BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
NGUYÊN XUÂN VINH
DANH GIÁ DA DẠNG DI TRUYEN
LOÀI XA XỊ (CINNAMOMUM PARTHENOXYLON (JACK)MEISN.) TAI MOT SO TINH MIEN BAC DỰA TREN
TRINH TỰ 7RNH - PSBA
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HOCMÃ SO; 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CO!NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC:TS HÀ BÍCH HONG
Hà Nội, 2023
Trang 2CONG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi đưới sự hướng,dẫn khoa học của TS Hà Bích Hồng Các số liệu, kết quả nêu trong luận vănlà trung thực và chưa từng được ai công bồ trong bắt kì công. h nghiên cứu.nào khác.
Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bắt kỳ công trình nào đãcông bổ, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luậnvăn của Hội đồng khoa học
Hà Nội, ngày - tháng - năm 2023"Người cam đoạn
Nguyễn Xuân Vĩnh
Trang 3bộ nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học
Lâm nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài
Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảngday tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ của cơ sở đảo tạo Sauđại học trường Dai học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức va giúp
đỡ cho tôi trong suốt khóa học 2020 - 2022
Toi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí thực hiện dé tải từ nhiệm.
vụ nghiên cứu khoa học cấp Quốc gia "Bảo tổn và phát tiễn nguồn gen Xá xi
(Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) tại mộtmã số NVQG-2019/ÐT I4.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đãuôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn.
tinh miễn Bắc” với
Hà Nội, ngày thang năm 2023Hoe viên
Nguyễn Xuân Vinh
Trang 4Chương 1 TONG QUAN VAN DE NGHIÊN CÚU.
1.1 Đặc điểm sinh học loài Xá Xi
1.2, Tổng quan về ADN mã vạch (ADN barcodes),
1.2.1 Giới thiệu về ADN mã vạch
1.2.2 Giới thiệu vé chỉ thị traRr-psbA và ứng dung của chỉ thị traH-psÖ4 6
1.3 Nghiên cứu về đa dạng di truyền của các loài thuộc chi
Cinnamomum a, : : 6
Chương 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG Pt 'GHIÊN CỨU 0
2.1 Lựa chọn mẫu và cách lầy mẫu 102.2 Địa điểm thực hiện nghiên cứa oO2.3 Hóa chất va các thiết bj sử dụng trong nghiên cứu 10
2.3.1, Hóa €hấI eo osssss55sessessesesseesesresreo 10
2.3.2 Thiết bj sử dung trong nghiên cứa _— A
2.4, Phuong pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Viện Công nghệSinh học Lâm nghiệp "
3.4.3, Phương pháp tách chiết ADN tong số 12
2.4.3, Phương pháp định lượng ADN tổng số AS
2.4.4 Phuong pháp PCR với cặp mỗi đặc hiệu AB
Trang 52.4.5 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 1.0% H2.4.6 Phương pháp tình sạch sản phẩm PCR 152.4.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ADN ma
vạch Is
2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu : < 16Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN „173.1 Tach chiết ADN tổng số 17
3.2 Nhân bản đoạn trình tự ADN mã vạch trnH-psbA của loài Xá xi 193.3 Xác định trinh tự nucleotide các đoạn ADN mã vạch của loài Xá xi 21
54 mẫu Xá xi phục vụ đánh giá da dang di truyền 24KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ „32DANH MỤC CÔNG TRÌNH CUA TÁC GIÁ ĐÃ CÔNG BO LIÊNQUAN ĐỀN LUẬN VĂN 33TÀI LIEU THAM KHẢO 34
PHY LUC 38
Trang 6BANG DANH MỤC VIET TAT
“ chit | Nghia tiéng Anh Nghia tiếng Việtviết tắt
1 |ADN | Acid Deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic2 ARN | Acid Ribonucleic Axit ribonucleic —ˆ
3 lbp Base pair Cặpbasc
4 TCR Critically Endangered Loai cực kỳ nguy cấp.
Cetyl trimethylammonium | Cetyl— timethylammonium
5 {CTAB | bromide bromide
6 | Genbank | Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tếInternational Union for ñ
7 [IUCN | Conservation of Nature a jee tổn Thiên
and Natural Resources
ạ NCBI | National Center - for| Trung tâm Quốc gia về ThôngBiotechnology Information | tin Công nghệ sinh học
9 | PCR pobmerag Chân Í hin ứng chuỗi polymerase
10_|psbA-R | psbA Reverse primer |Mỗingược
II TTAE _| Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA12 TmmEE |nH- Forward Primer
Trang 7DANH MỤC CAC BANG
Bang 2.1 Thành phin và nồng độ các chất sử dung trong phản ứng PCR 13
Bảng 2.2 Trình tự và thông tin về cặp mỗi ` 13
Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mỗi #nH - psbA 4Bảng 3.1: Ham lượng va độ tinh sạch của 54 mẫu ADN tổng số được táchchiết từ lá loài Xá xị 18
Bảng 3.2: Các đoạn trình tự ADN mã vạch tmHepsbA của 54 cây trội Xá xi
dựa trên trình tự nucleotide fnH-psbA 30
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cành mang hoa và quả cây Xá xi ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc 3
Hình 2.1 Sơ đồ thi kế trong nghiên cứu ` in
Hình 3.1: PCR nhân bản đoạn trnH-psbA của 08 mẫu Xá xị tại Vườn quốc gia
‘Tam Đảo, tỉnh Vinh Phúc 20Hình 3.2: Cây quan hệ di truyền của 10 haplotype đựa trên trình tự nucleotidetrH-psbA 29
Trang 9MỞ DAU1 Đặt vấn đề
“Thiên nhiên nhiệt đới Việt Nam đã tạo ra hệ thực vật đa dang, đa lợiích Các nhà khoa học đã thông kê được 11.373 loài thuộc 2.524 chỉ, 378 họ.
trong 7 ngành thực vật khác nhau (Nguyễn Nghĩa Thin, 1997), Với hơn 19
triển của đất nước Trong tập đoàn các loài cây đá mục đích đã được địnhdanh ở Việt Nam, cây Xá xi (Cinnamomim parthenoxylum (Jack) Meisn.) là
loài cây có triển vọng đem lại giá trị kinh tế cao trong tương lai Cây Xá xị làmột loài cây quí, đa tác dụng và có nguồn gen hiểm được xếp trong nhóm A.
(Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ năm 2019) và nhóm CR cực kỳ
nguy cấp Day là loài cây có giá trị kinh tế, thân gỗ dùng cho chế biến các sanphẩm mỹ nghệ, gốc rễ dùng để sản xuất tỉnh dầu xá xị Do có giá trị kinh tế
cao nên hiện nay hoạt động khai thác trất phép loài cây này ở Việt Nam dang
trở thành điểm nóng (Le Trong Trai eLal 1999) Đặc biệt, vẫn đề tái sinh tựnhiên của Xá xj rit kém, số lượng cây ngoài tự nhiên ngày càng giãm nên vin48 bảo tồn loài này là rất cằn thiết (Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn, 2006).
ADN mã vạch là những đoạn ADN ngắn, nằm trong hệ gen (nhân, lụclap và ty thể) đặc trưng của mỗi loài sinh vật Trong số các chỉ thị ADN mãvạch được sử đụng để phân tích đa dạng di truyền thì chỉ thị rnH-psbA được.
cho là chỉ thị phân tử cổ độ chính xác cao trong việc đánh giá da dang di
truyền loài: Trình tự #aH-psbA là trình tự không mã hóa nên có sự biến đổigiữa các cá thể cùng loài cũng như biến đổi lớn giữa các loài (Kress and.Erickson, 2008) Xá xi mặc dù có giá trị kinh tế cao, nhưng những nghiên cứu.về tính đa dang di truyền của loài phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triểnnguồn gen ở Việt Nam là chưa có, Do vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đềtài “Đánh giá đa dang di truyền loài Xá xj (Cinnamomum parthenoxylon
ack) Meisn.) tại một số tỉnh miễn Bắc dựa trên tình tự trnH - psbA”.
Trang 102 Mục tiêu nghiên cứu
2,1 Mục tiêu tổng quát
Xác định được đoạn ADN mã vạch cho loài cây Xá xi (Cinnamomum
parthenoxylon (Jack) Meisn.) tại một số tỉnh miền Bắc góp phan xây dựng cơ sở.dữ liệu ADN mã vạch phục vụ cho việc đánh giá đa dang dị truyền loai cây này,
2.2 Mục tiêu cụ thể
- Tách chiết được ADN tổng số từ 54 mẫu Xá xi thu nhận được.
- Thực hiện được phản ứng PCR nhân bản trình tự /rnH- psbA ở 54
mẫu Xá xi nghiên cửu.
- Xác định được trình tự nucleitde của đoạn gen rrnH-psbA cho 54
mẫu Xá xi.
- Phân tích được sự đa dang di truyền của loài Xá xj tại một s
hh Phúc, Hòa Binh, Phú Thọ, Quảng
tỉnh miễn Bắc (Cụ thé là 5 tỉnh:
Ninh và Thanh Hóa).3 Nội dung nghiên cứu.
~ Tach chiết ADN tổng stừ lá của các mẫu Xá xi thu nhận được:
- Nhân bản và tỉnh sạch đoạn ADN mã vạch /rnH-psbA cho các
mẫu Xá xi;
~ Giải tình tự nucleotide của các đoạn rrni-psbA nhân bản thành công,
từ các mẫu Xá xi,
- Phân tích trình tự nucleotide đoạn ADN mã vạch /znH-psbA;
- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài Xá xi dựa trên
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Két quả nghiên cứu sẽ góp phẫn bộ sung co sở dữ liệu về di truyền chodanh lục các loài thực vật ở Việt Nam, góp phan cho công tác bao tổn nguồngen, làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài cây“Xá xj tại miễn bắc Việt Nam.
Trang 11Chương 1
TONG QUAN VAN DE NGHIÊN CUU1.1 Đặc điểm sinh học loài Xá Xi
Xá xi, lên khoa học là Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn Tên
gọi khác là Co chấu, Re đầu, Re hương, thuộc họ Re hay họ Long não
Xã xi là cây gỗ, kích thước trung bình hoặc lớn; thân hình trụ thing,cao 20 - 25 m, đường kính thân (40 - 70) em; rụng lá nhiều hay it; gốc câyphình to và đôi khi có bạnh gốc Vỏ ngoài màu nâu nâu xám đến xám đậm,
thường nứt dọc và bong ra từng mảng; thịt vỏ có mau nâu đỏ nhạt Cành nontròn, thô, có cạnh, màu lục xám Lá đơn nguyên, mọc cách: phiến lá hình
trứng hay hình bau dục thuôn; kích thước 5 - 15 x 2,5 - 8em; đầu có mũinhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng: hai mặt nhẫn; gân bên 3 - 8 đôi;
cuống lá dai 1,2 - 3em Cụm hoa dạng chuỷ hay tán; mọc ở đầu cành hay nách
14; mỗi cụm mang khoảng 10 hoa Hoa lưỡng tính; bao hoa 6 thuỳ, màu trắngvàng; nhị 9, bao phấn 4 6, chi nhị có lông, 3 nhị vòng trong có 2 tuyến mật;
| đường kính 0,6 - Lem; đifm den (Hình 1.1).nhị lép 3 Quả mong, hình
răng, khi chín mẫu xanh vàng hoặc.
(Phùng Văn Phé, 2019)
xj ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc
Hình 1.1 Cành mang hoa và qua cây.
Trang 12én dạng, khong
Lá dùng làm thuế
Xá xi cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khô ít bị nút nẻ hay bị
bị mối mọt, chịu nước,gia công chế biế máu,chữa đau da dày, phong thấp, mẫn ngửa ngoài da Quả được dùng chữa cảm,sốt, ly, ho gà Tinh dầu Xá xj được. ir dung rộng rai trong công nghệ hoá mỹphẩm, thực phẩm và dược phẩm, do đó có giá trị thương mại rat lớn trê
2003; Phạm Hoàng Hộ, 1999).
Phân bố tự nhiên trong rừng mưa nhiệt đới, thường ở độ cao 300
-thị trường thé giới (Nguyễn Tién Bai
900m, cây ưa sống trên đất có ting dày, độ phì cao, tơi xốp, 4m, thoát nướctốt và ở những nơi khuất gió Cây tra sáng, sinh trưởng tốt trong những rừng.có mật độ trung bình Có thể tái sinh bằng hạt hoặc chdi, tái sinh chdi mạnh.Ở Việt Nam cây phân bố ở một số như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình, Thái Nguyên, ThanhHóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, QuangNam, Bình Thuận, Lâm Đồng,
1.2 Tổng quan về ADN mã vạch (ADN barcodes)1.2.1 Giới thiệu về ADN mã vạch:
ông Nai, Bình Phước.
Nam 2003, Paul Heber - nhà nghiên cứ tại Đại học Guelph, Ontario Linđầu tiên đưa ra thuật ngữ *ADN mã vạch” ADN mã vạch sử dụng một trình tựADN ngắn nằm trong geneome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất
giúp phân biệt hai loại sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quet trong siêu
thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài của chúng rất giống.
nhau nhưng thực sự là khác nhau Như vậy mã vạch ADN là một phương pháp
định danh mà nó sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn nằm trong bộ genomecủa sinh vật dang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc loại nào.
‘Theo Taberlet P và cộng sự (2007), ệ thống mã vạch ADN lý tưởng
phải dap ứng các yêu cầu sau đây:
+ Thứ nhất, đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt
trong cùng loài.
Trang 13+ Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải được chuẩn hóa, với
cùng một vùng ADN có thể được sử dụng cho nhóm phân loại khác nhau.
+ Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để cóthé dé đàng định danh loài vào các nhóm phân loại (ch, ho )
+ Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mỗi
nhân gen có độ bảo thủ cao, dễtrình tự ADN,
àng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc
* Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản
ADN không bị sai lệch Thông thường, đoạn ADN nghiên cứu có kích thước
150bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản ADN.Đặc điểm quan trọng nhất của ADN mã vạch là phái phổ biển và đặchiệu trong các biển dị và đễ dang sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn genđược sử dụng như một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại cósự biến đổi giữa các loài nhưng én định và bảo thủ cao bên trong loài hoặcbiến đổi không đáng kể Do đó, ADN mã vạch lý tưởng là một đoạn ADN cótrình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mỗi được thiết kế đặc hiệu dé
đới tại Queensland, Uc và kết luận rằng ADN mã vạch là một trợ giúp đáng kểtrong đánh giá đa dạng sinh học và xác định các quần thể yy ngay cả khí
chúng không thể phân biệt được tắt cả các loài trong lô (Costion et al., 2011).
Trang 141.2.2 Giới thiệu về chỉ thị trnH-psbA và ứng dụng của chỉ thị trnH-psbA
Đoạn trình tự œnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp,
có khả
nhưng thay đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là
năng xác định loài cao Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ởnhiều thực vật hạt kín và hạt ‘Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kíntrnH-psbA lại có kích thước rit ngắn (~ 300 bp), kích thước của trinh tự nàythay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa vùng gencủa hai gen tH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã để xuất việc sửdụng trnFL-psbA như chỉ thị mà vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với‘matK CBOL (Consortium for the Bareode of Life) thấy ring khả năng phânbiệt loài của rrnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm.
IsbA có thể
va do đó đề nghị nó như là chỉ thị ma vạch bo sung Chỉ thị znH:
sử dụng trong hệ thống mã vạch ba locus khi hệ thống mã vạch hai locus
không cung cấp diy đủ khả năng phân tích (Kress W J và cs, 2008; VijayanK và Tsou C H 2010),
Vùng gen trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất
(100%) va tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả
ITS, rbeL và matK Vì vậy, truH-psbA được coi như một trình tự hữu ích để
phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo Trình tự này được ding dé phânbiệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.) Lindl Ex Hook.f.(Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw với tỷ lệ sai khác trong
trình tự là từ 2% đến 3,1%.
1.3.Nghiên cứu về đa dang di truyền của các loài thuộc chỉ Cinnamomum
Long não (Cinnamomum) là một chỉ lớn trong họ Long não
(Lauraceae), gồm tối 250 loài phân bổ từ đại lục châu A đến khắp vùng ĐôngNam Á, Australia và khu vực Tây Thái bình dương Tại miền Nam châu Mỹ.chỉ có một số ít loài, nhưng riêng khu vue Malesian đã phát hiện được khoảng
90 loài Đến nay chỉ có khoảng 150 loài đã được nghiên cứu ở những chừng
Trang 15mực nhất định từng khía cạnh khác nhau Xá xi (Cinamomumparthenoxylon (Jack) Meisn.) là một loài thuộc chi Long não (Ciamamomum).
phân hang DD (Data Deficient, ver 2.3) Ở Trung Quốc, Xá xj đã được mô tả
chỉ đặc điểm hình thái Các nghiên cứu s loài Xá xị chưa được.‘quan tâm nhiễu.
Trên đối tượng các loài thuộc họ Long Não (Lauraceae), nhóm nghiêncứu của Liu (Liu và es, 2016) đã sử dụng 04 trình tự ADN mã vạch là marK,zbcL, trnH-psbA và ITS2 đề đánh giá hiệu quả phân biệt loài Kết quả cho
não Trình tự ømarK và rbcLL có tý lệ định danh loài thành công lần lượt là
30.9% và 25.0%, Trong khi đó trình tự zrnH-psbA có khả năng xác định loài
với tỷ lệ đạt 84.0% ở cấp loài đối với 175 mẫu từ 117 loài huộc 35 chỉtrong họ Lauraceae Nghiên cứu cũng cho thấy việ sử dụng chỉ thị /nI-psbA có hiệu quả xác định loài trong họ Long não cao hơn hin các chỉ thị‘matK, rbcLL, hay sự kết hợp của cả matK và rbeL.
V P Swetha và cộng sự (2014) áp dụng phương pháp mã vạch ADN
48 phát hiện những chất tạp nhiễm là một loại gia vị có giá trị cao, thường bipha trộn với các loài kếm chất lượng như Cinnamomwm cassia và
Cinnamomum malabatrum, Họ sử dụng các locus mã vạch rbcL, matK vàpsbA-trnH dé đánh gi
verum tir các chất tạp nhiễm liên quan của nó Khả năng khuếch đại và giải
iém năng của từng locus mã vạch để xác thực C.
trình tự thành công là 100% đối với rbcL và psbA-trnH trong khi marK không
thể khuếch đại trong các mẫu thị trường do đó xác nhận sự hiện diện của tapnhiễm C> cassia trong các mẫu thương mại của qué thật Trong số ba locus,locus rbcL tỏ ra hiệu quả trong việc tìm ra những chất tạp nhiễm trong qué
được buôn bán Các vị trí da hình nucleotide đơn trong vùng này có thé được
khai thác trong việc thiết kế các mỗi đặc hiệu cho C cassia, cho phép phát
Trang 16triển bộ kit dé dé dàng phát hiện các chất tạp nhiễm ở chính cắp độ vùng bang
do đó bỏ qua chi phí giải trình tự.
Sudmoon và cộng sự (2014) đã sử dụng các vùng ;poB, rbcLL và matKđể xác định bảy loài đã biết là Cinnamomum aromaum (dầu cassia), C.
camphora (dầu cây xá xj và lá ho), C bejolghota, C tamala, C; zeylanicum
(C verum) và C, burmannii và bày loài chưa biết là các loài quế (họ long.
não) Nghiên cứu này nhằm điều tra sự da dang về loài của Cinnamomumđược sử dụng trong các loại thuốc truyền thống, chất tạo hương cho thựcphẩm và chưng cất dé lấy dầu thơm ở Thái Lan bằng kỹ thuật RAPD Họ đãthành công trong việc phân biệt rõ rang các loài có giá trị tương đồng về ditruyền nằm trong khoảng từ 0,56 đến 0.84 để hiển thị ic ký tự lá khác nhau.
So sánh với một số trình ty từ Ngân hàng gen, khoảng cách di truyền ở các
vùng gen marK, zbeL và rpøB lần lượt là 0,00 đến 0,52, 0,00 đến 0.36 và 0,00
cđến 0,30, Nhưng ba vùng zpøB, rbcL và marK không thể được sử dụng để xác
định nhóm loài Cinnamomum vì không có sự khác biệt về trình tự giữa nhiềuloài khác nhau.
Tác giả Rohwer J G và cộng sự (2019) đã nghiên cứu v sự không
phù hợp của các quyét định hình thái và tình tự ADN fi vạch, một nghiên
cứu trường hợp ở Cinnamorium (chỉ Long não) Trong quá trình nghiên cứu.
hệ thống phân tử của Lauraceae, tác giả đã nhận được một mẫu của một câytrồng dưới cái tên Cinnamomum porrectum trong Vườn thực vật Mũnchen-
Nymphenburg Xác định sơ bộ, cả về hình thái dựa trên hệ thực vat Trung
Quốc (Lá & al, 2008) và theo trình tự lục lap (psbA -tmHsph TELS) bao gầm gen matK, éraL intron, tmL - tmF spacer
và rriQ=rps16-spacer) thu được bởi giải trình tự Sanger cho rằng đó là
loài C camphora, cây vẫn trong khác với các cá thể khác của C camphorađược trồng trong các vườn thực vật của Berlin, Hamburg, Mainz, Munich và
Oldenburg Tác giả đã sử dụng phương pháp giải trình tự Illumina trên một
Trang 17tập hợp các dấu phân tử được khuếch đại trước (/7S,trnK 3 và 5*
-intron, /rnL - intron va intergenic bộ đệm psbA-trnH, trnLL - trnF, cũng nhưcác bộ phận của bộ dém trnQ- rps16) và dựa trên các trình tự có
C.camphora và C parthenoxylon từ GenBank dé sơ sánh Sự khác biệt đángtrong số những trình ty nay, nhưng các nhóm haplotypekhông trùng với các định danh loài hiện ta.
Kết hợp chi thị EST-SSR và cpADN loài € chago tại tỉnh Vân Nam,‘Trung Quốc cho thấy 5 quần thé nghiên cứu có mức đa dạng di truyền thị
nhưng sự khắc bi
(Zhang et al., 2021).
di truyền đáng kể giữa các quần thể được phát hiện
Hiện nay, hệ thống ADN mã vạch cho thực vật chưa hoàn chỉnh Tuy
nhiên, với trình tự ADN mã vạch này, các nhà khoa học đã có những nghiên
cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn €ho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng.
mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học.
‘Theo tìm hiểu tại Việt Nam hiện nay chưa thấy các nghiên cứu về ADNmã vạch đối với loài Xá xị nhưng đã có một số công trình nghiên cứu ứng.
dụng ADN mã vạch trong định danh loài động và thực vật Tuy nhiên, các
nghiên cứu này chỉ thực hiện trên một vài đối tượng sinh vật, chưa có tỉnh hệ
thống, đồng bộ nên chưa thé xây dựng được cơ sở dữ liệu về ADN mã vạch.
Trang 18Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUtựa chọn mẫu và cách lẤy mẫu.
Lá của các cây Xá xị được thu thập từ các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ,
Hoa Bình, Quảng Ninh và Thanh Hóa, cụ thẻ như sau:+ Vĩnh Phúc: Vườn Quốc gia Tam đảo;
+ Phú Thọ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn - Phú Thọ;
+ Hòa Bình: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Hang Kia - P¿“Thiên nhiên Thượng Tiền, Khu Bảo tồn Thiên nhiên Phu Canh;
+ Quảng Ninh: Rừng Quốc gia Yên Tử;
+ Thanh Hóa: Khu Bảo tổn Thiên nhiên Xuân Liên và Khu Bảo tồn loàihat trin quý hiểm Pha Phanh.
lá được bảo quản trong tử lạnh -20°C cho đến khi được xử dụng để tách
chiết ADN tổng số.
2.2 Địa điểm thực hiện nghiên cứu.
Phòng thí nghiệm Công nghệ gen của Viện Công nghệ Sinh học Lâmnghiệp, trường Dai học Lâm Nghiệp (từ 01/10/2021 đến 30/8/2022)
2.3 Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.2.3.1 Hóa chất
- Hóa chất sử dụng dé tách chiết ADN: Nito long, bộ Kit tách chiếtADN tổng số *ADN minni plant Qiagen” của Dit
- Hóa chất dùng cho điện gi gel agarose: đệm TAE IX, agarose,
Loading dye, Thuốc nhuộm RedSafe, ADN marker 100 bp.
~ Hóa chất PCR: H;O deion, Master Mix PCR, các cặp mỗi Primer (môi.xuôi, mỗi ngược).
Trang 19- Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR: Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tinh
sach sản phẩm PCR của InTRON - Han Quốc.
2.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Các trang thiết bị và dụng cụ thí jghigm gồm: Cân phân tích, Máyquang phổ định lượng ADN Scan Drop 250, Máy chụp ảnh gel (Gel Doc It,
Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Bé ôn nhiệt, Máy lắc
VELP (Scientifica, Đức), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh âm sâu 30°C (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4°C (FRIMED, Nhật Bản) Máy PCR(Prime 1
-tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức).
ermal Cycler, Anh), 1 an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li
2.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thi nghiệm cia Viện Côngnghệ Sinh học Lâm nghiệp
2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu.
Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đỗ Hình 2.1.
Trang 202.4.2 Phương pháp tách chiết ADN tong
a Jing bộ Kit tách chiết ADN tổng s
mini kit Qiagen” của Đức được thu nhận như sauQuy trình thủy phân
1 Nghĩ
“Thêm 400 gi Buffer API và 4l ARNse A.
2 Ủ 65°C trong 10 phút, đảo mẫu 3 - 4 lần trong quá tình ủ.
Quy trình tách chiết tổng số ADN
< 20 mg lá bằng nito lỏng cho vào ống eppendorf 1,5 ml
3 Bổ sung 130 pil Buffer P3, trộn bằng vortex và ủ đá trong 5 phút,.đem ly tâm 5 phút, 1300 vongip.
4 Hút dich nổi chuyển sang QIAshredden, sau đó dem ly tâm 2 phút ở
khi hết dich chiết AWD).
3 Giữ lại cột ly tâm, loại bỏ dịch trong ng thu.# Rữacột
9 Đặt cột ly tâm vào ống thu eppendorf 2ml mới.
10.T m 5001 Buffer AW2 Dé 1 phút ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành
11, Lap lại bước trên bổ sung thêm 500ul Buffer AW2, ly tâm 2phút ở 13000 vòng.
12 Chuyển cột sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml mới.
13 Bỏ sung thêm 50 il Buffer AE hoặc H;O deion để rửa giải Để ủ 5phút ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành ly tâm 1 phút ở 13.000 vòng.
14 Lặp lại bước trên 1 lần nữa.
Trang 213.4.3 Phương pháp định lượng ADN tổng số
Bảo quản ADN: ADN được bao quản ở - 4°C.
Dinh lượng nồng độ ADN va độ tỉnh sạch bằng cách đo chi số ODzas„,(ty lệ hap thụ quang của ADN ở bước sóng 260 nm so với độ hap thụ quang.
tại bước sóng 280 nm) trên máy quang phé định lượng ADN Sean Drop 250.
Mỗi mẫu ADN tổng số được do 03 lần và lấy giá trị trang bình của 03 lần đo.Nông độ ADN thu được càng cao va giá trị OD¿zøzxu nằm trong khoảng 1,8 —2,0 được coi là ADN tách chiết có độ tinh sạch cao Và dựa vào phương pháp.
điện di trên gel agarose 1,0%.
2.4.4 Phương pháp PCR với cặp méi đặc hiệu2.44.1 Trình tự mỗi
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như trong bảng 2.1,
xử dụng các cặp mỗi như trong bảng 2.2
Bang 2.1 Thành phần và nằng độ các chat sử dụng trong phản ứng PCRSTT Thanh phần Thể tích.
1 PCR Master mix 2X 10,
2 1,0 deion Tul3 Môi xuôi (Primer F) 10uM Int4 Môi ngược (Primer R) 10M nl
5 ADN khuôn 50-100ng lại
“Tông thể tích 2001Bang 2.2 Trình tự và thông tin về cặp mỗi
Gene Môi xuôi Mỗi ngược Mà lại Tham
ng HIẾP psbA: Sang et
ya |COCGCATGGTG | GTTATGCATGA | 51 450 |al,PAO |GATTCACAATCC | ACGTAATGCTC 1997
Trang 222.4.4.2 Nhân dàng đoạn gen dich bằng kỹ thuật PCR
Bang 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mỗi tral - psbACác bước Số chukì | Nhiệtđộ'C | ThờigianKhởi động 1 9st 5 phút“Tách mạch 95" | 30 siay
Gan mỗi 35 JS | — 30giâyKéo dài 72 45 giâyÔn định 1 72 7 phút
Bảo quản 1 4 Coo ey
2.4.5 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 1,0%
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính cầu trúc của nucleic acid là đại phân tử.tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của dòng điệnmột chiều trong dung dịch đệm dẫn điện chúng sẽ di chuyển từ cực âm sangcực dương Tốc độ di chuyển của các phần tử ADN trong dòng điện phụ
thuộc vào khối lượng, kích thước, cấu trúc của chúng Các phân tử có khốilượng và kích thước nhỏ sẽ đi chuyển nhanh hơn về cực dương Do đó, dựavào vị trí các phân đoạn ADN thu được trên bản gel sau khi điện dĩ có thể xácđịnh cũng như so sánh được kích thước của chúng với các thang ADN chuẩn
(ADN marker),
Sản phẩm phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel
1.0% trong đệm TAE ở hiệu điện thé 80V,
Trang 23Lấy 10u1 ở mỗi mẫu ADN đã được tách chiết và trộn với ]ul Loading
dye trên bề mặt giấy Parafilm Cho e: thận hỗn hợp trên vào giếng điện di
bằng pipet Ghi chép lại thứ tự các mẫu ADN vào giếng, chạy điện di ở 80V.trong vòng 45 phút Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu.
ép dưới dén UV,San khi điện di xong, lấy bảng gel từ bê s ï trực
Bước 3: Loại bo dich.
Bước 4: BO sung them 7501 Washing Buffer Ly tâm 11000 vòngtrong 30 giây, sau đó loại bỏ dịch.
Bước 5: Ly tâm thêm 3 phút ở 13000 ving, dé làm khô cộtBước 6: Đặt cộ
vào ống 1,5ml mới.
7: Thêm 40u1 dung địch HO deion vào cột spin, để ở nhiệt độphòng trong 1 phút.
Bước 8: Ly tâm 14000 vòng trong 1 phút
Bước 9: Thu được ADN tinh sạch và bảo quản ở -20°C.
24.7 Phương pháp xác định trình tw nucleotide của đoạn gen ADN mã vạch
Sản phẩm PCR sau khi tỉnh sạch và kiểm tra nồng độ được đóng góitrong dng eppendorf 1,5 ml, thé tích khoảng 15 pL gửi đến Công ty First Base
Trang 24inh tự ADN sau khi gi trình tự được hiệu chỉnh và loại bỏ các tín
hiệu nhiễu với sự try giúp của các phần mềm tin sinh chuyên dụng như.BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), Mega7 (Kumar ot al, 2015) và các công cụ hỗ trợ
online trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Kết quả giải trình tự sau khi nhận được hiển thị thông qua phần mềm.qua đó xác định được kiểu gen của mẫu nghiên cứu (Hình 2.2),
Cách đọc kết quả: 04 nucleotide được thể hiện bằng 04 màu khác nhau
(G: miu đen, T: màu đỏ, C: màu xanh đương, A: mầu xanh lá cây)
19 " v0 m F1TCCCEGAGAGC GACGCCEZECAACACGACAGCACECGAGTTGAGT
lên thị kết qua
Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên phương pháp maximum
trình tự qua phần mềm BioEditlikelihood với giá trị bootstrap 1000 trên phần mềm Mega7 Chỉ số đa dạng.
haplotype (Hd) và đa dạng nucleotide (pi) được xác định bằng phần mmDNAsp 6.0 (Librado và Rozas, 2009),
Trang 25Chương 3
KET QUA VÀ THẢO LUẬN.3.1 Tach chiết ADN tổng số.
ADN tổng số có ảnh hưởng rit lớn và quyết định cho sự thành công của.
phản ứng PCR trong thí nghiệm Tách chiết ADN tổng số nhằm mục đích thu.nhận ADN ra khỏi cấu trúc tế bào Điều quan trọng nhất là thu nhận được.ADN ở trạng thái còn nguyên vẹn không bị phân húy và không lẫn nhiều tạp.chất để có nguồn nguyên liệu chất lượng tốt Lựa chọn được phương pháptách chiết ADN hiệu quả là bước rất quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến các
phân tích di truyền tiếp theo.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit tách chiết ADN thực.
vật của Qiagen-Đức để tách chiết ADN tông số từ 54 mẫu lá Xá xị, sử dụng.
loại lá bánh tế của các cây trội Xá xi thu thập được từ các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú.
“Thọ, Hòa Bình, Quảng Ninh và Thanh Hóa Kết quả tách chiết ADN tổng sốđược đo trên máy Sean Drop 250 với nông độ thấp (dao động từ 12,4 đến 35,8ng/ pl) và độ tình sạch cũng không được tốt như mong đợi (tỉ số
©D260/OD280 chỉ đạt từ 1,23 - 1,69) Với kết quả tách chiết ADN tổng số
này chúng tôi tiếp tục kiểm tra thông qua phan ứng PCR sứ dụng cặp mỗimaiK_E/R (đây là cặp môi pho quát nên có khả năng nhân bản ở hau hết cácloài thực vat) thì tắt cả các mẫu ADN tong số đều xuất hiện sản phẩm PCR
đặc hiệu với kích thước khoảng 850bp Đoạn gen nhân bản thể hiện trên gel
agarose 1,0% là một bảng rõ, sắc nét và không có sản phim phụ Tir kết qua
thứ nghiệm PCR n: chúng tôi khẳng định đã tách chiết được ADN tổng số
từ các mẫu lš Xã xj sử dụng bộ kit tích chiết ADN thực vật của Qïagen- Đức.Kết quả thu được như bảng 3.1
Trang 2615 PTH 7 169 35816 HBXa05 | 126 324
"7 HBXa07 134 155
18 | qạypjyy | HBXa09 131 23319 HBXaI0 | 123 265
20 HBXaIL 130 280
a) HBXaI3 148 322
22 HòaBinh ` Tipxaia 1.54 216By HBXal5 147 250
El HBXal7 1,62 316
25 | QNXa02 | 152 15326 QNXa03 134 22327 | Quảng Ninh | QNXa06, 145 20828 QNXa08 128 195
29 QNXa09 1.67 313
Trang 27Địa điểm lấn H Độ tỉnh sạch của ADN | Hàm lì
STT| PPệu | Mẫu | 3n ADN (ngụ
30 QNXal0 1,25 17431 QNXaI2 156 | 2603 QNXal3 | 144 — “31533 QNXald 147 19.734 QNXal5 138 22635 QNXaI6 1,52 21546 THOL 136 124
45 137 313
46 142 35,247 1,57 258
s THa9 145 216
3.2 Nhân bản đoạn trình tự ADN mã vạch trnH-psbA của loài Xá xị
ADN tông số tách chiết từ các mẫu lá của cây Xá xi được sử dụng làm.khuôn dé nhân bản đoạn gen trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR với cặp mỗi đặc.hiệu tương ứng Sản phim PCR của từng mẫu đối với từng cặp mỗi sẽ được.kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,0 %.
