Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học: Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Amptothecin trên cây Mẫu đơn (Ixora Chinensis) thu tại Bắc Giang, Việt Nam

CONG HOA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMĐộc lập - Tự do - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Để tài nghiên cứu của tôi về “Phân lập và sàng lọc các chủng vi nắmnội sinh có khả năng sinh tong hợp Camptothe

BỘ GIÁO DỤC VA ĐẢO TAO BỘ NÔNG NGHIỆP VA PTNT

‘TRUONG ĐẠI HỌC LAM NGHIỆP

PHẠM THỊ HÀNG

PHAN LAP VÀ SANG LOC CÁC CHUNG VI NÁM.

NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG SINH TONG HỢP AMPTOTHECIN

‘TREN CÂY MAU DON XØRA CHINENSIS) THU

TẠI BÁC GIANG, VIET NAM

'CHUYÊN NGANH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC:

MÃ NGÀNH: 8420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.TS TRAN MINH BUC

2 TS NGUYEN NHƯ NGQC

Hà Nội, 20; 3

CONG HOA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Để tài nghiên cứu của tôi về “Phân lập và sàng lọc các chủng vi nắmnội sinh có khả năng sinh tong hợp Camptothecin trên cây Mẫu Đơn (Ixorachinensis) thu tại Bắc Giang” Đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi dưới sự.hướng dẫn khoa học của TS Trần Minh Đức và TS Nguyễn Như Ngọc Các

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố.trong bat kì công trình nào khác Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp

với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bổ, tôi xin hoàn toàn chịu trách

nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học

Ha Nội, ngày thắng nấm 2023

Người cam đoan

Pham Thị Hing

LỜI CẢM ƠN

Để tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Gene - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh.

đạo Viện đã tạo điều kiện được tiế

hành thuận lợi Bên cạnh đó

trong để tải “Nghiên cứu sản xuất hợp chất Camptothecin hoặc các chất

khác có hoạt tính digt té bào ung thư ở quy mô phòng thí nghiệm tir hệ vi nắm nội sinh trên một số loài thực vật phân bổ tại Việt Nam”, mã s

TDCNSH.03/20-22 giúp tôi đạt được những kết quả trong luận văn này,

Khi thực hiện để tai, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ nhiệt

tình cia các thầy cô, bạn bẻ và đố TEMlệp So ằng hộ về mặt tinh thần vànhững chỉ dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô cùng quý báu này khiến

tôi thực sự cảm kích, biết ơn:

chuyên môn của đề

tôi xin chân thành được cảm ơn các thành viên

Dac biệt, tôi xin bày tổ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Tran Minh Đức và

TS Nguyễn Như Ngọc, ñgười thay đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trìnhhoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý chỉ dẫn, chia sé

kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gene - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

c 1g nghé Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại

học Lâm nghiệp đã giúp đỡ tôi rat nhiều trong quá trình thực hiện dé tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảngday tại Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá

1.1 Tổng quan về hợp chất Camptothecin

1.1.1 Camptothecin

1.1.2 Cơ chế tác dụng của Camptothecin

1.1.3 Quá trình tổng hợp và bán tổng hop Topotecan và lrinotecan.

và phan bỗ của các loài thực vật có chứa Camptothecin

1.3.2 Các nguén vi nắm nội sinh có khả năng sản sinh Camptothecin 10

14, Lên Me s.vs co6ss s 55s csssecseceraree 12

1.4.1 Téng quan VÖÌẾn men J2

1.4.2, Cúc nghiền cứu lên men sinh téng hợp Camplothecin 12

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.NGHIÊN CỨU 16

2.1 Mục tiêu chưng : : "

2.2 Mục tiêu cụ thé 16 2.3 Nội dung nghiên cứ _- _- l6 2.4 Vật liệu nghiên cứu 16

2.4.1 Đối tượng nghiên cứu " ' 163.4.2 Hóa chất, trang thiết bị trong nghiền cứu 7

2.5 Phương pháp nghiên cứu he 18

2.5.1 Định danh cây Mẫu đơn h 182.5.2 Phân lập các chúng vi nắm nội sinh trên cây Mẫu đơn 2025.3 Sang lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp

3.3.1 Tách chiết và định tinh Camptothecin từ chủng vi nắm nội sinh 44

3.3.2 Kết quả phân tích và định lượng Camptothecin bằng sắc ky

hiệu năng cao (HPLC).

4 Kết quả định danh chủng vi nắm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp

Camptothcein 49

3.5, Kết quả lên men thu hồi Camptothecin từ chủng vi nắm nội sinh quy

mô phòng thí nghiệm : : _.

KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ „63TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHU LUC

DANH MỤC TỪ VIE" T

‘Tar viết tắt Nghia của từ viết tắt

DNA _ | Deoxyribonucleic acid

CPT | Camptothecin ==—

DCM _ jDiehloromethane

upc | Sie lông Mu nông co (High perfomance Hg

TTS | Internal transcribed spacer

MeOH | Metanol

NCBI | National Center for Biotechnology Information

MS | Khối phd (Mass spectrometry)

NMR | Cộng hướng tir hat nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

TLC | Sắc ky lớp mỏng (Thin layer chromatography)

PCR _| Polymerase chain reaction

PDA _| Potato dextrose agar

TLC | Sic ky lépméng

DANH MỤC CÁC BANGBang 2.1 Danh sách cặp mỗi cho phản ứng PCR ses 18Bang 2.2 Thành phần phản ứng PCR thực vat » 19Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR môi ITS _ 19Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mỗi rpoCl „x20Bang 2.5 Diện tích đỉnh chất chuẩn CPT với néng độ khác nhau 2Bảng 2.6, Thành phần phan ứng PCR gen ITS 26

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR môi ITS 26

Bảng 3.1 Kết quả do quang phổ sản phẩm DNA tổng số của Mẫu đơn 31Bảng 3.2 Kết quá đo quang phổ sản phẩm PCR sau khi tinh sạch 3Bảng 3.3 Ký hiệu các bộ phận được phân lập và kết quả phân lập 36Bang 3.4 Hình thái các chúng nam phân lập từ cây Mẫu đơn 38,

Bảng 3.5, Kết quả phát hiện CPT bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng TLC 44

Bang 3.6 Kết quả đo quang phổ DNA tổng số của mẫu nấm I3R2

Bảng 3.7 Kết qua đo quang phổ sin phẩm PCR sau tỉnh sạch mẫu nắm I3R2 52Bang 3.8 Mức độ tương đồng đoạn gen ITSI-5,8S-ITS2 của mẫu nắm nộisinh I3R2 với trình tự mau gen

lên Ngân hàng sử liệu gen NCBI 5ã

Bang 3.10 Độ dịch chuyển hóa học của chat chuẩn CPT và mẫu Mã 60

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1 Clu trúc phân tử của CPT và dạng hydroxyacid vòng mở [27]

Hình 1.2 Cơ chế gây độc tế bào của CPT [11]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của topotecan và irinotecan [47]

Hình 1.4 Q\ á tình bái tổng hợp Topotecan [25] Đổ Re

Hình 1.5 Quá tinh bán tổng hợp Irinotecan [25]

Hình 2.1 Quy trình lên men thu hồi CPT từ chủng vi nắm nội sinh ở quy mô

phòng thí nghiện 29

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số mẫu cây Mẫu đơn „530Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS 31Hình 3.3 Kết qua điện di sản phẩm PCR đoạn gen rpoCL 32Hình 3.4 Một đoạn trình tự gen ITS của cây Mẫu don soe 33Hình 3.5 Một đoạn trình tự gen tpoCl của cây Mẫu don, 33Hình 3.6 Cây phân loại của cây Mẫu đơn dựa trên trình tự ITS 34

Hình 3.7 Cây phân loại của cây Mẫu đơn dựa trên trình tự rpoC1 -35

Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng của 22 mẫu dưới bước sóng 366 nm 46Hình 3.9 Phổ HPLC của mẫu I3R2L _ son

Hình 3.10 Ph6 MS của chất chuẩn CPT _- seo.

Hình 3.11 Pho MS của mẫu BR2L : 48Hình 3.12, Ảnh điện di DNA tổng số của mẫu nắm I3R2 50Hình 3.13 Kết qua kiểm tra điện di sản phẩm PCR mẫu nam I3R2 51Hình 3.14, Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR gen ITS sau tinh sạch của

mẫu năm I3R2 — — cu soe ST

Hình 3.15 Cay phân loại mẫu nắm 13R2 5Hình 3.16 Kết quả định tinh TLC của mẫu ISR2 lên men 70 lí: 57

Hình 3.17 Phổ MS của chất chuẩn CPT 58

Hình 3.18 Phổ MS của mẫu I3R2 lên men 70 lít quy mô phòng thí nghiệm 58

Hình 3.19 Bản mỏng điều chi 59

Hình 3.21 Phổ 13C NMR của r 61

NDEUng thư hiện nay dang là căn bệnh có mức độ tử vong cao với tốc độphát triển nhanh Theo số liệu thông kê của Tổ chức Nghiên Cứu Ưng Thư.Quốc TẾ năm 2020, tinh hình mắc và tử vong do ung thư trên toàn thé giớiđang có xu hướng tăng Tại Việt Nam, ước tính có 182.563 ca mắc mới và

122.690 ca tử vong do ung thư Cứ 100,000 người thì có 159 người chin đoán

mắc mới ung thư và 106 người tử vong do ung thư [1] Việc tìm ra một nguồncung cấp thuốc phòng chống ung thư én định với giá thành thấp là điều hếtsức cần thiết Camptothecin (CPT) là thành phan chính dé sản xuất hai loại

thuốc điều trị ung thư topotecan (Hycamtin) và ifinotecan (Camptosar) [46].

Hiện nay, nguồn cung cấp chủ yÊẾ TẾ CPT lạ Ñỏ và lá non của cây Hy thy(Camptotheca acuminate) và một số loài thực vật khác, trong đó có cây Mẫu

don [35] Theo các báo. io, chiết xuất từ hoa của cây Mẫu đơn (Lxora chinensis)

đã được thử nghiệm là ức chế hoàn toàn tắt cả các loại khối u [49] Ngoài rasur phát triển của cây thân gỗ rất chậm và phương pháp chiết xuất CPT truyềnthống từ thực vật không hiệu quả và tốn kém Do đó chỉ có CPT có nại

từ thực vật là khó đáp ứng nhu cầu ngày cảng ting của toàn cầu Vậy, vi

ra nguồn CPT cùng các dẫn xuất thay thế cho việc chiết xuất trực tiếp từ các.loài thực vật lẾ rắt quan trọ

Hiện nay, các nhà khoa học đang chuyển sang một hướng tiếp cận mớihiệu quả trong việc số Xuất CPT là lên men vi nắm nội sinh Các chất chuyểnhóa thứ cấp có tiểm năng điều trị bệnh ung thư như các chất chống oxy hóa và

diệt vi tring bao gồm: CPT, citrinal B, taxol đã được phân lập tir vi nấm nội sinh [26].

Loài đơn cũng như là vỉ nắm nội sinh trên cây Mẫu đơn là nguồnsản xuất CPT tiềm năng Hiện may, việc tổng hợp CPT từ các chủng vi nắm

nội sinh trên các cây được liệu ở Việt Nam đã và đang được các nhà khoa học.

quan tâm Điều này giúp phát triển các sản phẩm ứng dụng trong điều trị bệnhung thư một cách bền vững, bảo vệ sự đa dang tài nguyên thực vật cũng như.

vi sinh vật của Việt Nam.

xi phát từ cơ sở khoa học thực ti trên, tôi tiến hành để tài

“Phan lập và sàng lọc các chủng vi nắm nội sinh có khả năng xinh ting

hợp Camptothecin trên cây ñ đơn (Ixora chinensis) thu tại Bắc Giang”

hợp phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và tia X-ray [27] CPT ức chế hoàn

toàn sự tăng trưởng và tái phát ung thư ở một số bệnh ung thư như dai trang,

pl

ra, CPT cũ

thư đường tiêu hóa [32].

i, vú, da đầy, buồng trúng và khối tác tinh ở đô hình chuột [16}, Ngoài

1g cho thấy hoạt tính kháng khối u mạnh trong các bệnh nhân ung

1.2) Trong mô hình này, CPT giúp én định phức hợp DNA-Topo I thông,

thường thông qua các liên kết hydro, dẫn đến quá tình tổng hợp DNA bị ứcchế hoàn toàn [23] Sự tương tác của phức hợp trên làm ngăn cản sự phân

tích của Topo I và các sợi DNA, dẫn đến các sợi DNA đã được tháo xoắn.không có khả năng xoắn trở lại, hình thành chuỗi DNA mạch đôi bi đứt gay.

“Một hoặc nhiễu điểm đứt gay làm kích hoạt các phản ứng nội bào khác dẫnđến việc bắt giữ chu ky tế bào trong pha G2 va làm chết tế bào [7, 8, 55]

B = Ũ- ĐT

Hình 1.2 Cơ chế gây độc tế bào của CPT [11]

‘Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi CPT trong trị liệu bị cản trở bởi khả

‘nang hòa tan thấp trong nước và nhanh bị mắt hoạt tính do bị thủy phân vònglactone ở ngay trong điều kiện pH sinh lý, cũng như độc tính đáng kể Muốinatri của CPT đã được đề xuất là dạng thuốc dễ hòa tan hơn Rất nhiều các.chất có cấu trúc tương tự CPT đã được phát triển thông qua việc thay đổi cấutrúc của CPT với mục đích tăng tính tan của CPT và sự ổn định của vònglactone nhằm nâng cao hoạt tinh và kha năng ứng dụng trong điều trị CPT.Hai trong số chúng đã được thương mại hóa là topotecan (Hycamtin) vàirinotecan (Camptosar, CPT-11) lần lượt bởi GlaxoSmithKline và Pharmaciathiện là Pfizer) [47] (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của topotecan và irinotecan [47]

1.1.3 Quá trình tổng hợp và bản tổng hợp Topotecan và Irinotecan

đơn giản hóa quy trình phức tạp và đồi hôi về mặt kỹ thuật củaviệc tổng hợp toàn phần các dẫn xuất của CPT, các dạng thuốc này có théđược điều chế bằng các lộ trình bán tông hợp ngắn bắt đầu từ CPT tự nhiên

Ví dụ, SmithKline Beecham đã phát triển tổng hợp topotecan từ CPT (Hình 1.4), Chất trung gian này thu được với hiệu suất 91% trong quá.trình oxy hóa-khử hai bước liên quan đến quá trình hydro hóa một phần chấttrung gian tetrahydroquinoline được xúc tác Pt ban đầu và quá tình oxy hóa

10-hydroxy-tiếp theo của nó với việc sử dụng Phl(OAc); [59] Ngưng tụ 10-hydroxy-CPT với formaldehyde và dimeiylamine hoặc hiệu quả hơn với N,N-

dimetymethyleneimfflằm clorua (Si hình thành tối thiển sản phẩm phụ

10-hydroxymethyl không mong muốn) [56] đã cho ra topotecan với năng suất tố

a ot CT wa

GOyƒ => ORY

Con đường bán tổng hợp thành irinotecan là do nhóm Sawada phát triển năm 1991 (Hình 1.5) [43, 44], Bước quan trọng của quá tình này dựa

tại dl

trên việc bổ sung gốc etyl (được tao đi phản ứng của propanal,

7

FeSO, và H:O› trong môi trường axit trong nước) một cách chọn lọc ở vị

của CPT Điều nảy đại diện cho một phản ứng liên quan đền việc bổ sung gốc.carbon vào các dị hợp chất thơm th

đặc bi

điện tử như pyridine và quinoline, nó

trong CPT Quá trình oxy hóa

hữu ích trong việc thay đổi vị

theo của 7-ethy-CPT thành N-oxit tương ứng, sau đó là quá trình

hydroxyl hóa quang hóa dẫn đến 7-cthyl-10-hydroxyCPT (SN-38) với hiệu

-38 bằng [1

xuất tổng thể là 49% Axyl hóa S bipiperidinyl]-1'-cacbonylchloride trong pyridin hoặc bằng 1.4-bipiperidin/COCI: đã tạo ra irinotecanvới hiệu suất 80% [14, 43, 44]

Hình 1.5 Quá tình bán tong hợp Irinotecan [25]

Các dẫn xuất CPT biến đổi ở vòng quinoline nhận được sự quan tâm

lớn nhờ các wu việt mà nó mang lại như tăng khả năng hòa tan, cải thiện hoạt tính và giảm các tác dung phụ Topotecan được cải thiện tính tan nhờ việc thay thé một amin bậc ba ở vị trí 9, trong khi irinotecan được bổ sung gốc

hydroxyl tại vị trí C10 Ngoài ra, các dẫn xuất như SN-38, aminoCPT, nitroCPT (rubitecan) cũng cải thiện tinh tan đáng kế nhờ những biển đổi trong

9-vòng quinoline [24, 38]

1.1.4 Nguồn gốc và phân bồ của các loài thực vật có chứa Camptothecin

Hy thụ vào năm 1966 do nhóm nghiên cứu của Wall ở phía Nam Trung Quốc và Tay

CPT lần đầu tiên được tim thấy vả xác định đặc tính từ loài c:

Tang [27] và tiếp tục được tim thấy trong loài cây thuốc khác đó là cị

Căn đậu Øphiorrhiza mungos L (Rubiaceae) vào năm 1976 ở Nam A vàĐông Nam A [20|

Tir năm 1977 - 1996, CPT được tìm thấy trong bảy loài thực vật thuộc.

các họ khác nhau, bao gồm họ Trúc đảo (Apocynaceae), họ Thụ Đảo (leacinaceae) và họ Cà phê (Rubiaceae) Trong đó Nothapodytes collina C.Y.

Wu (leacinaceae), Nothapodytes obscuva C.¥ Wu (Ieacinaceae), Nothapodytes

obtusifolia (Mert.) RA-Howard (Ieacinaceae) và Nothapodytes tomentosa

CY Wu (leacinaceae) được báo cáo là có khả năng sản sinh CPT cao hơn [4]

so với loài cây Hy thụ, do đó cho tha

cho việc tách chiết CPT,

T

tiém năng là nguồn thực vật thay thé

năm 1997 - 2019, có 43 loài thực vật thuộc 8 họ khác nhau đã được

chứng minh là có khả năng sản sinh CPT, thuộc các họ Trúc dio

(Apoeynaceae), ho Bach Dương (Betulaceae), họ Hoàng ding (Gelsemiaceae),

ho Thụ dao (Icacinae:

Ca phê (Rubiaceae) và họ Hoa tím (Violaceae) Trong đó gần 1/2 số loài thực

vật sinh CPT thuộc họ Thụ dio và 28% thuộc họ Cà phê Các loài thực vật

), họ Xoan (Meliaceae), ho Lam quả (Nyssaceae), họ

được phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam A, đặc biệt là miễn Nam TrungQuốc và An Độ [35],

1.2.1 Mô tả thực vật

Tổng quan về cây Mẫu đơn

Hình L6 Cây Mẫu đơn [13]

Ixora chinensis

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Gentianales

Ho (familia): Rubiaceae

Chi (genus): Lxora

Loài (species): 1 chinensis

Cay Mẫu đơn có tên khoa học là Ixora chinensis một loài thực vật có

hoa thuộc họ Cà phê - Rubiaceae với khoảng 500 loài trong chỉ Ixora và thường được gội là "santan: na" ở Philippines.

cao từ 1,5 - 3 m Lá

Cay Millon là một loại cây bụi mọc thẳng, nhẫn

mọc đối, không cuồng, hình trứng thuôn dài đến hình elip, dài từ 7 - 13 cm,nhọn ở cä hai dau, mọc đối với các cuống lá ngắn Hoa rất nhiều, mọc thành

cụm đây đặc, hình cầu gai, đường kính từ 6 - 12 cm, màu cam nhạt, đỏ, vàng

hoặc trắng, Đài hoa ngắn và tù Tràng hoa màu hồng hoặc hơi đỏ, dài 2 - 2,5

em, với các thy tròn đài 5 - 7 mm [I3]

1.2.2 Thành phần hóa hoc

“Theo kết qua báo cáo của các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra 7 hop

chất được phát hiện tir cây Mẫu don, và được xác định là D-mannitol (1), axit

stearic (2), 1,5-cyclooctadiene (3), ƒ-sitosterol (4), (10E) en-12 -axit ynoic (5), axit azelaic (6) và axit dihydromasticadienolic (7) [41] 1.2.3 Tác dụng được lý

-9-oxooctadee-10-‘Theo truyề thống, cây được sử dụng để điều trị tăng huyết áp, thấpkhớp, áp xe, vết bằm tim và vết thương Nó cũng cổ lợi cho tủy xương vàmang thai tử cung Các axit béo được tìm thấy trong dầu hạt của Mẫu đơn là

axit ixoric và axit crepenynic Ở Philippines, một phương pháp chữa bệnh

truyền thống được sử dụng từ những bông hoa tươi được cho là một phương.thuốc chống lại bệnh lao phổi và băng huyết Dich chiết từ lá hoặc hoa được

sử dụng để chống lại bệnh đau đầu Người Mã Lai sử dụng nước sắc rễ saukhi sinh con trong khi người Indonesia dùng nước sắc rễ để điều trị rối loạn

ấp 6 Việt

Nam rễ, thân, lá và hoa được dùng chữa kinh nguyệt không đều, cao huyết áp,

phế quản và nước s ie hoa để điều trị chứng v6 kinh và tăng huy:

ho lao, ho ra máu, thấp khớp, mụn trứng cá [13]

Vào năm 1995, các nhà khoa hoe Philippines l thử nghiệm u da và u

khối gan trên chuột Những con chuột được cạo lông ở lưng trước 3 ngày rồi

sẽ gây u bằng dimethylbenzanthracene, Sau 3 ngày thoa dịch chiết từ hoa của

J chinensis và 1 eoeeinea lên khối u 30 phút Lap lại 3 lần một tuần trong 20

n toàn biến mắt [45] Năm

2019, cây Mẫu đơn được phát hiện có hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thưtuần, hành kết quả kiểm tra cho khối u hoà

và chống vi khuân từ lá và hoa [62]

1.3 Tổng quan vi nam nội sinh

1.3.1 Vindm nội sinh

Vi nắm nội sinh gồm những loài vi nắm sống bên trong cây ký chủnhưng không gây ra bệnh tật hoặc anh hưởng tiêu cực đến sức sống của vật

chủ Vi nội sinh có thể có những ảnh hưởng tích cực đối với vật chủ như:gia tăng sự phát triển của cây ký chủ, tăng khả năng hắp thụ chất dinh dưỡngcủa cây, ngăn chặn sự phat triển của mầm bệnh thực vat, giảm mức độ

nghiêm trọng của bệnh và tăng khả năng chống chịu với áp lực môi trường.

"Đồng thời, vi nắm nội sinh còn tạo ra nhiều loại thành phần tự nhiên, đôi khi(được gọi là chất chuyển hóa thứ cấp và các chất sinh hóa hữu ích khác

“Tiềm năng khai thác vi sinh vật nội sinh dé sản xuất các hợp chất có

hoạt tính sinh học quan trọng đối với sức khỏe con người là vô ing to lớn.

“Trong 5 năm qua, hơn 300 loài vi sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các

chất chuyển hóa có giá tri ti liệu đã được phân lập và nuôi cấy thành côngtrong phòng thí nghiệm Nắm nội sinh có khả ning tạo Kuột số chất chuyểnhóa giống với vật chủ của chúng [31] Một trong các hợp chất có được tính

‘quan trọng đã thu được là vineristine, vinblastine, CPT, quinine va taxol [35], ngoài ra còn hơn 8500 chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tir

nắm nội sinh đã được biết đến [9, 17] Việc phát hiện nắm nội sinh Taxomyces

adreanae trong cây Taxus baccata có khả nẵng sinh tổng hợp taxol đã thúc

diy các nghiên cứu tìm iếm nắm nội sinh có thé tạo ra các phân tử có hoạttính sinh học và các dẫn xuất của chúng [29] Kết quả của các nghiên cứu.giúp hiểu rõ hơn cơ chế tiến hóa phức tạp của vi sinh vật và thực vật chủ,đồng thời thu được nhiều hợp cl có hoạt tinh sinh học mới Tuy nhiên, việc

phân lập, xác định các vi sinh vật nội sinh triển vọng có khả năng sản xuất các

chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học từ vô vàn các loài thực vật luôn là mộtthách thức Cũng với đó, việc thiết lập mỗi tương quan với việc sản xuất các

phân tử có hoạt tính sinh học cũng là một nhiệm vụ quan trọng Những thách

50)

1.3.2 Các nguôn vi nắm nội sinh có khả năng sản sinh Camptothecin

rất nh

thức để sản xuất chúng Về mặt thương mai

Ba loại vi nắm sản xuất CPT bao gồm Aspergillus sp LY341, Aspergillus

sp LY355 và Trichoderma atroviride LY357 được phân lập từ cây Hy thụ.

Ham lượng CPT tương ứng trong 3 chủng nắm trên là 7,93; 42,92 và 197,82.ug/l Tuy nhiên, hai chủng nắm LY341 và LY355 đã mắt khả năng sản sinhCPT sau quá trình nuôi cấy lặp lại Mặt khác, CPT vẫn được thu nhận từ loạinắm LY357 tử thể hệ thứ 2 đến thé hệ thứ 8 [60],

“Trong một nghiên cứu khác, Shweta và cộng sự đã phân lập được 3 loại nấm nội sinh (A alternate, Fomitopsis sp., Phomopsis sp.) từ quả và hat của Miquelia dentate sản sinh CPT, 9-methoxycamptothecin, và 10- hydroxycamptothecin Hàm lượng của CPT thu được từ A, alternata, Fomitopsis sp và Phomopsis sp tương ứng là 73,9; 55:49 và 42,06 ugfg trọng lượng khô [39].

“Trong nghiên cứu tiếp theo, 161 loại nấm được phân lập từ cây Hy thụ

“Trong số đó nắm Botryosphaeria dothidea, X-4 cho thay khả năng sản sinh

9-methoxycamptothecin [61] Nắm nội sinh Neurospora sp được phân lập từ

các hạt của cây N foetida cho thấy khả năng sản sinh CPT Các CPT được

đồng tế bào A549

phân tách từ nấm đã được kiểm trakhä hing chống lại

và tế bào Ovcar-5 Kết quả cho thấy khả năng gây độc tố tế bào ở cả hai dong

tế bào trên [39] Trong một nghiên cứu khác, nắm XZ-01 thuộc loàiPhomopsis sp được phân lập từ chồi non của cây Hy thụ tir Trung tâm baotồn tự nhiên Jiangshi, Trung Quốc

“Trước nhu cầu rất lớn về việc sử dụng các chủng nấm nội cộng sinh đểtổng hợp CPT trong Sản xuất thuốc điều trị ung thư cũng như các bệnh hiểm

nghèo khác, các nhà khoa học đã nghỉ

khác nhau Vào năm 2020, nghiên cứu của Ravi Aswani và cộng sự đã chỉ ra

cứu sàng lọc ở rất nhiều loài thực vật

nắm nội sinh được phân lập từ Ophiorrhiza mungos có khả năng sinh tổng.hợp CPT bằng phương pháp HPLC Trong 16 chủng nắm nội sinh được phân

it hiện thuộc loài

lập sàng lọc thì có 2 chủng nấm nội sinh được pt

Meyerozyma sp) OmF3 và Talaromyces sp OmE4 có tiểm năng sản xuất

CPT, Hàm lượng CPT thu được từ Meyerozyma sp OmE3 là 947,3 + 12,66 gil, khi được bổ sung với 1 jigiml các hạt nano oxit kẽm Ham lượng CPT thu được thir Talaromyces sp OmF4 là 28,97 + 0,37 g1 khi được nuôi cấy

với 10 jig/ml hạt nano bạc [37] Từ nghiên cứu này cho thấy tiềm năng phân.lập được các chủng nắm nội cộng sinh sinh CPT tại châu Á nói chung và Việt

Nam nói riêng là tắt lớn.

“Trong một nghiên cứu của Mohinudeen và cộng sự (2021), một loại ảnh Alternaria burnii, đã chúng mình có khả năng sản xuất CPT bén

vững sau 12 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy huyền phù, chủng.nắm này thu được sau khi sàng lọc 132 dòng nấm nội sinh cùng được phan

lập từ cí Nothapodytes nimmoniana [21] Két quả của nhữa

trên đều cho thấy, nắm nội sinh với khả năng tạo ra các chất chuyển hóa thircấp dựa trên đặc tính thực vật chủ là một giải pháp thay thế tiềm năng, đểsản xuất chất chuyển hóa của một số cây chủ Và nghề cl

nhiên khỏi sự tuyệt chủng,

1.4 Lên men

1.4.1 Tong quan về lên men

Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật dé tạo ra sinh khối (tăng sinh)hoặc thúc đẩy vi sinh vật tạo ra sản phẩm trao đổi chất (các hợp chất sinhhóa), như chuyển đổi đường thành sản phẩm như: axit, khí hoặc rượu củanắm men hoặc vi khuan, hoặc trong trường hợp lên men axit lactic trong tếbao cơ ở điều kiện thiếu khí Oxy Lên men cũng được sử dụng rộng rãi hơn.trong sự tăng sinh khối của vi sinh vật trên mỗi trường sinh trưởng, sự ích lũycác sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi

sinh vật Nhà sinh vật học người Pháp Louis Pasteur được ghỉ nhớ như là

người hiểu rõ sự lên men và nguyên nhân vi sinh vật của nó Khoa học của sựlên men được biết như "zymology" [5]

1.4.2 Các nghiên cứu lên men sinh ting hợp Camptothecin

Ching Entrophospora infrequens được phân lập từ vỏ của Nothapodytes foetida mọc ở Ấn Độ có thé tổng hợp CPT Khi nuôi ở quy mô

lớn trong bình 40 1 với tốc độ thổi khí 1 vvm, áp suất 0,2 kg/cm, nhiệt độ 28 +2C, tốc độ Khuấy 220 vòng/phút Him lượng CPT cao nhất thu được là 4,96.0/73 mg/100 g trọng lượng nắm khô ở 48 giờ sau khi nuôi cấy [54]

Vio năm 2009, Nodulisporium sp được phân lập từ vỏ của cây N.

#oetida được chứng minh có khả năng sinh CPT Khi nuôi ở quy mô bình lắc

500 mi chứa 100 ml môi trường, khuấy ở tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ28C Hàm lượng CPT tối đa thu được vào ngày thứ 4 là 5,5 wg CPT/I g trọnglượng nắm khô Khi nuôi ở quy mô lớn 40 lít với 18 lít dung dịch tốc độ thôikhí 1 vvm, áp suất 0,2 kg/em, nhiệt độ 28 + 2°C, tốc độ khuẩy 220 vòng/phút

thi hàm lượng CPT cao nh: thu được ở ngày thứ 5 12-45 jg CPT/I g trọng

lượng nắm khô [41]

“Trong một nghiền cứu của Xiang Pu và cộng sự (2013), 3 loại nắm nội

sinh sản xuất CPT là Aspergillus sp.LY341, Aspergillus spLY35S và

Trichoderma atroviride LY35T, được phân lập và xác định được từ cây Hy

thụ Phần lớn CPT tạo ra ở 3 loài nắm này được tìm thấy trong quá trình lênmen lỏng và sản lượng CPT được tìm thấy tương ứng ở 3 loại nấm này là

7,93; 42,92 và 192,82 g/l Các môi trường lên men, thời gian, pH, nhiệt độ và

tốc độ khuấy được sử dụng trong thí nghiệm, ww khi được mang ra so sánh

thì kết luận được rằng nuôi cấy các loại nắm nội sinh trên trong môi trường.SDB (tryptone: 10 g/l, glucose: 40 g/l), pH = 5,6, nuôi ở 28°C, 150 rpm kết

hợp với Methyl jasmonate, XADI6 đã được chứng minh là điều kiện nuôi

, chất kích thích và chất hấp phụ tối ưu trong sản xuất CPT, năng suấtđược tăng lên gắp 3,4 lần [60)

Vi các thí nghiệm sơ bộ về sản xuất CPT trước đây chi ra rằng các yếu

tố quan trọng nhất trong môi trường nuôi cấy nắm nội sinh là dextrose,

peptone và MgSOj, nên trong nghiên cứu của Sogra Fathima Musavi và công

sự (2015) đã sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM-Response surface

methodology) kết hợp với thiết kế mô hình lặp tâm (C4 trai compositedesign), bao gồm một phương trình hồi quy liên kết 3 biến XI, X2, X3 tương.ứng với dextrose, peptone và MgSO, dé cho thay sự ảnh hưởng của từng yếu

16 đến sản xuất CPT Kết quả cho thấy, XI-dextrose có ảnh hưởng đáng kể

(p< 0.01) đến phản ứng Y (sản xuất CPT) và nó có hệ số lớn nhất, tiếp theo làX3-MgSO, và X2-peptone, Điều kiện tối ưu của các thành pha

dextrose 42,64 g/l, peptone 9,23 g/l và MgSO 0.26 g/l [48]

môi trường,

Năm 2019 Prince Clarance va es đã tối ưu hóa quá trình lên men

Fusarium solani chủng ATLOY-8, một loại san xuất CPT được phân lập

từ Chonemorpha fragrans (Moon) Alston trong môi trường YESD, với pH =

6, nhiệt độ nuôi 25°C, tốc độ lắc 120 rpm, kết hợp với tiễn chat (tryptonphan,

tryplamine, geraniol) cho thấy năng suất CPT tăng 1.2 lần so với phương pháp truyền thống [34]

“Trong nghiên cứu của Bhumika N, Bhalkar và cộng sự (2016) hai loại

nắm nội sinh được phân lập từ N nimmoniana dé tông hợp CPT trong điềukiện lên men lỏng Hai loại nắm được xác định là Colletotrichum fructiola

SUKI (Fl) và Corynespora cassiicola SUK2 (F2) Các thí nghiệm lên men được thực hiện để nghiên cứu sự ảnh hưởng của tín hiệu vi sinh vật giữa 2

loại nắm đồi với việc sản xuất CPT Ảnh hưởng của các thông số nuôi cấy sản.xuất CPT được nghiên cứu cho cả 2 nền nuôi cấy là: Nền nuôi cấy đơn (F1 vàF2 riêng biệt) cũng như cho quá trình lên men hỗn hợp (Fl với F2) Các thông

ig hợp dựa trên môi trường và các điều kiện nuôi cấy đã được tối

ua hóa là whey (70%), tốc độ lắc 1 10 rpm, nhiệt độ 30°C và nuôi trong vòng 7

số được.

ngày cho quá trình lên men hỗn hợp Thí nghiệm lên men của 2 loại nắm Fl

và F2 riêng biệt mang lại kết quả CPT là 33 + 1,1 mg/l và 69 + 1,1 mg/l

“Trong khi quá trình lên men hỗn hợp của 2 loại nắm trong các điều kiện tối wahóa mang lại kết quả dat 146 + 0,2 mg/l, Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.(High performance liquid chromatography-HPLC) và kĩ thuật khối phổ (Mass

spectrometry-MS) đã được sử dụng dé phân tích các sản phẩm thu được sau {qué tình lên men [6]

‘Nam 2021 Qingyan Ruan và cộng sự đã phân lập vi nắm nội cũng như:tối ưu hóa quá trình lên men sinh tông hợp CPT Đặc biệt nhắn mạnh vităng khổi lượng CPT thu được từ vi nắm nội sinh thông qua việc thay đổi các

tỷ lệ nguồn cacbon, nite và photphat, bổ sung các tiền chất, chất làm mémhoặc nhựa hấp phụ sử dụng quá tình lên men đồng cấy hoặc nuôi cấy lên

men [42]

C6 thé tha trên thé giới đã có rất nhiều nghiên cứu về hợp chat CPT,

về nó Mặt khác, trên thực Nam sở hữu nguồn tài nguyên về thực vật

CPT Do đó,

nghiên cứu trong nước vẻ CPT nên được quan tâm và đây mạnh hơn Vi

vô cùng phong phú, với vô số các loài cây có thể chứa hợp ol

tài nghiên cứu này là vô cùng cắp tí

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VAT LIEU VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1, Mục tiêu chung

Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh cố khả năng sinh tổng

hợp CPT góp phần cho nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị ung thư

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Định danh cây Mẫu đơn.

- Nội dung 2: Phân lập các chủng ví nắm nội sinh trên cây Mẫu đơn

~ Nội dung 3: SaếÖMọc cốc chit vi nắm nội sinh có kha năng tổng

hợp CPT.

tội dung 4; Định danh chủng vi nắm nội sinh có kha năng sinh CPT cao

~ Nội dung 5: Lên men thu hồi CPT từ chủng vi nắm nội sinh quy mô

phòng thí nghiệm.

2.4 Vật liệu nghiên cứu

3.4.1 Đối trợng nghiên cứu

“Các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ 3 cây Mẫu đơn lần lượt kí hiệu

am Cây Mẫu đơn được thu ở

huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang (21.077 21.377N, 105.53”

-3.4.2 Héa chất, trang thiết bị trong nghiên cứu:

2.4.2.1 Hỏa chất

Nito lỏng, CTAB (Việt Nam), Chloroform’ (Merck), Isopropanol (Merck), Ethanol (Merck), Rnase (Qiagen), QIAamp DNA Mini Kit (#51304,

QIAGEN, Hilden, Đức), Nucleas

DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermofisher Scientific), Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Thermofisher Scientific), kit GeneJET PCR Purification Kit (Thermofisher Scienti

Free Water (Thermofisher Scientific),

`), agarose môi trường, nước cất

đã khử trùng, Ethanol (Merck), Sodium hypoehlori

Nam), môi trường PDB (TM Media), Glucose (Merck), CH:Cl (Trung Quốc), Methanol (Trung Qui

{Việt Nam), chất chuan Camptothecin (Sigma Aldrich).

2.4.2.2 Thiết bị

2%, Potato extract (Việt

Cong Nghiệp

„ Butanol (Trung Quốc), C

Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử:

9700 (Applied Biosystem, My), máy ly tâm Eppendorf 5430R (Eppendorf),

bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ôn nhiệt

(Memmert, Đức), may ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Bios

pipetman, máy PCR System

stems,

Mỹ), que cấy, box cấy vô trùng, kéo, pank, ống facol Corning, ré đựng mau,giấy lọc, giấy lau đã khử trùng, bàn chải mềm, phéu chiết 2.000 ml nhám.29/32 (Buran, Đức), bình cảu 1.000 ml nhám 29/32 (Buran, Đức), tủ cấy vô.trùng (Nuaire, Mỹ), tù ấm (Binder, Đức), nồi khử trùng (Hirayama, Nhật

Bản), máy lắc ổn nhiệt (Certomat BS-1, Đức), tủ lạnh -80°C (Nuaire, Mỹ),

máy ly tâm Hermle Z326 (Đức), cân kỹ thuật Precisa XE 1.200C (Switzerland), cân phân tích Shimadzu AY 120 (Nhật Bản), kính hiển vi

quang lọc Olympus CX21 (Japan), máy anh kỹ thuật số Canon IXY DigitalT0 (Japan), máy đo pH Hana Instrument, ống nghiệm, bình tam giác các loại

50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 mi và các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm.

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Định danh cây Mẫu don

2.5.1.1 Tách chiết DNA tổng số

Sau khi được thu thập, lá từ cây Mẫu đơn được sử dụng đẻ tách chiết

DNA tổng số theo phương pháp của Pascale Besse (2014) [30]: Cụ thé: 0,25 g

lá được nghiên với nitơ lỏng rồi ủ với 600 ul đệm chiết CTAB (0,20M Tris;

pH 7.5; 0,05M EDTA; pH 8,0; 2M NaCl; CTAB 2%; J-mercaptoethanol 1%)

trong bể ôn nhiệt 65°C, 60 phút Sau đó ly tâm thu dich nỗi và bổ sung 500 plchloroform: isoamyl alcohol (24:1) Tiếp tục ly tâm với tốc độ 13.000 rpm, 10

phút để thu dich ở pha trên v à chuyển sang ống mới: Bỏ sung Isopropanol với

thể tích tương ứng rồi ly tâm một lần nữa với tốc độ 13.000 rpm trong 10

phút Loại bỏ dịch nổi và làm sạch DNA bằng ethanol 70% DNA được hòa

tan Jing đệm TE và định lượng, định tính Lin lượt trên gel agarose 0,8% và

Bang 2.1 Danh sách cặp mdi cho phản ứng PCR

tpoCl 450

R_ | CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

Các dung dich hóa chat được chuẩn bị trong ống PCR 0,2 ml với thànhphần và liều lượng như bảng 2.2.

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR thực vật

STT ‘Thanh phần Nang độ sử dụng | Thể tích (ul)

1 | Nước deion khử tring 7 mm

2 | Mai xuôi — 10M | 0s

3 [Mỗi ngược ~~ 10uM 05

4 | DreamTag Green PCR Master Mix 2x 10

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mỗi ITS

Têngiaiđoạn | NhiệtđộíC) | Thờigian | Chu kỳ (chu kỳ)

Biển tính 95 3 phút 1

Biển tính 95 15 giây

Bắt cấp 55 30 giây 35

Kéo dài chuối T2 15 giây

Kéo dài chuỗi 72 5 phút 1

Két thúc phan img 4 Ee

Bảng 2.4, Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mdi rpoC1

Têngiaiđoạn | NhiệtđộŒC) | Thờigian | Chu ky (chu kj) Biến tính 95 3 phit | 1

Biển tính 95 15 giây

Bắt cap 58 30 giấy 35

Kéo dai chuỗi 1 15 giấy

Kếo dài chuỗi T2 Š phút 1

Kết thúc phản ting 4 1= 7

Sau khi quá tình PCR kết thúc, sản phẩm PCR được điện di trên gelagarose 1%, sau đó được tinh sạch bằng kit GeneJET PCR Purification Kit(Thermofisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sin xuất Sản phẩm nàyđược sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mỗixuôi và mỗi ngược) với mỗi ITS, rpoC 1 nêu trên, sử dụng Bigdye terminatorv3.1 cycle sequencing kit (Thermofisher Scientific) và đọc kết quả trên hệthống ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, My) Trình tự

nucleotide thu được được căn trình tự với trình tự đã có trong giao thức bằng

phần mém BioEdit 7.0.5.3 và dùng cơ sở dữ liệu NCBI/ Genbank bing công

cụ online BLAST,

Kết quả tình tự DNA được hiệu chỉnh với sự trợ giúp của phần mém

ChromasPro L7.6 để loại bỏ các tín hiệu nhiễu Các trình tự sau đó được so

sinh với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI và căn chỉnh tinh tự bing phần

mềm Clustal X [53] Cây phân loại được dựng dựa vào phương pháp

Neighbor-joining {28} và khoảng cách di truyền Kimura bằng phan mềm Mega X [52].Các điềm của cây phân loại được lặp lại 1.000 lần

2.5.2, Phin lập các chủng vi nắm nội sinh trên cây Mẫu đơn

Ba cây Mẫu đơn tươi thu được từ Bắc Giang lần lượt được kí hiệu II, I2,

13 Mẫu thực vật xử lý trong vòng 24 giờ sau khi thu thập theo phương pháp,

en et al (2017) và Khan et al, (2016) [15,

.được mô tả trong nghiên cứu của G

22] với một số thay đồi Cụ thé quy trình được chia thành ba giai đoạn.

- Bước 1: Chia mẫu cây thành 4 nhóm bộ phận thân, lá, rễ và hoa để

phân lập được toàn diện các loại vi nắm nội sinh có trong cây Các bộ phận

hoa, lá, thân, rễ kí hiệu lần lượt là: H, L, T, R Nguyên liệu thực vat được rửa

kĩ bằng nước má „ dưới vòi nước chảy chậm, chia nhỗ cá ie nhóm bộ phận ra

các phần khác nhau Trong quá trình làm sạch mẫu sử đụng bàn chải có lôngmềm, chai nhẹ sạch các lớp bụi bản, đắt có rến bể mặt mẫu Tránh làm tên

thương tới mô của thực vật trong quá trình làm sạch Mô thực vật sau khi rita

được ngâm trong dung dịch ethanol 75% trong 3 phút, Tiếp tục khử trùngmẫu trong dung dịch chứa NaOCI 2%: trong 3 phút, Khử trùng lại b8 mặttrong ethanol 75% trong 1 phút để loại bỏ NaOCl Cuối cùng, rửa mẫu bằngnước cắt vô trùng 3 lần (mỗi lần 3 phú nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại

cũng như vi sinh vật ngoại sinh;

- Bước 2: Quá trình khử trùng bề mặt để loại bỏ vi sinh vật ngoại sinh

được kiếm chứng bằng phương pháp thu 0,1 ml nước rửa lần cuỗi cùng của

bước khử trùng và nuôi cấy trên môi trường potato dextros agar (PDA), ủ ở

28°C trong 7 ngày;

- Bước 3: Các mô thực vật sau xử lý bể mặt được cắt thành các đoạn

nhỏ kích thước khoảng 5x5 mầm bằng dao vô trùng Sau đó, đặt các mảnh mẫu

lên môi trường phổ rộng PDA (Potato extract: 200 g/l, Glucose: 20 g/l, agar:

20 gl) có bổ sung ampicillin 0,01% và steptomixin 0,01% Các đĩa được nuôi

trong điều kiện tĩnh, không có ánh sáng ở 30°C trong 7 ngày, theo doi hing

ngày để kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc Thực hiện cấy chuyển các.xơi nắm phân lập được từ các đĩa gốc sang đĩa thạch chứa môi trường PDA mới

và nuôi ở điều kiện tương tự Theo doi và tiến hành cấy chuyển đến khi tạođược dòng nắm thuần khiết về mặt sinh học Các chủng nấm sau khi đã làmthuằ được cấy trên môi trường giữ giống PDA theo phương pháp giữ giống

kiện -80°C [3]

trên thạch nghi ig và giữ giống 20% glycerol (v/v) ở đi

2.5.3 Sing lọc các chủng vi nắm nội sinh có khả năng sinh tang hợp Campfothecin2.5.3.1 Tách chiết và định tính Camptothecin từ chúng vi nắm nội sinh

«a Tách chiết Camptothecin

"Để sàng lọc được chủng vi nắm nội sinh có khả năng tổng hợp CPT,

“Các chủng nắm thuần khiết về mặt sinh học được cấy Vào 250 ml môi trườngPDB (dịch chiết khoai tây 200 g/; glucozo 20-g/l) trong bình tam giác 500 mi.Điều kiện nuôi cấy tốc độ lắc 180 vong/pht

_

30°C trong 7 ngày, trong bóng

ế bào và dich

Sử dụng máy ly tâm Hermle Z326 dé phân tách sinh khối

lỏng nuôi cấy của 250 ml dịch nuôi cấy ở 3/500 vòng/phút Phin dich lỏngnuôi cấy và phần sinh khối tế bào mau kí hiểu lần lượt là L va C

Với mục đích định tính sự có mặt của CPT, phần dịch lỏng nuôi cấy

DCM): Metanol (CH:OH - MeOH) theo ty lệ 9:1 (thể tích: thé tích ) Dich lỏng nuôi cấy

được mang chiết với hệ dung môi Dichloromethane (CH;C1;

được chiết phân lớp lông - lông với hệ dung môi DCM-MeOH theo ty lệ 11(thể tích: thể tích ) dich nuôi cdy và dung môi chiết, chú ý vừa lắc vừa xì hơi.bằng van khóa Phân lớp DCM có tỷ trọng nặng hơn nước nằm bên dưới lớp.dich lỏng nuôi cấy trong phéu chiết và hòa tan các chất phân cực, trong đó có

"T sau đó thu dich lòng bên dưới Quá trình này được lặp lại ba lần Dịch

không Buchi R-300 Rotavapor, máy bơm chân không V-300, bể gia nhiệt

B-300 dé thu cao chiết

“Tổng khối lượng cao chiết sau đó được cân và chuyên vào ống vi ly

tâm polypropylene, hòa tan trong DCM/MeOH (9: 1, v: v) trong 30 giây sau

đó ly tâm ở 11.000 vòng/phút trong 2 phút Dịch nổi sạch được sử dụng trựctiếp cho quá trình định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layerchromatography - TLC) va định lượng bằng kỹ thuật sắc ky lỏng hiệu ning

cao (High performance liquid chromatography- HPLC), khối phổ (Mass spectrometry-MS),

1g sắc kyl dp móng TLC

Phương pháp sắc kí lớp mong TLC để xác định sự có mặt của CPTthường sử dụng bản mang silica-gel tráng sẵn với hệ dung môi triển khai làDCM/MeOH (95:05) (v:v) (RF ~ 0,5) Thực tế được triển khai phương pháp

b, Định tính Camiptothecin

lớp mỏng TLC trong thí nghiệm cũng sử dụng khá tương đồng Bảnmỏng silica-gel tráng sẵn (Supelco hoa Merck) tiến hành sấy khô ở nhiệt độ.60°C trong 10 phút trước khi sử dụng Bản mỏng sau khi được nạp mẫu được

đặt trong bình trién khai kích thước 15x15x7 cm (cao x đài x rộng) Hệ dung môi triển khai DCM:MeOIT (95:5), lượng dung môi triển khai khoảng 5 - 7

ml Trong các thực nghiệm TLC, 2 ul dich chiết và chất chuẳn được nạp lên

bản silica-gel Sau 5 - 7 phút dung môi triển khai lên đến gần hết bản mỏng.(còn cách khoảng 3 - 4 mm) thì nhắc bản mỏng khỏi bình triển khai và sấykhô Kết quả TLC được hin thị đưới bước sóng 366 nm, anh chụp kết quả thínghiệm được chụp trong buồng máy UV với bước sóng trên

2.5.3.2 Pdi và định lượng Camptothecin từ chẳng vi nắm nội sink

Lấy mẫu cao đã được sấy khô va lưu giữ ở nhiệt độ phòng mang bổ.sung 2 mi hệ dung môi DCM:MeOH (9:1) vào ống chứa cao chiết Mẫu được

đặt trong bể siêu âm và gia nhiệt tại 35°C trong 30 phút Sử dụng xy lanh

dung tích 5 ml Hút mẫu và lọc bằng màng lọc syringe filter (kích thước lỗ lọc0,20 pm) Sau khi lọc, hút 1 ml mẫu đặt vào lọ (vial của máy HPLC) 1,5 mlđưa vào phân tích bằng hệ máy agilent,

- Điều kiện chạy HPLC: Hệ máy HPLC Agilent 1.100, thể tích mẫu

bơm 10 ul, cột phân tích ODS A (5 um; Inertsil) dài 150 mm, đường kính

trong 4,6 mm Dung môi phân tích chạy theo gradient của hệ dung môi Acetonitrile: nước từ (20:80) đến (100:00) trong 30 phút với tốc độ dòng rửa

giải 0,6 ml/phút CPT hap thụ rõ ở bước sóng 366 nm nên lựa chọn day là bướcxóng phân tích Thời gian lưu của CPT với điều kiện chạy này là 17,7 phút

- Đường chuin CPT dựng theo diện tích đỉnh của CPT đo bằng HPLC:

Pha CPT với các nông độ 0,1; 0,5; 1; 5; 10 mg/ml và tiến hành chạy phân tích

kiện như trên thu được diện tích của các đỉnh CPT như bảng 2.5

Bảng 2.5 Diện tích đỉnh chất chuẩn CPT với nồng độ khác nhau

Sau khi định tính TLC và HPLC các chủng vi nấm sinh CPT tiém năng.được phân tích khối phé tại Viện Hóa học - Viện HLKHCN VN

Phương pháp khối phố (Mass Spectrometry - MS) là phương pháp

nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của.chat đó dựa trên sự chuyên động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong

một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích.(mz) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được.

điện tích của ion thì ta làng xác định được khối lượng của ion đó

Máy phổ khối phân giải cao được ghép nối với hệ HPLC với mục dichphân nhỏ các thành phần mẫu trước khi đưa vào hệ ion của buông phân tíchkhối phổ Phổ khối phân giải cao cho biết số khối chính xác của n

ù

Điều kiện hệ HPLC tương đồng với hệ HPLC phân tích của CPT nhưng

hệ dung môi rửa giải cao hơn và chạy đẳng hệ (isocratic) CH;CLa/MeOH

(70:30 = vai).

phân

Điều kiện của đầu dò khối phổ: ion hóa bằng tỉa điện (electrosprayionization - ESI), nhiệt độ 300°C, áp sui

Điện áp trong mao quản liên tục được giữ ở mức 5.500 V Nang lượng va

t 25 psi với Nitrogen tỉnh sạch cao.

chạm được đặt ở 10 V và lan truyền năng lượng va chạm bằng không Sửdụng chế độ IDA dé tim khối lượng trong phạm vi (330 đến 400 đơn vị Carbon),

254 Dinh danh chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hop

Camptothecin

DNA tổng Sổ được tách chiết từ các chủng vi nắm sử dụng bộ hóa chất

QIAamp DNA Mini Kit (#51304, QIAGEN, Hilden, Đức) DNA sau đó được

kiểm tra chất lượng bằng máy đo quang phổ Nanodrop 1.000 (Thermo

Scientific) cùng điện di trên gel agarose 1%.

Sau đó sử dụng phương pháp PCR để khuéch đại đoạn gen vùng

ITS1-5.8S-ITS2 của mẫu nắm nội sinh Bộ mỗi được sử dụng là mỗi

ITS-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' và 5-TCCTCCGCTTATTGATA,

TGC cho sin phẩm có đội đài khoảng 600 bp Hin hợp dung dich được

chuẩn bị trong ống PCR 0,2 ml với thành phan và liều lượng như trong

bang 2.6

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR gen ITS.

STT ‘Thanh phần ‘Nong độ sử dụng | Thể tích (nl)

1 | Nước deion khử trùng 19

2 | Mai xuôi 10M —_ 1

3 | Mai ngược 10uM 1

4 | DreamTaq Green PCR Master Mix 2x 25

$ [Miu 50 100 ng 4

‘Téng thé tích phản ứng 50Mẫu DNA được thêm vào ống Ngoài ra, có thêm một dng là mẫu DNA.nắm (đã được PCR thành công ở nghiên cứu khác) là chứng dương dé kiểm

chứng phản img PCR Một ống khác được thay DNA bằng nước là chứng âm

để kiểm chứng nhiễm

Sau khi các phản ứng PCR đã được chuẩn bị xong, ống mix được đặt lên máy luân nhiệt ProFlex PCR System (Thermo Fisher) với chu trình gia

nhiệt như bảng 2.7.

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mỗi ITS

Têngiaiđạn | NhiệcđộŒC) | Thờigian | Chu kỳ (chu kj)

én tinh 95 3 phút 1

Biến tinh 95 15 giây

Bắt cặp 35 30 giây 35

Kéo dai chudi —_ 72 15 giây

Kéo dai chuỗi 72 5 phút 1

Kết thúc phản ứng 4 ©

Sau khi quá trình PCR kết thúc,

nhằm kiếm chứng phản ứng khuếch đại thành công Sử dụng thang chuẩn

lên hành điện di trên gel agarose 1%

GeneRulerTM IKB DNA Ladder dé ước lượng độ dài của sản phẩm PCR Sản

phẩm khuếch đại đạt tiêu chuẩn sẽ tiếp tục tỉnh sạch theo hướng dẫn của nhàsản xuất kit GeneJET PCR Purification Kit (Thermofisher Scientific)

Sau đó, tiến hành quá trình giải trình tự sử dụng Bigdye terminator v3.1

cycle sequencing kit (Thermo ientific) Sản phẩm của qué trình tổng

hợp được điện di trên hệ thống mao quản ABI 3500XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự DNA thu được đọc và kiểm tra chấtlượng bằng phần mềm MEGA X [52 và BioEdit 7.0.5.3 [18] trước khi đượcđưa lên so sánh với các trình tự của các chủng nam khác có trên cơ sở dữ liệuNCBI Genbank bằng công cụ online BLAST

Nhằm xác định bậc phân loại của các chủng vi nắm, trình tự thu được

các chủng vi nắm đó cùng với các chủng vi nấm đã được phân loại từ cơ sở

dữ liệu NCBI/Genbank được sử dụng để so sánh, xác định điểm tương đồngbằng phương pháp ClustalW [23] và sử dụng phương pháp Neighbor-joining

với bootstrap 1000 trên phần mềm MEGA X Cây phát sinh chủng loại thu

được sẽ được biểu diễn bằng phần mềm EigTree v.1.4.2 (http:/tree.bio.ed.ac.uk/

xoftware/figtree/)

Phương pháp định danh hình thái: Sử dụng phương pháp phân loại

truyền thống theo khóa phân loại dé đánh giá đặc điểm hình thái của chủng vinắm thuần khiết vé mặt sinh học theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1982).2.5.5 Lên men thu hồi Camptothecin từ chủng vi nắm nội sinh quy mô

phòng thí nghiệm

Chủng vi nắm nội sinh sàng lọc có kha năng sinh CPT được lên men

thu hồi CPT, tiến hành các bước hoạt hóa và nuôi cấy giống từ môi trường.giống gốc như sau:

+ Bước 1: Hoạt hóa giỗng gốc từ ông lưu trữ trên môi trường PDA

“Mỗi trường sử dụng trong quá trình hoạt hóa giống là PDA Thànhphần môi trường hoạt hóa PDA (Potato extract: 200 g/L, Glucose: 20 g/L,

agar: 20 g/L),

~ Bước 2: Nuôi giống cấp 1.

Chuẩn bị 1 lit môi trường PDB (Potato extract: 200 g/L, Glucose: 20

g/L) chia ra 5 bình tam giác 500 ml, Môi trường được tiệt trùng ở 121°C trong

thạch PDA vào các bình tam giác Nuôi bình môi trường có mẫu giống ở điều

kiện tốc độ lắc 180 rpm, nhiệt độ 28 + 2°C, thời gian lên men 48h

Bình 5 lit môi trường PDB được khử trùng ở 121°C trong 20 phút và dé

nguội Toàn bộ giống cấp 1 được đưa vào 1 bình tam giác cổ vỏi cao su đểtiếp giống Giống sau khi vào bình được cấy lại trên đĩa môi trường PDA đểkiểm tra độ thun khiết Cải đặt các điều kiện nuôi cấy pH 5.5, tốc độ lắc 180.rpm, nhiệt độ 28 + 2°C, sục khí 1 vvm, thời gian lên men 30 h Kiểm tra tốc

độ phát triển của giống hàng ngày.

~ Bước 4: Lên men 70 lí,

70 lit môi trường PDB được khử trùng ở 121°C trong 20 phút và để

nguội Lắp fill lọc khí dé đưa không khí vào bình lên men Nối vòi tiếp giốngtir bình giống 5 lít với vồi tiếp giống của hệ thống bình 70 lít (ho trên ngọn

lửa đèn ôn) Tiếp giống vào máy bơm lưu động để bơm giống từ bình 5 lít

kiện nuôi cấy pH 5.5; 180 rpm; 28 + 2°C,sang bình 70 lít Cai đặt các di

sue khí 1 vvm, thời gian lên men: 7 ngày.

= Bước 5: Tach chiết và thu hồi CPT

Sản phẩm sau khi lên men 7 ngày được thu và ly tâm ở 3.000 - 3.500

vong/pht để tách dich lồng tẾ bào v

Sau khi tách chiết thu cao chi: để phục vụ quá trình định tính TLC,

MS tương tự như tha ở lượng nhỏ 250 ml dich nuôi (phương pháp tách lượng nhỏ = 2.5.3.1 và 2.5.3 Phương pháp cột được sử dụng để tỉnh sạch một lượng lớn hợp chất nhằm xác định cấu trúc phân tử bằng phương pháp khổi phổ cộng hưởng từ Sử dụng cột Silica-gel pha thuận với kích thước đường kính cột 4 em, dài 50 em Dung môi rửa giải là DCM : MeOH theo

gradient từ 100:00 đến 00:100 (v:v).

Hot hóa ging I0ngy

'Hình 2.1 Quy trình lên men thu hồi CPT từ chủng vi nm

nội sinh ở quy mô phòng thí nghiệm.

Chương 3

KET QUA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3,1 Kết quả định danh cây Mẫu đơn.

3.1.1 Tách chiết DNA ting số

DNA tổng số của mẫu cây Mẫu đơn thu được ở xã Tiên Nha, huyện.Lục Nam, tỉnh Bắc Giang đã được tách chiết bằng phương pháp CTAB Kếtquả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% thé hiện trong hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số mẫu cây Mẫu đơn

Giống 1: Mẫu, M: Ladder I KbKết quả cho thấy trên ảnh điện di cho một bang vạch duy nhất có kích.thước > 10 Kb, nó phù hợp với kích thước của DNA tổng số Mẫu có băngđậm sắc nét, thé hiện DNA tách chiết được có độ tinh sạch cao, không bị đứtgãy Tuy nhiên, cần kết hợp phương pháp quang phô ở bước sóng A260/280

am trên máy nanodrop để kiểm tra độ tỉnh sạch của mẫu.

khuôn cho phan ting PCR.

3.12 Nhân ving gen nhân (ITS) và vàng gen lực lap (npoCl) bằng ky

thuật PCR

“Trong nghiên cứu này, mẫu sau khi tinh chiết DNA thành công sẽ đượcdùng làm khuôn để nhân vùng gen ITS, rpoC1 bằng kỹ thuật PCR sử dụngcác cặp mỗi ở bảng 2.1 Cặp mỗi vùng gen ITS và gen rpoCl đã nhân bảnthành công ở nhiệt độ gắn mỗi lần lượt là 55°C và 58°C cho mẫu trong nghiên

‘itu, San phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% (hình 3.2, hình 3.3)

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS

Giảng 1: Chứng dương; giếng 2: Mẫu đơn,giống 3: Chứng âm; M: Ladder IKB