mô tả là chất độc hiện diện trong sữa và có ảnh hưởng bất

lợi lên sản phẩm phomat trong quá trình lên men [10] LAB bacteriocin đầu tiên, nisin, được phát hiện lần đầu vào năm 1928, khi Rogers L.A

quan sát sự trao đổi chất của Streptococcus lactis (ngày nay được phân loại lại là Lactococcus lactis) ức chế đối với các LAB khác [38] Nó là chất bảo quản tự nhiên

được tìm thấy trong sữa nồng độ thấp và phomat, hoàn toàn không độc và không gây dị ứng đối với người [3]

Bước ngoặt đáng chú ý trong lịch sử và sự phát triển của nó là với vai trò là chất bảo quản thực phẩm Nghiên cứu đầu tiên về tiềm năng của nó như là chất bảo quản thực

phẩm được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự (1951) và các nghiên cứu sử dụng nó làm chất bảo quản trong phomat chế biến vào năm 1952

Sự phát triển nisin ở dạng sản phẩm thương mại (có tên là Nisaplin) được thực hiện bởi Aplin và Barrett vào năm 1957 Nisaplin chứa 2.5% nisin A, lên men môi trường

sữa bởi chủng sản xuất nisin – L.lactis subsp lactis [10]

Nisin được chứng minh là chất không độc bởi các nghiên cứu khác nhau từ năm 1962 Cấu trúc phân tử được làm sáng tỏ vào năm 1971 Nisin là một peptide 5 vòng gồm 34 amino acid trong đó có 13 amino acid được chỉnh sửa sau dịch mã, phân tử lượng 3,354 Daltons [2] FDA duyệt cho phép sử dụng nisin như là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học vào năm 1988 [38]

Với việc được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia trên thế giới và trong hơn 50 năm, nisin đang dẫn đầu trong lĩnh vực bacteriocin, không chỉ liên quan đến các kiến thức được tích lũy về đặc trưng hóa học và cơ sở di truyền mà còn vì qui mô và các ứng dụng thực tế khác nhau của nó [40]

Các ứng dụng thương mại rộng rãi của nisin dẫn đến mối quan tâm đáng kể đối với các bacteriocin khác từ các vi sinh vật được xem là an toàn (generally regarded as safe -

GRAS) [38]

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn

Nisin là chất kháng khuẩn có khả năng kháng rộng các vi khuẩn Gram dương Nisin

cho thấy khả năng tiêu diệt một phạm vi rộng các vi sinh vật bao gồm Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus và Staphylococcus Nó cũng có hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram âm như Camphylobacter, Haemophilus, Helicobacter, Neisseria, Escherichia coli và Salmonella trong điều kiện hỗ trợ là màng ngoài bị phá hủy do đó nisin được sử dụng kết hợp với các chất khác [38]

Phổ kháng khuẩn của Ambicin N (một Nisin thương mại) đã được lập bằng cách thử nghiệm định lượng nồng độ ức chế danh nghĩa đối với các vi khuẩn Gram dương và Gram âm quan trọng trong miệng (nominal inhibitory concentration) Các chất chống mảng bám như cetyl pyridinium chloride, chlorhexidine và triclosan cũng được thử

nghiệm để so sánh Kết quả được trình bày trong bảng 1.1 Kết quả từ bảng cho thấy nisin có hoạt lực vượt trội [15]

Bảng 1.1 Dữ liệu nồng độ ức chế danh nghĩa

Vi sinh vật

Cetyl pyridinium

chloride (ppm)

Chlorhexidine (ppm)

Triclosan (ppm)

Ambicin N (ppm)

1.2.3 Đặc điểm hóa lý – Độ ổn định và độ hòa tan

Ở dạng khô, nisin đậm đặc cho thấy độ ổn định cao khi được bảo vệ tránh ánh sáng trực tiếp, tránh hấp thu ẩm và khi lưu ở nhiệt độ không quá 220C Các nghiên cứu trước đây cho rằng độ ổn định của nisin trong dung dịch tăng khi pH giảm Những nghiên cứu gần đây cho thấy, kết luận trên là không chính xác và độ ổn định tối ưu là trong khoảng pH 3 – 3.5 Vì thế, khi hấp tiệt trùng một dung dịch nisin trong đệm (25 µg/ml) ở 1210C trong 15 phút thì kết quả thu được là: ở pH 1, hoạt lực được giữ lại là nhỏ hơn 30%, ở pH 2 là 65%, ở pH 3 – 3.5 là 100%, ở pH 4 là 84% và ở pH 5 là 46%

Nisin tan nhiều trong môi trường acid và giảm dần độ tan khi pH đạt đến trung tính Ở pH 2 độ hòa tan khoảng 56 mg/ml, ở pH 5 là 3 mg/ml và ở pH 11 là 1 mg/ml [55]

Sự tạo thành các lỗ hay kênh với sự suy yếu lực đẩy proton là hoạt động đầu tiên của nisin Trong hai cơ chế kể trên, sự ức chế sinh tổng hợp thành tế bào là một quá trình tương đối chậm

Nhiều mô hình khác nhau cho sự tạo thành lỗ hay các kênh bởi nisin (nhóm lantibiotic) và các bacteriocin nhóm khác đã được đưa ra, như mô hình “nêm” và mô

hình “thùng-mảnh ghép” Mô hình “nêm” được đưa ra đối với lantibiotic, trong khi mô hình “thùng-mảnh ghép” được đưa ra đối với bacteriocin nhóm II

Trong mô hình “nêm” (chữ V), đầu amino acid ưa nước, tích điện dương (của peptide) tương tác với các đầu tích điện âm của lớp đôi phospholipid Tiếp theo, đầu kị nước của peptide chèn vào màng (hình 1.1A)

Trong mô hình “thùng-mảnh ghép”, bacteriocin tạo một bó gồm các peptide xoắn α (hình 1.1B) với đầu ưa nước quay vào trong và đầu kị nước quay ra ngoài Các tương tác tĩnh điện được tạo thành giữa đầu amino acid (của peptide) tích điện dương và lớp đôi phospholipid tích điện âm Phần kị nước của peptide tương tác với chuỗi acyl béo kị nước của lipid màng Một khi chèn được vào màng tế bào, phân tử bacteriocin tạo lỗ dẫn đến sự suy yếu lực đẩy proton

Hình 1.1 Các mô hình tạo lỗ

(A): Mô hình “nêm” (wedge) (B): Mô hình “thùng-mảnh ghép” (barrel-stave)

[34]

1.2.5 Ứng dụng

Từ lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1928, ứng dụng chủ yếu của nisin là trong

lĩnh vực thực phẩm với vai trò chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học Phomat tự nhiên: Nghiên cứu đầu tiên khảo sát nisin với vai trò là chất bảo quản

thực phẩm được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự (1951) trong việc sử dụng nisin để

ngăn ngừa sự tạo thành khí do Clostridium trong phomat lên men tự nhiên[55] Phomat chế biến thanh trùng: Việc sử dụng nisin làm chất bảo quản trong các sản phẩm phomat chế biến thanh trùng là nhiều hơn bất cứ loại thực phẩm nào khác Sữa thanh trùng và các sản phẩm từ sữa: Nisin được thêm vào sữa để kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm

Rau quả đóng hộp: Trong đa số các trường hợp, thực phẩm có độ chua thấp (pH trên 4.5) phải được xử lý nhiệt đủ để đảm bảo khử được Cl botulinum, tuy nhiên một số bào tử của các vi khuẩn chịu nhiệt như B stearothermophilus hay Cl thermosacchrolyticum có thể sống sót và gây hư hỏng, đặc biệt là khi lưu trữ trong

điều kiện ấm, vì thế, bằng việc sử dụng nisin, có thể kiểm soát được hư hỏng do vi khuẩn chịu nhiệt khi được trữ ở nhiệt độ ấm trong thời gian dài, ngoài ra còn cho phép giảm cường độ xử lý nhiệt Việc giảm cường độ xử lý nhiệt mang lại rất nhiều lợi ích do giảm được bất lợi do nhiệt, đảm bảo được chất lượng thực phẩm đóng hộp

về vị, cảm quan, đồng thời giảm tiêu thụ năng lượng trong sản xuất Thịt: Thay thế cho nitrite trong chế biến và bảo quản thịt bò, gà… Cá và động vật biển có vỏ (tôm, cua): Loại bỏ hay ức chế Cl botulinum, L monocytogenes trong cá, cá phi lê xông khói, tôm… đóng gói (chân không, với

100% carbon dioxide)

Thức uống có cồn: Nisin được ứng dụng trong lên men bia vì nó chứng tỏ độ nhạy với các vi khuẩn làm hỏng bia

Các ứng dụng khác: Trong sản phẩm bột nướng có độ ẩm cao; trứng dạng lỏng

thanh trùng; nước xốt thịt bò Nisin cũng được sử dụng để kiểm soát các hư hỏng thực phẩm do vi khuẩn sinh lactic acid trong thực phẩm có pH thấp như xốt salad; trong thực phẩm chay được làm từ đậu nành và các rau củ khác; trong các sản phẩm

rau củ lên men như bắp cải lên men, sauerkraut (dưa cải bắp Đức) lên men và kim

chi Toàn cảnh tương lai của việc ứng dụng nisin trong thực phẩm: Đó là sử dụng nisin

cùng với các chất kết hợp để làm cho vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với nisin; nghiên

cứu ảnh hưởng kết hợp của nisin, lysozyme và citrate chống lại L.monocytogenes trong pate gan; chống lại L.monocytogenes và hư hỏng do bacilli trong phomat chế biến; nisin phối hợp với pediocin; nisin phối hợp với sodium lactate và potassium sorbate Tất cả những nghiên cứu này cho thấy hoạt tính tăng cao của nisin khi kết hợp với các chất bảo quản khác

Một lĩnh vực nữa làm tăng mối quan tâm đó là sự kết hợp hay phủ nisin lên các vật liệu bao gói thực phẩm Siragusa và cộng sự (1999) kết hợp nisin vào màng nhựa

polythen và chứng minh sự kiểm soát Brochothrix thermosphacta trên bề mặt thịt

bò Scannel và cộng sự (2000) hấp thụ nisin lên vật liệu bao gói cellulose và polythene/polyamide và chứng minh hoạt lực chống khuẩn vẫn duy trì trên vật liệu trong ít nhất 3 tháng [55]

Nisin được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm trong hơn 50 năm (ở Anh) và hơn 20 năm (ở Mỹ)

Sự phát triển các sản phẩm có nisin tinh sạch dẫn đến việc khảo sát nó cho sử dụng trong thú y và dược [10]

Trong lĩnh vực chăm sóc răng miệng, rất nhiều nghiên cứu đã và đang được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các sản phẩm như kem đánh răng, bột đánh răng, sản phẩm đánh răng dạng lỏng, nước súc miệng, viên pha súc miệng, kem matxa nướu, kẹo nhai (chewing gum) có chứa nisin trong việc điều trị các bệnh răng miệng như mảng bám, viêm nướu, hơi thở hôi

1.3 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) là một polyamino carboxylic acid EDTA là chất rắn không màu, tan trong nước EDTA được sử dụng rộng rãi trong việc lọc sạch (loại) các ion kim loại: trong hóa sinh và sinh học phân tử, người ta thường dùng phương pháp loại ion để làm bất hoạt các enzyme phụ thuộc ion EDTA được

sử dụng để liên kết với các ion kim loại trong các phương pháp điều trị phối hợp, ví dụ như điều trị nhiễm độc thủy ngân và chì

EDTA có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như y học, hóa học và thú y; khả năng hòa tan trong nước và tính độc thấp làm cho nó thân thiện hơn do đó nó có thể được sử dụng kết hợp với kháng sinh để làm tăng hoạt lực kháng sinh, cũng như chống lại các vi sinh vật đa kháng thuốc

Farca và cộng sự (1997) đã nghiên cứu hiệu quả hiệp lực khi phối hợp tromethamine (EDTA-Tris) và ba kháng sinh (cephaloridine, kanendomycin, enrofloxacin) trên các chủng Gram âm và Gram dương kháng thuốc Vi khuẩn được phân lập từ 8 trường hợp viêm tai ngoài mãn tính, 5 trường hợp viêm da mãn tính và 4 trường hợp viêm bàng quang tái phát ở chó mà trước đó đã được điều trị với một trong ba kháng sinh mà không thành công Các động vật này được điều trị bằng EDTA-tromethamine phối hợp với kháng sinh đã khỏi bệnh hoàn toàn trong vòng 10 ngày và đã được kiểm tra lâm sàng và vi khuẩn học trong 180 ngày Việc rửa vết thương với dung dịch EDTA-tromethamine không gây khó chịu và không tác dụng phụ

EDTA-Mohamed và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sử dụng sự phối hợp EDTA-kháng sinh

để kiểm soát Pseudomonas aeruginosa Sáu chủng đa kháng thuốc trong số 260 vi

khuẩn khác nhau đã được phân lập từ các bệnh nhân ở bệnh viện đại học Tanta, Ai Cập trước cuộc nghiên cứu Các kháng sinh khác nhau đã được thử nghiệm khi có và không có sự phối hợp với EDTA trên mỗi chủng Kết quả cho thấy 70% các chủng vi sinh vật đã chuyển từ kháng sang nhạy, đặc biệt là với các kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein

Các nghiên cứu được thực hiện gần đây đều cho thấy sự phối hợp của kháng sinh và EDTA làm tăng độ nhạy chống lại các chủng phân lập và EDTA có hiệu quả trong việc làm tăng hiệu lực của kháng sinh (làm tăng sự thâm nhập của kháng sinh vào thành tế bào) [43]

1.4 Hệ vi sinh vật trong khoang miệng người khỏe mạnh và người bệnh

Trên 700 loài vi sinh vật đã được xác định từ các nghiên cứu thực hiện trên khoang miệng, với nhiều nghiên cứu tập trung vào sự đa dạng của vi sinh vật trong khoang

miệng trong thời gian bệnh [18] Các nghiên cứu đã được thực hiện trên vài phía của khoang miệng đã xác định rằng, khoang miệng của người khỏe mạnh có chứa nhiều vi sinh vật từ 6 ngành, gồm:

1 Firmicutes, bao gồm các loài Streptococcus, Gemella, Eubacterium, Selenomonas và Veillonella;

2 Actinobacteria, bao gồm các loài Actinomyces, Atopobium và Rothia; 3 Proteobacteria, bao gồm các loài Neisseria, Eikenella và Campylobacter; 4 Bacteroidetes, bao gồm các loài Porphyromonas, Prevotella và

Capnocytophaga; 5 Fusobacteria, bao gồm các loài Fusobacterium và Leptotrichia;

6 Các thành viên của ngành (phylum) TM7 Trên lưỡi và phần miệng, má trong, quần thể vi sinh vật cư trú tự nhiên gồm

Streptococcus, Veillonella, Bacteroides và Haemophilus Trên răng, Streptococci và Actinomyces chiếm ưu thế nhưng cũng có thể tìm thấy các vi khuẩn hình cầu,

vi khuẩn hình que Gram dương và âm khác [12] Fergusson S.V (2010) đã thực hiện một nghiên cứu và cung cấp thêm thông tin về cộng đồng vi sinh vật ổn định trong miệng bằng các phương pháp phân tích hiện đại Bảng 1.2 trình bày các chi được xác định từ phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) mẫu nước súc miệng Mẫu nước súc miệng này chứa 10 ml nước khử ion tiệt trùng, được súc rửa trong 30 giây sau đó thu vào một ống nghiệm tiệt trùng Tất cả các mẫu được lấy khoảng 2 giờ sau khi đánh răng và trong suốt thời gian đó đối tượng không ăn gì cả 9 chi đã được xác định

Bảng 1.2 Hệ vi sinh vật trong miệng

Chi Số lần phát sinh

loài của chi được tìm thấy

Số phát sinh loài khác nhau

Mô tả chi

khí, nói chung là vi sinh vật hội sinh không

gây bệnh

thành tế bào Gram dương), yếm khí, khuẩn

cầu, cư trú trong miệng và đường hô hấp

không chuyển động, đơn bào, cư trú trong miệng và có thể là loại gây bệnh viêm nha

chu, có các gen kháng kháng sinh tự nhiên

tiện, cư trú trong miệng và đường hô hấp,

có thể gây viêm nhiễm

trú trong hốc miệng người và động vật

um

Fusobacteri-2 2 Thuộc Eubacteria, trực khuẩn yếm khí,

gây bệnh, gắn kết với các vi sinh vật Gram dương và âm trong mảng bám răng miệng

nas

Porphyromo-1 1 Thuộc Bacteroidetes, trực khuẩn yếm khí,

gây bệnh răng miệng, hemin đã sử dụng như nguồn sắt cho sự tăng trưởng

hệ gần với Streptococcus

tiện, nguồn gây bệnh cơ hội trong hốc

miệng

[18]

1.5 Các bệnh răng miệng

Các bệnh răng miệng được xem là một vấn đề của sức khỏe cộng đồng khắp nơi trên thế giới Khoang miệng của người cung cấp những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau, gây các bệnh về răng miệng [1]

1.5.1 Mảng bám răng

Màng sinh học vi khuẩn (Bacterial biofilm) Màng sinh học có thể được mô tả như sự tập hợp các mảnh của tế bào vi khuẩn Sự tạo thành màng sinh học nhằm bảo vệ vi khuẩn khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như tia UV, độc tố kim loại, thực bào và kháng sinh

Màng sinh học là một nhân tố quan trọng của khoang miệng vì chúng hiện diện như là mảng bám trên bề mặt răng Hơn thế nữa, các vi sinh vật cư trú trên màng

sinh học – mảng bám chắc chắn sẽ tương tác để tạo và duy trì màng Streptococcus và Actinomyces là những chủng chính khởi đầu của mảng bám và chúng giúp cho

việc thành lập cộng đồng vi sinh vật màng sinh học từ thời điểm đầu [18] Các bệnh về răng có nguyên nhân chủ yếu là do các vi khuẩn hiện diện trong mảng bám ở các túi răng Một túi răng khỏe mạnh luôn luôn có một lượng nổi trội các vi khuẩn Gram dương, trong khi lượng vi khuẩn Gram âm tăng lên cùng

với sự tiến triển của bệnh về răng Bacteroides gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corroders, Actinobacillus actinomycetemcomitans được cho là

các vi khuẩn Gram âm gây bệnh Ở những người trưởng thành bị bệnh nghiêm trọng về răng, trong phần lớn các trường hợp, người ta phát hiện các vi khuẩn

Gram âm, trong đó Bacteroides gingivalis, xuất hiện với tần số đặc biệt cao [35]

Các bước hình thành mảng bám (plaque formation) [60]

(1) Việc chải răng chỉ giúp cho răng sạch trong chỉ vài (1 – 2) phút (2) Glycoprotein trong nước bọt được hấp phụ lên bề mặt răng Lớp màng

mỏng tạo thành trên bề mặt răng là lớp chất hữu cơ vô định hình, không chứa mảnh tế bào Thông thường, lớp màng này không thể nhìn thấy bằng mắt thường, chỉ có thể phát hiện khi dùng chất bắt màu

(3) Vi khuẩn gắn vào lớp màng mỏng, còn lớp màng mỏng thì phủ trên lớp men răng Trong vòng 1 giờ đầu tiên sau khi đánh răng, trực khuẩn và cầu khuẩn Gram (+) sẽ bám vào lớp màng này

(4) Trong 24 – 48 giờ tiếp theo, vi khuẩn mỗi lúc mỗi tích tụ dày hơn trên lớp màng mỏng

(5) Xen kẽ giữa các vi khuẩn, các chất (nước bọt, chất dịch trong kẽ răng) sẽ hình thành nên chất nền, là nơi các vi khuẩn trú ngụ

(6) Các vi khuẩn sản sinh các chất kết dính cho chất nền từ đường (glucan, sucrose, fructan, levan, polysacchride) trong thức ăn

(7) Càng ăn nhiều đường, vi khuẩn (đặc biệt là streptococcus mutans) sinh sản

và kết dính vào lớp mảng bám càng nhanh (8) Nếu việc vệ sinh răng miệng loại bỏ được quần thể vi sinh vật này, quá

trình tích tụ và bám dính của vi khuẩn lại bắt đầu (9) Ở vị trí nào mà mảng bám không được loại bỏ, vì răng miệng không được

vệ sinh hay vệ sinh không hiệu quả, thì vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển thành một khối phức tạp

(10) Trong 4 – 7 ngày tiếp theo, khi mảng bám dày thêm ở phần cổ răng, các mảnh/sợi nhỏ tiếp tục bám vào các lớp sâu bên trong, cuối cùng là sự phát triển của các vi khuẩn yếm khí Gram âm

(11) Trong 7 – 14 ngày tiếp theo, khi mảng bám tiếp tục phát triển, các phẩy khuẩn, xoắn khuẩn và tế bào máu (màu trắng) xuất hiện Các lớp sâu bên trong của mảng bám trở nên yếm khí và trội hơn của Gram (-) Nướu răng bị viêm nhẹ

(12) Trong 14 – 21 ngày tiếp theo, các phẩy khuẩn và xoắn khuẩn tiếp tục nhân lên Các vi khuẩn được sắp xếp như hàng rào vuông góc bề mặt răng Lúc này, dấu hiệu viêm nướu có thể thấy rõ

1.5.2 Viêm nha chu – Viêm nướu

Răng và cấu trúc hỗ trợ là nướu (lợi), là các đối tượng bị tác động bởi các vi khuẩn, gây ra bệnh viêm nha chu và nếu không chữa trị sẽ dẫn đến viêm nướu [1]

1.5.3 Bệnh sâu răng

Bệnh sâu răng (dental caries) là một căn bệnh có đặc điểm bởi sự hòa tan phần khoáng của răng Khi sự sâu răng tiến triển, sẽ gây ra sự phá hủy men răng và tiếp theo là sự viêm tủy và các mô [11]

1.5.4 Hơi thở hôi

Một vấn đề răng miệng quan trọng nữa là hơi thở hôi, gây khổ sở cho khoảng 1/3 dân số và có liên quan đến các bệnh về răng Chứng hơi thở hôi có nguyên nhân từ một số nguồn khác nhau, như bởi dạ dày hay phổi, nhưng nguyên nhân lớn nhất vẫn là từ miệng Các hợp chất gây mùi hôi được sản sinh trên các bề mặt khác nhau trong khoang miệng và các túi răng, nhưng phần lớn là bề mặt lưng lưỡi, từ quá trình chuyển hóa của vi sinh vật và sự lên men của các protein miệng

Các hợp chất gây mùi khó chịu là các hợp chất lưu huỳnh bay hơi (volatile sulfur compounds - VSCs) bao gồm hydrogen sulfide, methyl mercaptan, và dimethyl sulphide Hàm lượng tổng cộng của chúng chiếm khoảng 90% VSCs Các hợp chất gây mùi khó chịu khác bao gồm các acid hữu cơ mạch ngắn như valeric acid, butyric acid, putrescine và skatole Các loài sinh ra các hợp chất gây mùi khó chịu

gồm Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythensis, Porphyromonas endodontalis và Eubacterium species Các

loài sinh ra các hợp chất gây mùi khó chịu hiện diện phổ biến ở lưng lưỡi của những người bị chứng hôi miệng Vài nghiên cứu cho rằng hợp chất lưu huỳnh bay hơi sản sinh bởi những vi sinh vật này góp phần vào sự tiến triển của bệnh răng miệng bằng cách phá vỡ màng nhày biểu mô miệng dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn [18]

1.6 Thành phần nước súc miệng

Rất nhiều các nghiên cứu đã và đang được thực hiện trong nhiều năm để đưa ra các công thức kiểm soát ức chế vi sinh vật gây bệnh trong miệng Một công thức vệ sinh răng miệng nói chung bao gồm một chất kháng khuẩn hoặc hơn, chất bề mặt, chất giữ ẩm, chất tạo mùi, chất tạo ngọt, chất làm trắng, chất bảo quản,

1.6.1 Chất kháng khuẩn

Các chất kháng khuẩn được sử dụng trong các công thức vệ sinh răng miệng khác nhau gồm các chất có bản chất hóa học như chlorhexidine digluconate, cetyl pyridinium chloride và triclosan [15]

Chất chống khuẩn có hiệu quả nhất và đã được thử nghiệm là chlorhexidine, đã được sử dụng hơn 20 năm Chlorhexidine digluconate đã được nghiên cứu rất kỹ và là chất chống mảng bám và chống viêm nướu hiệu quả Tuy nhiên, chlorhexidine được báo cáo là có một số tác dụng phụ: làm biến màu răng và lưỡi (thành nâu) [38]

Kháng sinh (penicillin) cũng đã được sử dụng để điều trị các bệnh răng miệng Chúng cho thấy là có hiệu quả nhưng phá hủy cả vi khuẩn có lợi và có hại trong miệng dẫn đến mất cân bằng hệ vi sinh vật răng miệng [11]

Các tác dụng phụ này dẫn tới việc tìm kiếm các chất chống mảng bám thay thế [38].Một trong số các chất kháng khuẩn bản chất sinh học đang được nghiên cứu nhiều trong các công thức chăm sóc răng miệng là bacteriocin (xem phần 1.7.2)

1.6.2 Chất bề mặt

Người ta nhận thấy rằng hoạt lực chống khuẩn của các bacteriocin, đặc biệt là nisin, không tương thích với các chất bề mặt mang điện âm (anionic surfactants) mạnh như sodium lauryl sulphate và sodium N-methyl-N-cocyl laurate Các chất bề mặt mang điện âm mạnh làm bất hoạt hay ức chế các chất chống khuẩn bacteriocin (thường mang điện dương [15]

Chất bề mặt thích hợp có thể là không mang điện (nonionic), mang điện dương (cationic) và lưỡng tính (amphoteric) hay hỗn hợp của chúng

Chất bề mặt nonionic thích hợp bao gồm:

 Polyethoxylated sorbitol esters, đặc biệt là polyethoxylated sorbitol monoesters, ví dụ PEG(40) sorbitan diisostearate và sản phẩm có tên thương mại là `Tween" được sản xuất bởi ICI;

 Dạng đa trùng ngưng của ethylene oxide và propylene oxide (poloxamers), ví dụ sản phẩm có tên thương mại là 'Pluronic' được sản xuất bởi BASF-Wyandotte;

 Dạng trùng ngưng của propylene glycol; polyethoxylated hydrogenated castor oil, ví dụ, cremophors;

 Sorbitan fatty esters

Những dung môi hay chất mang thích hợp có thể bao gồm các thành phần như chất tạo mùi, chất tạo ngọt, ví dụ sodium saccharin, chất nhuộm, chất làm trắng ví dụ titanium dioxide Các chất bảo quản, chống nhạy như strontium và các muối potassium

pH nước súc miệng có thể từ 4 – 9.5 nhưng thích hợp nhất là từ 5 – 5.5 [15]

1.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 1.7.1 Các nghiên cứu trong nước

Hiện chưa có nghiên cứu trong nước về hướng của đề tài này

1.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước

a Howell T.H và cộng sự (1993) đã thực hiện một nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của nước súc miệng chứa nisin (100 μg/ml nisin và 300 μg/ml nisin trong dung dịch chứa 1 mM disodium EDTA) đối với sự phát triển mảng bám và viêm nướu ở chó săn khi so sánh với nước súc miệng có chứa 0.12% chlorhexidine và giả dược Sự phát triển mảng bám và viêm nướu được theo dõi bằng các phương pháp đo chỉ số viêm nướu, chỉ số mảng bám, chỉ số độ nhạy bắt màu của răng và mức độ chảy máu răng Sự tích tụ mảng bám ít hơn ở nhóm sử dụng nisin và chlorhexidine Chỉ số viêm nướu thấp hơn ở nhóm sử dụng nisin từ ngày 27 và nhóm sử dụng chlorhexidine từ ngày 39 Sự chảy máu cũng ít hơn ở nhóm sử dụng nisin so với giả dược Mức độ ố màu răng của nhóm sử dụng chlorhexidine cao hơn nhóm sử dụng giả dược và nisin Tác giả đã kết luận rằng nisin là một chất chống khuẩn và có hiệu quả trong việc làm giảm sự phát triển mảng bám và viêm nướu ở chó săn

b Gaffar A và cộng sự (1994) đã nghiên cứu công thức nước súc miệng chống mảng bám bao gồm nisin (0.1%) và một polyphosphonate là azacycloheptane-2,2-diphosphonate

Kết quả cho thấy hoạt tính chống mảng bám vượt trội khi thử nghiệm trên một thiết bị “miệng nhân tạo”

United States Patent đã cấp bằng sáng chế số hiệu 5,368,845; ngày cấp 29/11/1994 cho công trình của nhóm tác giả này

c Doel G.R và cộng sự (1998) đã nghiên cứu công thức vệ sinh răng miệng chứa nisin (tên thương mại AMBICIN N - được sản xuất bởi Applied Microbiology Inc) trong liệu pháp chống mảng bám

Kết quả nghiên cứu lâm sàng theo phương pháp mù đôi (double blind) của tác giả trên 29 đối tượng, sản phẩm kem đánh răng chứa 0.05% AMBICIN N đã cho thấy sự giảm có ý nghĩa thống kê (sau khi chải răng 15 phút) về tổng số vi sinh vật

hiếu khí, Streptococcal và quần thể vi sinh vật yếm khí khi so sánh với kem đánh

răng giả dược (không có AMBICIN N) United States Patent đã cấp bằng sáng chế số hiệu 5,833,958; ngày cấp 10/11/1998 cho công trình của nhóm tác giả này

d Turner và cộng sự (2004) đã thực hiện một khảo sát in vitro về hiệu quả kháng

khuẩn của nisin trong chân răng và lớp ngà dọc thành chân răng Mục tiêu của

nghiên cứu là xác định hiệu quả của nisin trong việc tiêu diệt Enterococcus faecalis và Streptococcus gordonii trong hệ thống chân răng Tác giả đã kết luận rằng nisin có hiệu quả trong việc triệt tiêu tế bào Enterococcus faecalis và Streptococcus gordonii và có thể so sánh với Ca(OH)2 trong việc loại trừ các loài này khỏi hệ thống chân răng [38]

e Noordin K (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin lên mảng bám và chứng viêm lợi ở người trưởng thành trẻ tuổi

Tác giả đã tìm thấy sự khác nhau có ý nghĩa giữa chỉ số mảng bám trung bình (Plaque index – PI) và chỉ số viêm nướu trung bình (gingivitis index – GI) giữa nước súc miệng chứa nisin và nước súc miệng giả dược sau 14 ngày Nước súc miệng chứa nisin làm giảm sự tích tụ mảng bám (13.2%) so với nước súc miệng giả dược Nước súc miệng chứa nisin cũng làm giảm viêm nướu

Hình 1.2 Cấu trúc răng [62]

(25.2%) vào ngày 14 so với ngày 1, trong khi nước súc miệng giả dược chỉ làm giảm 5.8%

Tác giả nhận định rằng nước súc miệng chứa nisin có tiềm năng trong việc ức chế sự tích tụ mảng bám và có hiệu quả trong việc làm giảm viêm nướu

Tác giả cũng trình bày về một cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát sự bám dính của các vi khuẩn không mong muốn đó là ức chế sự bám lúc khởi đầu của vi khuẩn, hơn là cố gắng để loại bỏ chúng khi chúng đã bám vào

Tóm lại, nisin với nhiều ưu điểm như [33, 39]:  An toàn:

o Khảo sát in vivo bởi FDA năm 1988 cho thấy nisin không độc trên động vật

o Là bacteriocin duy nhất được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm ở hơn 50 quốc gia trên 50 năm

o Mặc dù đã được sử dụng thời gian dài trong công nghiệp thực phẩm, rất ít hiện tượng vi khuẩn kháng nisin xảy ra

o Không mùi, không màu, không vị và không gây kích ứng hay ố màu răng

 Hiệu quả:

o Phổ kháng khuẩn rộng đối với các vi khuẩn Gram dương o Hoạt tính mạnh và tính độc có chọn lọc đối với vi khuẩn Gram dương o Khi phối hợp với các chất hoạt động bề mặt/chất kết hợp, nisin có

khả năng kháng được các vi khuẩn Gram âm o Tấn công vào vi khuẩn mục tiêu mà không làm ảnh hưởng đến cộng

đồng vi sinh vật không gây bệnh, nhờ vậy không làm giảm sự kháng của tế bào chủ đối với các loài gây bệnh

cho thấy tiềm năng như là chất tác dụng tại chỗ trong khoang miệng điều trị bệnh hơi thở hôi nói riêng và các bệnh răng miệng nói chung

Mặc dù việc điều trị các bệnh răng miệng bằng các chất hóa học cho thấy một số hiệu quả, sâu răng vẫn tiếp tục phát triển như là vấn đề sức khỏe rộng khắp với chi phí kinh tế kinh ngạc Đặc biệt, sự tiêu thụ lan rộng các loại đường khử, đặc biệt là