Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của vật chủ nuôi cấy đến năng suất, hàm lượng hoạt chất Cordycepin và Adenosine đối với Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

militaris có chứa các hoạt chất sinh học và giá trì được liu ương đương, nhưng lại phân bố vàtìm thấy ở nhiều nơi trên thé giới, có thể sinh trường, phát triển ở nhiều điều kiện môi trườ

HOANG PHƯƠNG LY

NGHIÊN CUU ANH HUONG CUA VAT CHỦ NUÔI CÁY

DEN NANG SUAT, HAM LƯỢNG HOAT CHAT

CORDYCEPIN VA ADENOSINE ĐÓI VỚI DONG TRÙNG

HA THAO CORDYCEPS MILITARIS

CHUYEN NGANH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC:

Pe BÙI VAN THANG

CONG HÒA XÃ HỘI CHỦ Ni

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Đề tai nghiên cứu của tôi “Nghiên cứu ảnh hưởng của vật chủ nuôicấy đến năng suất và hàm lượng hoạt chất Cordycepin và Adenosine đốivới Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Đây là đề tai nghiên cứu củariêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Bai Văn Thắng Các số.liệu, kết quả tinh bay trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác Nếu nội dung và kết quả nghiên cúu của tôi

trùng lặp với bat kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bổ, tôi xin hoàn toànchịu trách nhiệm va tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học

Hà nội, Ngày thing năm 2023NGƯỜI CAM ĐOAN

Hoàng Phương Ly

Lâm nghiệp, Các

dạ

cô giảng viên Trường Đại học Lâm nghiệp đã giảng , truyền đạt kiến thức, cũng như giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn cao học này.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Thầy giáo PGS.TS Bai Văn Thắng - Viện trường Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp

-và Cô giáo - TS Nguyễn Thị Minh Hằng - Giảng viên Viện Công nghệ sinhhọc Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp, đã trực tiếp hướng dẫn nhiệt

tình, giải đáp kip thời các thắc mắc và truyền đại những kinh nghiệm quý báutrong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc si

Em xin được gửi lời cảm ơn tới quý Công ty Cổ phần Dược liệu Hataco'Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ vé cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm đẻ em

có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách tốt nhất

Trong quá trình lầm luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm on sự giúp đỡ quý báu đó.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luônđộng viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công,luận án này:

Em xin chân thảnh cảm ơn!

Hà Nội, ngày thang năm 2023

TÁC GIÁ

Hoàng Phương Ly

MỤC LUC LỜI CAM DOAN

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIEU 3

1.1 Giới thiệu chung về nắm Đông trùng ha thao «n3

3 3

vi

vũi

1

1.1.1 Phân loại, hình thái của DTHT C militaris:

1.12 Sự phân bố của nắm Đông trùng ha thảo

1.1.3 Lược sie nghiền cứu 4 4

1.1.4 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của ném Đông trùng ha thảo vào co

7 thé côn trừng

1.1.5 Thành ph ida học và ting dung trong y học của C militris 7

1.1.6 Tác dụng của hoạt chat trong nắm Đông trùng ha thảo 9

1.2 Các nghiên cứu về đông tring hạ thảo _1.2.1 Trên tế gibt sous : : wo IS

1.2.2 Tại Việt Nam 16

1.3, Nang suất và giá trị thương mại của nắm Đông tring hạ tháo 171.4 Các kỹ thuật nuôi trồng nắm Đông trùng hạ thảo 181.41 Nhôi trong môi trường lỏng 18 1.4.2, Nhi trên môi trường rắn tổng hợp 191.43 Nubi rằng trên ký chủ nhộng tằm 19

1.5 Nghiên cứu nuôi trồng tăng hoạt chất Cordycepin và Aenosine 20

1.6 Tầm đâu (Bombyx mori-Linnaeus) 20 1.7 Tâm thầu dầu, lá sẵn Attacus ricini 2

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU 232.1 Mục tiêu chung 23 2.2 Mục tiêu cu thể 2

2.3 Nội dung nghiên cứu, 23

2.4 Vat ligu, hóa chất, dung cụ và máy móc nghiên cứu A

3.4.1.Vật liệu ` 24

3.4.2.Hóa chat a>} % 2z2.4,3.Dung cụ và máy móc 2z 2.5 Địa điểm nghiên cứu mer) 2.6 Phương pháp nghiên cứu m Sn 252.6.1 Phương pháp tạo dung dich giẳng sản xuất (giống cấp 2) 253.6.2.Xây dựng quy trình ky thuật nuôi trông nắm Đông trùng hạ thảo (C.militaris) trên ký chủ tim dâu sống ( 262.6.3 Phương pháp nuối tring và đánh gid năng suất nắm Đồng tring ha

thảo (C militaris) cấy Irên các loại ký chủ 28

2.6.4 Phương pháp xác định hàm lượng Cordycepin va Adenosine bằngmay s

2.6.5 Phương pháp phân tí

Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN

3.1 Xác định vị trí gây nhiễm trên cơ thể tằm dâu sống „33

ký lông hiệu nang cao 30

sở liệu

3.2 Xác định thé tích dung dịch giống nắm gây nhiễm vào tằm dâu sống 343.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển quả thé nắm 363.4 Kết quả lây nhiêm nắm vào ky chủ nhộng tim dâu, nhộng tim sắn, timđâu sống và bắp vô trùng 39

43.5, Đánh giá năng suất nắm mudi tren các vật chủ khắc nhau

3.6, Kết quả xác định hàm lượng cordycepin và adenosin trong DTHT C.miliaris trên cy chủ nhộng tim dâu, nhộng tằm sắn va tằm dâu 49KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ —¬ `

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHY LUC

DANH MỤC BANGBang 3.1 Ảnh hưởng của vị trí tiêm trên tằm dâu sống đến khả năng nhiễm 34.Bang 3.2: Ảnh hưởng của thé tích địch giống nắm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan

hệ sợi trên con tim bằng phương pháp tiêm vào phần miệng 35

Bang 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển quả thẻ nắm wTBảng 3.4, Kết qua ty lệ lay nhiêm nấm C militaris vào ký chữ nhộng tim dâu,nhộng tim sắn vả tim dâu 40Bang 3.5: Năng suất nắm sau 35 ngày nuôi trồng ở phòng nuôi sáng 43Bang 3.6 Năng suất nắm sau 40 ngày nuôi trồng ở phỏng nuôi sáng 45

Bảng 3.7, Nang suất nắm sau 50 ngày nuôi trồng ở phỏng nuôi sáng 47

Bang 3.8, Hàm lượng adenosine trong ĐTHT C: militarits trên ký chủ nhộngtằm dau, nhộng tẩm sắn và tam dau, „50Bảng 3.9 Kết quả phân tích him lượng Cordycepin trong ĐTHT C militaritstrên ký chủ nhộng tim dâu, nhộng tim sẵn vả tim dâu SI

DANH MỤC HÌNHHình 1.1 Cordyceps militaris

Hình 1.2 Vòng đời của nắm Đông trùng hạ thảo,

Hình 1.3 Công thức phân tử của hợp chất cordyecpin

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Adenosine

Hình 1.5 Vòng đời của tim dâu

Hình 2.1 A - Giống thạch DTHT, giống cấp 1; B - giổng sinh khối dich lỏng.THT, giống cấp 2 26Hình 2.2 Lay nhigm nắm vào tim bằng phương pháp tiêm 27Hình 2.3 Mẫu phan tích dong tring ha thảo trên vật chủ nhộng tim sẵn 31

Hinh 2.4 Mẫu phân tích đông trùng hạ thao trên Vat chủ nhộng tim đầu 1Hình 2.5 Mẫu phân tích đông trùng hạ thảo trên vật chủ tim dâu hap vô tring 31Hình 3.1 Tâm dau sống gây nhiễm nắm sau 6 ngày nuôi tối 34Hình 3.2 Tim dau sống bị nhiễm nắm sau 6 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt

độ phòng nuôi 220C, độ am 60%, 36Hình 3.3 Tam dâu sống nhiễm nắm ĐTHT sau 6 ngày nuôi tối chuyển sang

nuôi sáng nảy mắm vã phát triển quả thể 38

Hình 3.4 Tâm dâu sống nhiễm nắm ĐTHT sau 8 ngày nuôi tối chuyển sang.nuôi sáng nảy mắm và phát triển qua thẻ, 38Hình 3.5 Tim dâu sống nhiễm nam ĐTHT sau 10, 12, 14 ngày nuôi tốichuyển sang nuôi sing phát triển quả thé 45 ngày nuôi sáng, 39Hình 3.6 Các vật chủ sau khi bị lay nhiễm nấm và nuôi tối, hệ sợi ăn lan kín

cơ thể vật chil — - — soe

Hình 3.7 Sự khác nhau giữa nhộng sắn có hệ sợi nấm ăn lan và không có hệ.sợi nắm ăn lan, ° : : _Hình 3.8 Sự khác nhau giữa tằm đấu sống có hệ sợi nắm ăn lan và không có

hệ sợi nắm ăn lan AQ

Hình 3.9 Hình anh trong lượng nguyên con tằm va kích thước quả thé nhộngtầm sắn — — save see ABHình 3.10 Qua thé nim sau 35 ngày nuôi sáng : 44

Hình 3.11 Qua thể nắm sau 35 ngày nuôi sing 4

Hình 3.12 Một số hình ảnh kích thước quả thé, trọng lượng qua thé của cácvật chủ nuôi cấy trong thời gian 40 ngày nuôi sáng 46Hình 3.13 Quả thể nấm sau 40 ngày nuôi sáng 46Hình 3.14 Một số hình ảnh kích thước quả thé, trọng lượng nguyên con,trọng lượng quả thé tươi của các vật chủ nuôi cấy trong thời gian 50 ngày.nuôi trồng ở phòng nuôi sáng \ : 48 Hình 3.15 Quả thể nắm sau 50 ngày nuôi sing 48

ĐẠT VẤN ĐÈNam đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là danh từ để chỉ các loài nắm có đặcđiểm "sâu mùa đông” trở thành "cỏ mùa hè” đã được sử dụng như một loạithuốc và thực phẩm chức năng ở các nước phương Đông do chứa nhiều hoạtchất sinh học quý Tuy số lượng loài DTHT đã xác định là rất lớn, hơn 700loài, nhưng chỉ có một số ít loài được sử dụng làm dược liệu Trong số đó, chỉ

có 2 loài DTHT được sử dụng rộng rãi và có giá trị nhất trong y học cổ truyền.chau A là loài Cordyceps sinensis và Cordyeeps militaris Mặc dit, C sinensis

là loại nỗi tiếng và đắt tiền nhất nhưng do đặc thử vật chủ, kiện sốngkhắc nghi phân bổ hep nên nó tương đối hiểm vả không để dàng môi trồng

trong môi trường tự nhiên và nhân tạo Trong khi đó, loài C militaris có chứa

các hoạt chất sinh học và giá trì được liu ương đương, nhưng lại phân bố vàtìm thấy ở nhiều nơi trên thé giới, có thể sinh trường, phát triển ở nhiều điều

kiện môi trường khác nhau nên dé dàng nuôi trồng nhân tạo; đến nay loài C.smiliaris đã được nghiên cứu nuôi trồng và sản xuất ở quy mô công nghiệp trên

môi trường tổng hợp nhân tạo hoặc trên các vật chủ nuôi cấy khác nhau (Chen, Ruiying et al., 2002; Hong, In-Pyo et al., 2010; Yu, Hui Mei et al., 2006).

Loài C, militaris có him lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh như cordycepin, adenosine, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise,axit amin và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chi còn cao hơn so.với loài C sinensis, nhưng để dang nuôi trồng thành công trong môi trường.nhân tạo Loài C militaris chứa rit nhiều hoạt chất được liệu quý rit tốt cho

cơ thể con người: được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, các bệnh liênquan đến hệ thống hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa, thần kinh, sinh dục và đặc biệtgiúp cơ thể tăng cường hệ thống miễn dịch trong phòng chống một số bệnh

nhiễm vi khuẩn, vi rút (Das, Shonkor Kumar et al., 2010; Kim, Jae - Sung et

al., 2006; Wang, JF and Yang 2006),

C sinensis và C militaris trong phòng ngừa và điều trị virus Covid-19 cho

thấy, cordycepin có tác dụng phòng ngừa và điều trị Covid-19 bằng cách điều

hoa miễn dịch, làm giảm các cytokine ti n viêm, ngăn ngừa xơ hóa phối, cảithiện kha năng chồng lại tình trạng giảm ôxy máu va ức chế các enzyme củavirus Hơn nữa, các hoạt chất còn hỗ trợ duy trì các chức năng của phổi sau

1010) Chứng minh chothấy rằng cordycepin có thể được sử dung để điều trị Covid-19, giảm

dich và tắc dụng kháng virus Nghiên cứu này,

khi vượt cơn nguy kịch (Das, Shonkor Kumar et a.

m,

xơ hóa, tăng phản ứng mi

cung cấp dữ liệu tốt dé tìm ra phướng pháp hỗ trợ và điều trị Covid-19 trong

những thời điểm đại dịch dang bùng phát mạnh như hiện nay (Kim, Gi Young et al., 2006) Vì vậy; sử dụng nắm ĐTHT để sản xuất cordycepin làm.thuốc chữa bệnh là xu hướng đang được y học hiện đại it quan tâm.

-Ở Việt nam, đến nay có rất nhiều đơn vị nghiên cứu nuôi trồng thành.công loài nim DTHT C militaris-va nhiều sản phẩm thương mại được chế

biến từ nim ĐTHT được cung cấp ra thị trường (Aramwit, Pornanong et al.,

2014: Chen, Ruiying et al., 2002; Du, Jing et al., 2021) Ở mỗi cơ sở cónhững công thức nuôi trồng Khác nhau, sử dụng nguồn vật chủ nuôi cấy khác.nhau nên nắm BTHT có hàm lượng cordycepin, adenosine cũng sẽ khác nhau,giao động từ 1 - 5 mg cordycepin/g quả thể khô Với mục tiêu nâng cao hàmlượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong nim đông trùng hạ thảo nuôi.cấy, tôi thực hiện dé tài “Nghién cứu ảnh hưởng của vật chủ nuôi cấy đếnnăng suất va hàm lượng hoạt chất Cordycepin và Adenosine đối với nimĐông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” nhằm xác định được loài vật chủcho nuôi cấy C militaris đạt hoạt chất cao làm nguyên liệu được

Chương 1TONG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về nam Đông trùng hạ thio

LLL Phân loại, hình thái của DTHT C milieris

Cordyceps militaris

Giới (regnum) Fungi

Phan giới (subregnum) — Dikarya

Chi (genus) Cordyceps

Loài (species) Comilitaris

Hinh 1.1 Cordyceps militaris

Vé hình thái, qualthé của nấm mau vàng cam, đầu nấm dạng chiy,được mọc ra trên bất cứ chỗ nào ký chủ Nim Đông tring Hạ thảo khi cònsống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cảnh nhỏ, mọc lá.Khi sấy khô nó ¢6 mùi tanh như cá, đốt lên có mai thơm

1.1.2 Sự phan bé của nắm Đông trùng hạ thảo

‘Cae loài nam nay phân bố rộng ở châu A và châu Úc với trung tâm da

dang la vùng Đông A, đó là các cao nguyên cao hơn mặt biển từ 4.000 - 5.000

‘Thanh Hải, Theo các nhà khoa học thì chỉ nấm Cordyceps có tới 400 loài khác

m như: Tây Tang, Tứ Xuyê 1m Túc, Vân Nam,

nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nắmCordyceps sinensis và Cordyceps militaris cô giá trị được liệu tốt với con

chỉ Cordyceps, đó là Cordyceps sinensis, Cordyceps militarisvà Cordyceps sabrolifera (Trinh Tam Kiệt, 2001) và 02 loài mới được được phát hiện mới cho khu hệ nấm Việt Nam đó là Cordyceps~ mutans và Cordyceps

unnii (Phạm Quang Thu, 2009) Về thành phần hóa học và giá trị được liệu

chưa được nghiền cứu nhiều, từ các nguồn tài liệu khác nhau, các nhà khoa

học đã khẳng định nấm Đông trùng hạ thảo lả một dược liệu quý và hiểm Tại

vườn quốc gia Hoàng Liên thuộc Huyện Sa Pa Tính Lào Cai là nơi nắm Đôngtrùng hạ thảo phân bố

1.1.3 Lược sử nghiên cứu.

Đông trùng hạ thảo (THT) nghĩa là "sâu mùa đông” trở thành "cỏmùa hè” được các thầy lang người Tạng ghỉ chép lại lần đầu tiên trong thé ky

XV chi một loài nam ky sinh trên co thể sâu tuyết trên vùng núi cao 4000

-3000 m của cao nguyên vùng Tây Tạng và Tứ Xuyên (Trung Quốc) Nếu vịmùa đông, cặp sâu - nắm nay giống con sâu (côn trùng) thì đến mùa hè chúng

lại như một loài thực vật (cỏ) (Kim, Jae- Sung et al., 2006; Aramwit,

mạnh, gây chế iu, sau đó hình thành chỗi, phát

hề năm sau, nắm phát wié

triển thành qua thé trông như chiếc chéi cây chui ra khỏi đầu sâu, nhưng gốc.(hệ sợi) vẫn dinh vào cơ thé sâu Như vậy, vào mùa đông nắm sống trong cothể côn tring, vào mùa hè nắm lại phát triển ra ngoài cơ thể côn trùng trongnhư chiếc lá nhỏ nên được gọi là Đông trùng Hạ thao

Năm 1878, Pie Andrea Sacardo đã xác định loài nắm này thực chất là

sự ký sinh của một loài nắm túi thuộc chỉ Cordyceps với Ấu trùng (sâu non)

của một côn trùng thuộc chỉ Hepialus Do vậy ông đã chuyển loài Sphacriae sinensis sang chỉ Cordyceps và tré thành Cordyceps sinensis Sau này, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 46 loài thuộc chỉ Hepialus bịnấm Cordyceps ký sinh, nhưng chủ yếu là Thitarodes baimaensis hoặcThitarodes armoricanus (Kim, Gi - Young et al., 2006; Kim, Jae - Sung et al, 2006; Liu, Yi et al., 2015).

Năm 2007, khi phân tích phát sinh chủng loại phân tử, Cordyceps sinensis này lại được chuyển sang chỉ Ophiocordyceps và tên lại được đổi thành OphioCordyceps sinensis và lie này các nhà khoa học đã xác định đượcnhiều loài Cordyceps ký sinh ở nhiều loài côn trùng thuộc nhiều chỉ khácnhau và tên "Đông trùng hạ thảo" được giới khoa học thừa nhận nên từ đó vềsau các loài nắm ký sinh ở côn trùng được gọi chung là nắm đông trùng hạthảo (Kim, Gi - Young ef al., 2006; Kim, Jae - Sung et al., 2006; Liu, Yi et al 2015)

Năm 2005 các nhà khoa học đã thành công trong nuôi trồng hệ sợi

ĐTHT trong lên men chìm với nguồn định đường t

g/l sucrose, 10 gíl pepton, 3 g/l dich chi

k

uu cho sinh trưởng là 50nấm men đã thu được 22 g/ sinh

¡ hệ sợi nắm sau 40 ngày lên men chìm

Năm 2008, S.M Ruhul Amin, Nadia Alam, Mousumi Tania và Md Asaduzzaman Khan tai trung tâm phat t và mở rộng nắm quốc gia S

Dhakha, Bangladesh nghiên cứu về sự sinh trưởng của hệ sợi nắm Cordycepsmiliaris trong nhiều môi trường nuôi cấy ở các thang nhiệt độ và pH khác

nhau Với bổn loại môi trường: PDA (potatoes, dextrose, agar), PDYA

(potatoes, dextrose, yeast, agar), MEA (malt, extract, agar), YEA (yeast,extract, agar) để nuôi cấy hệ sợi nắm Cordyceps militaris thi thu được kết quả

PDA là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng của hệ sợi nắm Tiếp tục nuôi

độ phù hợp với sự sinh trưởng của hệ sợi nắm, các tác giả nuôi cấy hệ sợi

trong các khoảng nhiệt độ (= 10°C, 15°C, 20°C, 25`C;30°C và 35°C) và nhận

th la rằng hi soi nắm sinh trưởng được trong khoảng 10 - 25°C, tốt nl

trong 20 - 25°C, sợi nắm không sinh trưởng ở 30 - 35°C (Chen, Ruiying et al, 2002; Aramwit, Pomanong et al., 2014; Hong, In - Pyo et al., 2010),

Hiện nay, các nha khoa học đã xác định được hơn 700 loài ĐTHT, trong đó có khoảng 300 loài đã được báo cáo tạo ra quả thể thuộc chỉ Cordyceps (Kim, Gi - Young et al., 2006; Kim, Jae - Sung et al., 2006; Liu,

Yi et al., 2015) Với nhiều đặc tính được học quý hiếm ĐTHT không chi yhọc cổ truyền Tây Tạng và các nước Viễn Đông (Hàn Quốc, Triều Tiên, Nhật

Ban) mã cả y học hiện đại cũng sử dụng như một loại thuốc tăng cường miễndịch và lấy lại năng lượng và nhiều tác dụng khác tới nhiều hệ cơ quan trong

cơ thể Tuy có rit nhiều loài đã được xác định, nhưng chỉ có rit ít loài sửdụng trong y học do đặc tính được học của chúng Các loại này được gọichung là Cordyceps được pham Nhìn chung, hai loài nắm Cordyceps được sitdụng rộng rãi trong y học là OphioCordyceps sinensis và Cordyceps militaris, Mặc dù C sinensis được phát hiện đầu tiên nhưng vì nó chỉ ra quả thể trong

tự nhiên của các ving núi cao trên 4000 m của dãy Himalaya và chưa có quégia nảo sản xuất được quả thể nên chúng tương đối hiếm và rất đắt tiền.Ngược lại, C militaris thì lại có mặt ở nhiều nơi trên thé giới, tuy chủng.giống hoang đã cũng rất kén chọn vật chú, sinh trưởng chậm, giới hạn tăngtrưởng thấp, kích thước nhỏ nên chúng cũng rất hiếm và giá thành cũng kháđất đỏ, Tuy nhiên, khác với C sinensis, C militaris đã được sản xuất quả thétrên quy mô công nghiệp trên nền cơ chất bán rắn là các loại hạt chưa chuyểnđổi nên cũng đã đáp ứng được phần nao yêu cầu về sử dụng nim DTHT của

xã hội (Kim, Gi - Young et al., 2006; Kim, Jae - Sung et al., 2006; Liu, Yi et al., 2015, Li, SP, Yang et al., 2006).

1.1.4 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của nam Đông tràng ha thảo vào cơ thé côn tring

'Vào mùa đông, bao tử nắm ĐTHT có trong dat sẽ dính vào bên ngoàisau hay nhộng của các loài bướm khác nhau Sau đó bảo tử nắm sẽ nảy mắmthành ống có các thé bám Các ống nay sẽ tiết ra các enzyme kitinase, lipase,protease phá hủy vỏ ngoài ký chủ, xâm nhập vio mô bên trong cơ.

‘co thé ký chủ, hệ sợi nắm hút chat dinh dưỡng và phát triển chiếm toàn bộ cơ:thé, gây chết ký chủ, vỏ cứng lại để bảo vệ sợi nắm Đến mủa hè, hệ sợi nắm

sẽ nảy mim, làm nứt vỏ kiin của sâu, rồi phát triển thành quả thé Quả thé

sinh sản hình thành bảo tử trong các tii bảo tử Sau đó túi bảo tử nứt ra, bảo,

Trong

tử phóng thích ra môi trường Đến mùa đông, trứng côn tring nở thành sâu,nhộng, ngẫu nhiên bị bảo tử xâm nhập Vòng đời cứ thể tiếp tục (Kim, Gi -Young et al., 2006; Kim, Jaé Sung et al., 2006).

Quả thể

(Nguồn: internet)Hình 1.2 Vòng đời của nấm Đông trùng ha thio

1.1.5 Thành phin hóa học và ứng dụng trong y học của C militaris,

Phan tích hóa học cho thấy trong € militaris có tới 18 loại axit amin,lipid, nhiêu nguyên tổ vi lượng (Za, Fe, Se), nhiều loại vitamin (A, Bạ, Biz, C,

E, K) Quan trọng hơn, chúng chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị dượcliệu cao như acid cordycepic, superoxide dismutase (SOD), polysaccharide,manitol, adenosin, nhất là cordycepin chỉ có trong loại nắm nay (Yu, Hui Mei

truyền và y học hiện đại Theo “Ban thảo cương mục lập di” ĐTHT có vịngọt, tính ôn vào hai kênh phế và thận, có tác dụng bồi bỗ cơ thể cho người

bỗ thận, bổ tinh tủy, c máu, hóa đờm, đùng chữa hư hao sinh

ho, ho ra máu, liệt dương, lưng đau mỗi gối, đi tinh, dau tim (Kim, Gi- Young etal„ 2006; Li, SP, Yang et al., 2006; Aramwit, Pornanong et al , 2014).

của y học hiện đại, các nha khoa học khắp.Ngày nay, dưới sự phát t

nơi trên thé giới đã chứng minh được những công dụng của DTHT Y học hiện đại đã kiểm chứng lại các giả thuyết vé tác dung của DTHT trong y học

cô truyền phương đông bằng thực nghiệm Các hoạt chat sinh học tìm thaytrong ĐTHT đã được »

của chúng ở mức đội

1 định về thành phần, cầu trúc hóa học và tắc đụngsào, mức độ cơ thể và đã ứng dụng trong điều trị cho.người (Fukai, Tohru etal., 2011; Hong, In - Pyo rt., 2010; Kim, Gi - Young etal., 2006) Như vậy, với thành hóa học phong phú, DTHT có tác dung tốt vớicác cơ quan và các quá trình sinh lý của cơ thể Nhờ bổ sung tin, khoáng,

chất và adenos \e mà ĐTHT có tác dung tăng cường sinh lực, phục hồi nănglượng, đáp ứng yêu câu khi cơ thẻ hoạt động mạnh hoặc suy nhược cơ thẻ.Các loại polysaccharides, acid cordycepic, superoxide dismutase (SOD) vànhất là cordycepin không chỉ tác động đến hệ miễn dich, tăng cường sức chịuđựng của cơ thể với các kháng nguyên gây bệnh như virus vi khuẩn, giải độcrượu, bảo vệ tế bảo gan va thận, hỗ trợ điều trị ung thư và phòng chống HIV-

AIDS mà còn dùng để hỗ trợ điều trị ho, viêm phế quản, giảm đường huyết,

điều hòa nhịp tim, ôn định huyết áp Do khả năng tăng tiết testosterone của.adenosine đã lâm tang chất lượng và số lượng tinh tring, cải thiện đời sốngtình dục ở nam giới Mặt khác do khả năng chống oxy hóa tế bảo cao ciaSOD đã ngăn ngừa và hạn chế quá trình lão hóa, giúp tăng tuổi thọ nên ĐTITkhông chỉ rit tốt cho người giả mà còn được sử dụng kim mỹ phẩm trong

công nghệ làm đẹp da của người trẻ tuổi (Kim, Gi - Young et al., 2006; Li, SP Ynag et al., 2006; Aramwit, Pomanong et al., 2014).

Gan day, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Thổ Nhĩ Kỳ vé corchế tác động của nắm đông trùng hạ thảo trong phòng ngừa và điều trị virusCovid-19 cho thấy, Cordyceps sinensis và Cordyceps militarís có tác dung

hòa mi

phòng ngừa và điều trị Covid-19 bằng cách did dịch, làm giảm

cytokine tiền viêm, ngăn ngừa xơ hóa phỏi, cải thiện khả năng chống lại tình.trạng giảm Oxy máu và ức chế các enzyme của virus Hơn nữa, các hoạt chất còn

hỗ trợ duy trì các chức năng của phổi sau hi Vượt cơn nguy kịch Nghiên cứu

này đã chứng minh rằng Cordyceps sinen: và Cordyeeps miliawis có thé được,

sử dụng để điều trị Covid-19 để giảm viêm, xơ hóa, tăng phản ứng miễn dịch và

tác dụng kháng virus, Nghiên cứu nảy cung cắp dữ liệu tốt để tìm ra phương

pháp hỗ trợ và điều trị Covid-19 trong những thời điểm đại dịch dang bing phátmạnh như hiện nay (Kim, Gi~ Young et al., 2006).

1.1.6 Tác dung của hoạt chất trong nắm Đông tring hg thảo

1.1.6.1 Hoạt chất Cordyceppin

'ông thức hóa học: CụoH,›N.O,

- Khối lượng phân tử: 251,24 g/mol

x“ Công dung của cordycepin đối với sức khỏe.

‘Cordycepin là một loại hợp chất thể hiện tiềm năng điều trị đáng kể và

có nhiều mục tiêu nội bào, bao gồm axit nucleic, quá trình chết rụng và chu

kỳ tế bio, Nó có thé tham gia vào các quá trình phân tử khác nhau trong tế bảo vi tính tương tự của n6 với adenosine.

Cordycepin (3-deoxyadenosine) là một chất tương tự adenosine tựnhiên đã biết có nguồn gốc từ nắm, cũng có thể được sản xuất tổng hợp Hợp.chất phytochemical có hoạt tinh sinh học này được đặc trưng bởi một số hoạtđộng được lý mạnh đã được chứng minh có thể góp phần hiệu quả vào việc điều trị toàn di COVID-19, với các hoạt động kháng vi-rút là hoạt động

hàng đầu Một số nghiên cứu mới đã dự đoán kha năng ức chế ái lực của

cordycepin chống lại các mục tiêu chính cia protein SARS-CoV-2 (vi dụ,protein tăng đột biến SARS-CoV-2 (S), enzyme protease chính (M pro) và

‘enzyme RNA polymerase (RdRp) phụ thuộc RNA) dựa trên phương pháp tínhtoán Điều thú vị là, nghiên cứu hiện tại lần đầu tiên cho thấy cordycepin có.thé ức chế mạnh sự nhân lên của các chủng SARS-CoV-2 kháng thuốc mớivới khả năng kháng SARS-CoV-2 Et C 50 trong ống nghiệm rất ngắn Khoảng

2 uM, vượt qua cả remdesivir và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó

GS-441524 Các tinh năng được lý lý tưởng của phân tử cordycepin khiển nó trethành một chất ức chế điển hình đối với sự sao chép của SARS-CoV-2, vớicấu trúc linh hoạt của nó mở ra cho hầu hết các loại dẫn xuất trong tương lai,Tóm lại, những phát hiện hiện tại hd trợ thêm và gợi ý khả năng thay thé của.cordycepin chống lại COVID-19 và khuyến khích chúng tôi tự tin và nhanh

chóng bắt dau các đánh giá tiền lâm sang/tién lâm sảng để điều trị toàn diện

COVID-19 (Rabie, Amgad M et al, 2022),

'Nhiễu nghiên cứu đã xác định mối tương tác phan tử giữa cordycepin

có trong nim đông trùng hạ thảo với các protein của virus SARS-CoV-2Cordycepin hiện đang được thử nghiệm lâm sing (NCT00709215) có cấu trúc

tương tự với adenosine nhưng thiểu nhóm 30 hydroxyl trong gốc ribose Do

đó, cordycepin hoạt động như một chất ức chế poly (A) polymerase và quátrình tổng hợp protein sớm của virus Cordycepin có thé

RNA của SAR: 'oV-2 bằng cách ức chế quá trình polyadenyl hóa, ức chế sự

sao chép và nhân lên của virus trong vật chủ Hơn nữa, cordycepin có ái lực mạnh với protein SARS-CoV-2 (-145,3) và các protease chính (-180,5), đặcđiểm này cho thấy tiềm năng đi:

kalesh Kumar et al., 2022)

Loại thảo mộc Trung Quốc Đông tring hạ thảo nguồn gốc tir

trị Covid-19 của cordycepin (Vermar, A

inensis được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc truyền thống ở

để điều trị n loại bệnh Các chiết xuất của Cordyceps s

(CME) nỗichúng Trong nghiên cứu may, hiệu quả chống oxy hóa của CME và CSE

inensis

iéng với các tác dung sinh học của

trong việc bảo vệ lipid, protein và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) chống lạitic hại oxy hóa đã được nghiên cứu, CME và CSE cho thấy tác dụng ức chếyếu đối với quá trình oxy hóa liposome, hiệu quả của CME vượt trội hơn so

với CSE Đối với hệ thống mô hình oxy hóa protein, tác dung ức chế của

CME

1,0 mg/mL cho thấy lần lượt 50,5 và 67,1% ức chế quá trình oxy hóa LDL.Hàm lượng các thành phan hoạt tính sinh học cordycepin và adenosine trong

với qué trình oxy hóa protein kém hơn so với CSE, CME và CSE ở

CME cao hơn so với CSE; tuy nhiên, cả cordycepin và adenosine đều không

có hoạt tinh chống oxy hóa đáng ké nào được xác định bằng phương pháp khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox Hàm lượng polyphenolic và flavonoid là 60,2 và 0 598 ngímL trong CME và 31,8 và 0,616 jig/ml trongCSE, tương ứng, một phan có thẻ chịu trách nhiệm cho các hoạt động chống.oxy hóa của chúng Ngoài ra, một polysaccharide có trong CME và CSE thểhiện hoạt động chống oxy hóa, điều này cho thấy hoạt động này có thể bắtnguồn một phần từ polysaccharide của CME và CSE Xu hướng tìm kiếm

ABTS Gốc tự do và khả năng khử của CME và CSE hiển thị cách cư xử phụthuộc vào nồng độ, cho thấy rằng CME và CSE có thé là những chất tạo.hydro mạnh Trên cơ sở các kết quả thu được, tác dụng bảo vệ của CME và.

IE chống lại tác hại oxy hóa của các phân tử sinh học là kết quả của khả

năng thu don gốc tự do của chúng Saccharide, nucleoside, mannitol và sterolđược phân lập từ loại nắm này Hoạt động sinh học của € militaris là dothành phần saccharide và nucleoside, Trong nghiên cứu này, phần dung dichnước của quả thể C militaris thé hiện hoạt tính chống viêm đáng kể Quátrình phân đoạn hoạt tính được hướng dẫn bởi hoạt tính sinh học dẫn đến sựphân lập tam hợp chỉ bao gồm một và hai 'broside mới đã biết (dẫn xuất

ceramide), hai nucleoside và ba sterol Cordycerebroside A, cerebroside mới, cùng với beanacerebroside I và glucocerebroside đã ức chế sự tích tụ củaprotein iNOS gây viêm và làm giảm sự biểu hiện của protein COX-2 trongcác đại thực bảo RAW264.7 được LPS kích thích Đây là nghiên cứu

về việc phân lập các chất cerbroside có hoạt tính chống viêm từ bệnh TCMnày (Chiu, Ching - Peng et al., 2016).

tiên

Để khám phá các nguyên tắc chống viêm của sợi nấm Cordyceps

sinensis, chiết xuất thô và các phân đoạn đã được tinh chế một phin đã được

kiểm tra về khả năng ức chế tao anion superoxide và giải phóng elastase Điều

tra hóa học sâu hơn về các phân đoạn hoạt tính sinh học đã dẫn đến việc xác

định 50 hợp chat, bao gồm năm thành phần, cordysinins A - E (1 - 5), lâutiên được báo cáo từ một nguồn tự nhiên Ngoài ra, các hợp chất đã được

kiếm tra hoạt động chống viêm của chúng

1-(5-Hydroxymethyl-2-furyl-B-carboline tie chế đáng kẻ nhất sự tạo anion superoxide và giải phóng elastasevới giá trị IC 50 tương ứng là 0,45 + 0,15 và 1,68 + 0,32 uM (Yang, Mei Lin etal, 2011),

Có tác dụng bảo vệ thin kinh trong thiếu máu não cục bộ, đó là do ứcchế viêm và tăng hoạt động của chất chống oxy hóa liên quan đến bệnh sinh

thương Cordycepin cũng là một ứng cử viên tiềm năng trong điều trị các

bệnh tim liên quan như nhdi máu cơ tim, thiếu máu cơ tim

Bên cạnh đó, cordycepin cho thấy tác dụng giảm đau rõ ràng Nhiềunghiên cứu cho rằng cordycepin là một loại thuốc chống viêm và giảm đau

mạnh Có một số nghiên cứu chứng minh rằng C sinensis kích thích sự hình

thành steroid và kích hoạt quá trình apoptosis ở các té bào Ngoải ra,cordycepin kích thích giải phóng một số cytokine, Do đó, cordycepin có thể

điều chỉnh mạnh mẽ các chức năng của tế bảo miễn +h của con người Bêncạnh đó, cordycepin là một hợp chất diệt khuẩn phổ rộng không chỉ có hoạttính kháng u ma còn có hoạt tính kháng khuẩn, chống vi rút và diệt côn trùng.

1.1.6.2 Hoạt chất Adenosine

Công thức hóa học: C,oHi:N:O,,

- Khối lượng phân tử: 267,2413 g/mol.

“ấu trúc phân tử của Adenosine.

Ho:

OH OH Adenosine

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Adenosine

¥ Công dụng của Adenosine đối với sức k

LA nucleoside nội sinh tồn tại trong các tế bao của cơ thể, TẾ bảo nào

trong cơ thé cũng chứa hợp chất hóa học này Cấu trúc hóa học của adenosine

là 6-amino-9-beta-D-ribofuranosyl-9-H-purine Đây là hợp chất trực tiếp tham

gia vào quá trình cầu tạo lên DNA, ATP, đồng thời tạo nên các hoạt chất khác

như Cordycepin, D-manitol - dược liệu quý trong y học Các lợi ích củaadenosine có thể kế đến như dưới đây

Nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc về hoạt tính của thụ thể

adenosine cho thấy, chất cordycepin kích hoạt thụ thể adenosine

(3-deoxyadenosine) va sản phẩm đông trùng hạ thảo giúp bảo vệ não, hỗ trợ điều

trị Covid-19 Adenosine, một chất trung gian trong quá trình sinh miễn dich,

mô phổi bị thương trong quấ trình vi việc kích hoạt các thụ thé adenosine AI, A2A, A2B và A3, adenosine đồngvai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại chắn thương phôi cấp tính và

‘Thong qua

chan throng não Cordycepin (3'-deoxyadenosine) là một chất kích hoạt các

thụ thé adenosine, giúp tăng khả năng miễn địch, thúc diy quá trình khángviêm, ức chế sự sinh sản của virus RNA, bảo vệ chống lại tổn thương não,phéi, gan, tim và thận, cải thiện tình trạng xơ hóa phổi ở các mô hình lâmsảng và động vật Đông trùng hạ thảo và các sản phẩm cordycepin có thểđược sử dụng như một chat chủ vận thụ thể adenosine trong y học có thé đóng

một vai trồ có lợi trong việc cải thiện bệnh viêm phối do SARS-CoV-2 (Du,

Jing etal, 2021).

Đối với bệnh tim mạch Theo các nghiên cứu, adenosine là hoạt chấtđem lại hiệu qua đặc biệt với hệ tim mạch Dược chất này có tác dungtruyền thần kinh, thúc đây quá trình trao đổi chất và năng lượng trong cơ thể.Các lợi ích sức khỏe của adenosine có thể ké đến như:

+ Giãn mạch, tăng tuần hoàn;

+ Điểu tiết, giải phông các hoạt chất dẫn truyền thần kinh;

+ Cải thiện chức năng hệ thin kinh ngoại biên, chức năng tim machcũng như điều chỉnh rồi loạn nhịp tim;

+ Tăng lượng oxy trong máu, từ đó tác động và điều chỉnh hoạt động của hệ tìm mạch;

+ Duy trì hiệu quả hoạt động của mạch máu, ức chế việc ngưng kết cấu

tiêu cầu, cải thiện hoạt động tuần hoàn trong cơ thể

ic bệnh về tim mach, đặc biệt là nhồi máu cơ tim, tie

+ Ngăn ngừa

nghẽn mạch máu.

Đối với da Không chi dem lại hiệu qua đối với tim va hệ hoàn,adenosine còn giúp kim đẹp da, bảo vệ da trước các tác động xấu của môitrường Cụ thể như dưới đây:

+ Chống kích ứng và kháng vid : adenosine có hiệu quả đặc biệt trongviệc điều chỉnh, đảm bảo hoạt động của các tế bào da, ngăn chan nguy cơ rồiloạn chức năng của các tế bảo da hiệu quả Đối với các tế bảo bị viêm, nhiễmthì adenosine lập tức phát hiện và xử lý kịp thời;

+ Lam sáng da: Adenosine thúc day quá tình tái tao các tế bảo mới, loại

bỏ các tế bảo chứa hắc tố melanin, Nhờ vậy mà làn đa luôn căng bóng mịn.màng, không gặp các vấn đề thư nám, sam da, lẫn nhang Cũng chính vì vậy mi adenosine luôn có mặt trong thành phần của những loại mỹ phẩm

dưỡng da cao cấp,

Chống lão hóa: Bên cạnh những lợi ích kể trên, adenosine cũng giúp

ngăn ngừa lão hóa, chống lại tinh trạng da nhăn nheo chảy xệ, từ đó gin giữ

nét xuân cho lần da của chị em.

1.2 Các nghiên cứu về đông trùng hạ thảo

1.2.1 Trên thể giới

Gần đây nhất nghiên cứu các hoạt động ức chế tiềm năng củaCordycepin tương tự Adenosine trong quá trình tái tạo SARS-CoV-2 thực hiện bởi Amgad Rabie’s và cộng sự năm 2022.

"Nhóm tác giả Nauhapong Singpoonga và cộng sự đã nghiên cứu xác địnhnồng độ Adetiosine va Cordycepin trong cơ thể quả của Cordyceps militarisbằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gin đăng trên ACS Omega 2020

"Nghiên cứu Cerebrosides chống viêm từ Cordyceps militaris được nuôitrồng được thục hiện bởi Ching Peng Chiu và cộng sự nấm 2016

Nghiên cứu về nguyên tắc chống viêm từ Cordyceps sinensis do tác giảMei Lin Yang và cộng sự thực hiện năm 2011

Tác dụng chống ung thư và chống di căn của cordycepin, một thành.

phin tích cực của Cordyceps sinensis được nghiên cứu bởi tác gid K

Nakamura, K Shinozuka, Yoshikawa - Tap chí được lý , 2015.

Nghiên cứu tăng cường ham lượng Cordycepin nhờ nuôi cấy trên côn trùng ăn được Cordycepin thành —phần chính củanắm Cordyceps (hoặc Cordyceps militaris) có tiềm năng chữa bệnh Côntrùng là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng trực tiếp cho Đóng Trùng Ha

Théo trong tự nhiên Do đó, điều kiện canh tác Đống trừng ha tháo được tối

uu hóa để sản xuất cordycepin hiệu quả đã được khám phá bằng cách sử dụngsáu loại côn trùng ăn được làm cơ chất Sản lượng cordycepin cao nhất được.tạo ra khi nuôi cấy trên Affomyrina dichotoma và gấp 34 lần so với trênnhộng Bombyx mori Trong số các thành phan của côn trùng, ham lượng chatbéo được phát hiện là rất quan trọng dé sản xuất cordycepin Đặc biệt, một mối.tương quan tích cực đã được rút ra giữa hàm lượng axit oleic và sản xuấtcordycepin Các mức độ phiên mã của cnsÏ và cns2, các gen liên quan đến sinhtổng hợp cordycepin, cao hơn ở Déng (ràng ha thảo được trồng ten A dichotoma so với các loài côn tràng khác được thir nghiệm Việc bổ sung axit oleic vào cơ chất làm tăng sản xuất cordycepin cùng với mức độ phiên mã của ens! và ens2 Do đồ, Đông trùng hạ thảo với hàm lượng cao cordycepin cóthé được đảm bảo bằng cách nuôi cấy trên côn trùng (Turk, Ayman et al 2(1.2.2, Tại Việt Nam

Các báo cáo khoa học về Cordyceps tại Việt Nam còn rit ít và còn khá

122),

so khai so với khối lượng nghiên cứu dé sộ trên thé giới

ˆNghiên cứu về các đặc điểm sinh học của hệ sợi nắm C miliaris trong các môi trường nuôi cấy cơ bản được thực hiện bởi Phạm Quang Thu và ctv, (2012).

Nhóm tác giả Trương Bình Nguyên, Dinh Minh Hiệp, Lê Huyền ÁiThúy va ctv, (2010) tập trung vào các nghiên cứu phát hiện các chủng nấmCordyceps bản địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và khảo sát một

số hoạt tính sinh học của các loài nắm nay.

Nam 2012 - 2014, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học - môi trường,

trường ĐH Nông Lâm thực hiện đề ề yy dựng quy trìnhnuôi cấy đông trùng hạ thảo quy mô phòng thí nghiệm

Nam 2013, nhóm nghiên cứu của Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học

và mô Thi Diệu Trang, trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM ( Phước Thọ, Trần Công Sơn và Nguyễn Thị Ngọc Anh) báo cáo công trìnhnghiên cứu "Sản xuất đông trùng hạ thảo Cordyceps sp: quy mô phòng thínghiệm” trong cuộc thi Eureka 2013 của Thành Đoàn TP.HCM.

Nhóm tác giả Lê Thị Diệu Trang, Trần Công Sơn, Lê Phước Thọ,Nguyễn Thị Ngọc Anh (2013) đã công bố các kết quả xây dựng quy trình

nuôi cấy C sinensis, đánh giá tính EhánÀ oxy hóa Ye hàm lượng adenosin tiên

tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp của Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

Gan đây, trong Hội nghị nắm học \ỗ chức tại Trung tâm Công nghệxinh học TP.HCM (11/2014), một số công trình của các nhóm tác giả VũXuân Tạo và ctv, Phạm Nguyễn Duy Bình và Phan Kim Ngọc đã công bố kết

quả nghiên cứu về các yếu môi trường tác động đến sự sinh trưởng của €.militaris; Võ Thị Xuyén và ctv nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy C.psetedomiliiaris

Nuôi quả nắm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris đã được

trang trai lớn chuyên nuôi trồng loài nắm nảy ở

Chỉ các tình: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang T

tính một trang trại nuôi trồng loài nim nay tại Kaiping, Quảng Châu, sảnlượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nắm Nhộng trùngthao từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể ca các.nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người môi trồng nắm,

Nuôi cấy nắm trên môi trường rắn được biết đến từ nhiều năm qua So.

sánh với các phương pháp nuôi cấy khác thì phương pháp này có một

điểm như: mô hình nhỏ hơn, mức độ tiêu thy nước ít, lượng nước thải ra ít vàtiêu thụ năng lượng thấp Trong một vài năm gần đây, phương pháp nuôi cấytrên môi trường rắn đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xui enzyme (Fenice et al., 2003; Marques de Souza et al, 2002), sản xuất nhiên liệu và sản xuất thực phẩm chức năng (Aguilar et al., 2008; Vintila et al., 2009) Trong tự nhiên, C militaris sinh trưởng trên xác côn trùng bằng cáchphân hủy cơ thể côn trùng dưới các điều kiện ngoài tự nhiên

Do đó, phương pháp nuôi cấy trên môi trường rắn đã có thể được tối ưu

hóa quá trình phát triển của C militaris đưới các điều kiện như: cho phép hệ

sợi phát triển trên bề mặt môi trường rắn, tôi ưu hóa dòng khí và các điều kiện

i h thành quả thé Hon nữa từ những nghiên cứu trước đã chứng minh

rằng quả thé có chứa rất nhiều các hoạt chat sinh học hơn trong hệ sợi (Sung

et al., 2006; Yang et al., 2003; Zhang et al., 2008) Do đó, nuôi cấy trên môitrường rắn đã nổi lên như một công nghệ nuôi cấy đầy triển vọng trong sản

xuất quả thể từ C militaris Trong 20 năm trước, các nhà nghiên cứu đã có thể

nuôi cấy nắm trên môi trường rắn Việc sản xuất quả thé trong phòng thínghiệm của nắm C militaris cũng đã được nghiên cứu thành công trên môitrường gạo lút (Choi et al, 1999; Sung et al., 2002) Một vai nha nghiên cứukhác cũng đã thành công trong việc nuôi trồng quả thé C militaris trên nhộng

ato & Shimazu, 2002) Tuy nhiên, khi nuôi

thể trên môi trường rắn cũng gặp một số van dé khi mở rộng ở quy mô lớncũng như Việc tích chiết các hợp chất sinh học từ quả thể của C militaris1.4 Các kỹ thuật nuôi trồng nắm Đông trùng hạ thio

1.4.1 Nuôi trong môi trường long

'Việc sản xuất các chất chuyển hóa có giá trị trong nuôi cấy C militaristrên môi trường lòng đã được nghiên cứu rộng rài trong 20 năm trước (Hsich etal, 2007, Kim et al, 2002b, Park et al, 2004) Nuôi cấy trên môi trường lỏng

lông và được thông khí, khi

với lên men chim thi C militaris được nuôi cấy trong môi trường

trong nồi lên men Đối với lên men bề mặt thì

C Militaris được nuôi cấy trên các bình tam giác 500 ml (chứa 100 ml môi

h 500 ml) ở 25°C,

trường trong bình có th

1.4.2 Nuôi trên môi trường rin tổng hop

Thanh phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy quả thé của C militaristrên môi trường rắn cũng đã được nghiên cứu và tối ưu hóa (Wei et al., 2008).Dưới các điều kiện tối ưu hôa, hàm lượng cordycepin trong môi trường đãtăng gấp đôi so với các điều kiện ban đầu Chen et al (2011) đã điều tra tácđộng của ánh sáng và kim loại nặng lên s h trưởng và phát triển của C

militaris trên môi trường gạo Kết qua đ cho thấy rằng các loại gạo khácnhau cũng cho những kết quả vé sinh trưởng của qua thể nắm khác nhau Cáchoạt chất sinh học và qua thể nấm dat tốt nhất thu được khi nuôi cay trên môitrường gạo I (bao gồm rất ít kim loại nặng) với chu kì ch sing 12hsáng/tối Các kim loại nặng (Pb, Hg và Cd) đã được ghi nhận có ý nghĩa ứcchế sự phát triển của quả thể

1.4.3 Nuôi trong trên ký chủ nhộng tim

Theo Nguyễn Thị Minh Hằng và Bùi Văn Thắng (2017), với phươngpháp cấy giống C militaris vào thân nhộng và phun dịch nắm vào nhộng Tamnuôi cấy trong điều kiện 22°C và duy trì độ âm 85% sau 30 - 40 ngày nuôi hệ

wu 40 - 44 ngày qua thé bat đầu mọc mam trên thân

soi nắm mọc kin thân và s

nhộng Tim Theo kết quả nghiên cứu này, với phương pháp cấy giống vào

đỉnh đầu của nhộng cho thời gian nắm C militaris tin công vào vật chủ nhanh

hơn so với việc cấy nắm vào thân nhộng hay phun nắm toàn thân nhộng,

1.5 Nghiên cứu nuôi trồng tăng hoạt chất Cordycepin và Adenosine

Môi trường là yếu tố rit quan trọng quyết định sản lượng của sản phẩm

thu được Nguồn Cacbon, Nito, các ion kim loại và các chu lên men cũng

có mỗi liên quan trực ếp tới sự phát triển của tế bao và các quá trình sinhtổng hợp trao đổi chất Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sinh trưởng của tế

bảo va sản xuất cordycepin từ C militaris bằng phương pháp lên men chìm đã

được nghiên cứu (Mao, Xian Bing et al., 2006), Kết quả chi ra rằng peptone lànguồn nitơ tốt nhất cho sinh tổng hợp cordycepin trong phức hợp môi trường.Ngược lại, NH4 + đồng một vai trỏ quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp.cordycepin Hàm lượng Cordycepin tăng lên đáng kể khi môi trường nuôi cấy.được bổ sung NH4 + Ngoài ra Mao et al (Mao, Xian - Bing et al., 2005) đãphát hiện ra rằng nguồn cacbon, tỷ lệ cacbohinit cũng có ảnh hưởng đến việctạo ra cordycepin trong suốt quá trình nuôi cấy C militaris bằng phương pháp.lên men chìm Gần đây, nhóm nghiên cứu này cũng đã cho thấy ảnh hưởng củaviệc bé sung ferrous sulfat vào sản xuất cordycepin trong quá trình nuôi cấy C.militaris bằng phương pháp lên men chìm Kết quả của họ cho thấy sản phẩm.tạo ra khi sản xuất cordycepin bằng phương pháp lên men chìm có bổ sung sắtsulfat cao hơn khi không bô sung sắt sulfat (Fan, Dan - dan et al., 2012),

Là loài côn trùng biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn phátdục khác nhau: trứng, tim, nh6ng, ngài Mỗi giai đoạn phát dục đều có mộtvai tò quan trọng trong đời s 1g con tim,

«Giai đoạn tim: Là giai đoạn an lá dâu để tích Tuy dinh dưỡng, co thể

tim trong giai đoạn này lớn lên rất nhanh, tim sắp chín (đủ dinh dưỡng) lớn.gấp 8.000 - 10.000 lần so với tim mới nở,

~ Giai đoạn nhộng: Khi đạt đến kích thước eye đại vĩ ăn đủ lượng dinh

dưỡng từ lá dâu, chúng ngừng ăn và bắt đầu tạo kén và lột xác hóa nhộng

«Giai đoạn ngài (bướm): Là giai đoạn trong thành con đực và con cái tìm nhau để giao phối và ngà cái để trứng

đoạn trứng: Trứng tằm sau khi con cái đẻ trứng 8 - 10 ngày, ở

25°C trứng sẽ nở (hành tim con.

Con ti (Bombyx mori) là một loài côn trùng được nuôi trồng với quy

mô lớn Tim và các sản phẩm chuyển hóa của nó có giá trị dinh dưỡng, dược

liệu và kinh tế cao (Ratcliffe eL al., 2011; Yang et al., 2009) Vòng đời củatim bao gồm bốn giai đoạn phát triển riêng biệt: trứng, ấu trùng, nhộng vaimago Tơ thu được từ kén khi tim biến đổi từ ấu trùng sang nhộng (Wu, Xuli

et, 2021).

Nhộng tằm cũng chứa một số chất kháng dinh dưỡng khi chúng ăn ládâu tim Những chất phản dinh dưỡng này bao gồm phytate (72,89 - 110,16mg/g) và phytin phốt pho (20,54 - 31,03 mg/g), cũng như axit tannic, alkaloid,flavonoid, saponin và oxalate Tuy nhiên, những chất phản dinh dưỡng nàyhiện điện ở mức thấp và im trong mức chịu đựng của con người Do đó,nhộng tam an toản cho con người (Omotoso, 2015) Nhìn chung, nhộng tim

là nguồn cung cap protein, lipid, khoáng chất và vitamin dồi dao, tat cả đều là.những thành phần quan trọng trong chế độ ăn uống của con người (Wu, Xuli

ct, 2021).

im thầu dầu, lá sắn Attacus rieini

Hình 1.6 Tam lá sắn và nhộng sắn

Là loài biển thái hoàn toàn, Attacus zicini trai qua 4 giai đoạn trứng, ấutrùng (sâu), nhộng và bướm Tuy nhiên, trong giai đoạn trứng không cin thờigian giá lạnh như tằm dâu nên một năm có thể hình thành nhiễu (3 - 4) thé hệ.Thời gian của ấu tring (sâu non) kéo dai khoảng 20 - 22 ngày trải qua $ tuổi

và bốn lần ngủ, có kích thước lớn hơn tằm dâu 3 - 4 lần Thức ăn của chúng là

, sản là những loài thực vật có rất sẵn ở mọi

á của các loài thuộc họ thầu

vùng ở nước ta,

Chương 2MỤC TIEU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu chung

XXây dựng được quy trình kỹ thuật nuôi trồng nắm Dong trùng hạ thio(C militaris) trên ký chủ tằm dâu sống và đánh giá được năng suất, hamlượng hoạt chất cordycepin và adenosine ở các giai đoạn sinh trưởng, phát

triển qua thé nắm trên các loại ký chủ (nhéng, tim dâu và nhộng sắn),

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1; Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm

Đông trùng hạ thao (C militaris) trên ký chủ tằm dâu sống

= Nghiên cứu xác định vị trí lây nhiễm nắm C militaris vào cơ thé tim

2.4, Vật liệu, hóa chất, dung cu và máy móc nghiên cứu.

2.4.1 Vật liệu

- Giống cấp | chủng nắm Cordyceps militaris NBRC9787 có nguồn gốc:tir Trung tâm tdi Nguyên sinh học NITE (NBRC), Nhật Bản, được cung cắp bởi Công ty CP Dược liệu Hataco Việt Nam:

- Kén nhộng, tim dâu được cung cấp bởï các cơ sở sản xuất nhộng tim dâu tỉnh Nam Định

-Kén nhộng sắn được cung cấp bởi các cơ 86 sản Xuất nhộng tằm sắn

tỉnh Phú Thọ,

2.4.2 Hóa chất

-Hóa chất phục vụ nuôi cấy nấm: Các loại mudi khoáng đa lượng

KH,PO,, M:

chiết khoai tây, đường glucose

SO,, Các chất hữu cơ Pepton, Cao nắm men; Vitamin BI, dịch

~ Hóa chất phục vụ phân tích: Nước cất đề ion, methanol (CH;0H), chất

chuẩn Adenosine (C¡H,;Ñ-O,), Chất chuan Cordycepine (C¡oH,;N;O;)

2.4.3, Dụng cụ và máy móc

Sử dụng máy móc, trang thiết bị tại Phòng thí nghiệm muôi trồng nắmĐTHT: phòng điều hòa, hệ thống giản nuôi cấy gắn đèn led điều khiển được.cường độ ánh sáng và thời giản chiếu sáng: Box cấy vi sinh vật, Nồi khử

trùng môi trường, máy lắc, tủ nuôi tối, máy đo độ âm không khí, máy tạo âm,

máy đo cường độ ánh sáng, máy đo nhiệt độ, cân điện tử, máy siêu

nhỉ máy ly tâm, máy phân tích HPLC, v.v

2.5 Địa điểm nghiên cứu

~ Các thí nghiệm nuôi trồng được thực hiện tại Phòng thí nghiệm củaCông ty Cô phn dược liệu Hataco Việt Nam, địa chỉ K12, trường Đại họcLam nghiệp, thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, Thanh phổ Ha Nội

- Các thí nghiệm phân tích hoạt chất được thực hiện tại Viện Công

nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, thị trin Xuân Mai,

Huyện Chương Mỹ, Thành phổ Ha Nội

‘Thu hoạch qua thể

2.6.1 Phương pháp tạo dung dich giống sản xuất (giỗng cắp 2)

‘Chuan bị nguyên liệu và pha môi trường theo công thức (Glucose 20g;

Vitamin BI- 0,3g; Peptone- 10g; Cao nam men - 10g; Dịch chiết (Khoai

tây-150g; giá đỗ - 150g) Môi trường sau khi pha xong được chia vào các bình

thủy tỉnh có nút bông (thể tích môi trường 300 ml) và hắp khử trùng ở nhiệt

độ 121°C trong thời gian 30 phút Khí môi trường nguội, dùng que cấy lấy

giống cấp 1 cho vào bình môi trường lỏng và nuôi lắc 150 vip ở điều kiện

nhiệt độ phòng 22°C, độ âm 60% Sau 7 ngày hệ sợi phát triển dày đặc trong

môi trưởng lỏng thì được sử dụng dé làm dung dich giống gây nhiễm cho các

ký chủ vật nuôi cấy.

Hình A Hình BHình 2.1 A - Giống thạch DTHT, giống cấp 1; B - giống sinh khối dich

Jong DTHT, giống cấp 2

2.6.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trong nam Đông tràng hạ thảo (C

‘militaris) trên ký chủ tim đâu song

2.6.2.1 Phương pháp xác định vị tri lay nhiễm nắm C militaris vào cơ thể

tầm dâu sing

“Chọn tim dâu sống trưởng thành (tim giai đoạn chin, thân màu vàng)chuẩn bị đóng kén, khỏe mạnh làm vật liệu thí nghiệm Đặt tim dâu sống vào.khay inox, dùng xi lanh Iml có vạch chia, hút 100 yal dung dich giống tiêm

lẫn lượt tiêm vào phần đầu, thân, đuôi và phần miệng Sau khi mm xong đặttầm dâu sống vào các hộp nhựa kích thước 12 x 24 cm có lót thắm phía

đưới: nuôi trong phòng tối hoàn toàn 6 ngày với điều kiện 20°C, độ âm 60%

Chi tiêu đánh giá: Đánh giá tỷ lệ tim nhiễm nắm thành công (con tim

cứng hoàn toàn, có hệ sợi nắm ăn lan hết cơ thé); ty lệ tim hỏng (tim bị nhữn,

có mùi hôi thối).

có lót giấy thắm phía dưới; nuôi trong phòng tối hoàn toàn 6 ngày với điều

kiện 20°C, độ fim 60%

Chi tiêu đánh giá: Đánh giá tỷ lệ tằm nhiễm nắm thành công; ty lệ tằm hỏng.2.6.2.3 Phương pháp xác định thời gian nuối tdi thích hợp đến khả năng batmdm và phat triển quả thé khi nudi sáng